一、外周血中可溶型P选择素的ELISA检测（论文文献综述）
卓拉[1]（2021）在《影响脑梗死急性期外周血中性粒细胞数量和状态的相关因素分析》文中指出目的:探讨脑梗死急性期外周血中性粒细胞绝对值（NE#）、中性粒细胞与淋巴细胞比值（NLR）以及中性粒细胞表面标志物（CD16、CD66b和Annexin V）随时间变化的规律,并分析讨论中性粒细胞数量和状态与促炎症消散因子（Annexin A1）以及各项临床参数间潜在联系。方法:收集2020年7月到12月间在吉林大学第一医院神经内科住院发病72h内,无明显感染或严重心、肺合并症的急性动脉硬化性脑梗死（AIS）患者31例。同期招募21例年龄、性别匹配,无明确炎症相关疾病的非脑梗死成人作为对照组。记录患者一般临床资料,收集入院后1d NIHSS评分,入组时距发病的时间,及脑血管病相关危险因素,包括:是否有高血压病、糖尿病、血脂异常等既往病史,是否存在既往卒中史和相关治疗史,是否存在吸烟史,入院后检测的血清低密度脂蛋白胆固醇、总胆固醇、糖化血红蛋白、尿酸、同型半胱氨酸、C反应蛋白、叶酸和维生素B12等临床参数,入院后1d及8d血常规结果以及脑梗死相关影像学资料。采集患者入院后1d、2d和8d时清晨空腹外周血和对照组空腹外周血样本。利用流式细胞技术分析中性粒细胞表面标志物CD16、CD66b和Annexin V表达量（MFI）,酶联免疫吸附法检测血浆中促消散因子Annexin A1水平。观察AIS组外周血中性粒细胞绝对值（NE#）、中性粒细胞与淋巴细胞比值（NLR）以及中性粒细胞表面标志物（CD16、CD66b和Annexin V）随时间变化规律,并分析上述指标与血浆Annexin A1水平以及患者各项临床参数之间的相关性。Flowjo V10软件用于流式细胞学检测结果分析,SPSS Statistics 22.0软件进行统计分析,Graphpad Prism 7和Inkscape 0.92.3软件用于图表制作。结果:（1）AIS组患者入院后1d时,外周血NE#较对照组略高（P>0.05）,NLR较对照组显着升高（P<0.05）。入院后8d时,NE#与NLR均已回落至基线水平,与对照组无显着差异（P>0.05）。NE#和NLR与患者性别、年龄、既往史、发病部位、入院时NHISS评分、入组时距发病的时间、血清低密度脂蛋白胆固醇、总胆固醇、糖化血红蛋白、尿酸、同型半胱氨酸、C反应蛋白、叶酸和维生素B12等临床参数均不相关（P>0.05）。（2）AIS患者入院后1d和2d时,外周血中性粒细胞活化状态（CD16 MFI）较对照组显着升高（P<0.05）。入院后8d时,其活化状态已回落至基线水平,与对照组无显着差异（P>0.05）。此外,尽管患者各时间点时的中性粒细胞活化状态与各项临床参数间均无显着相关性（P>0.05）。但入院后1d时,既往患糖尿病的患者中性粒细胞活化状态略高于无糖尿病既往史患者（P=0.084）;2d时其活化状态与血清尿酸水平呈负相关性趋势（R=-0.324,P=0.086）,与血清糖化血红蛋白水平呈正相关性趋势（R=0.323,P=0.088）;8d时既往患高血压病的患者中性粒细胞活化状态略高于无高血压病既往史患者（P=0.084）,均暂无统计学意义。（3）AIS患者入院后1d、2d和8d时外周血中性粒细胞粘附作用（CD66b MFI）较对照组显着升高（P<0.05）,且不同时间之间无显着差异（P>0.05）。此外,尽管各时间点中性粒细胞粘附作用与各项临床资料间均无显着相关性（P>0.05）,但入院后2d时其粘附作用与血清尿酸水平呈负相关性趋势（R=-0.331,P=0.097）,暂无统计学意义。（4）AIS患者入院后1d、2d和8d时外周血中性粒细胞凋亡程度（Annexin V MFI）明显高于照组（P<0.05）。入院后1d和2d时凋亡程度较高,而8d时的凋亡程度较前显着下降（P<0.05）。除入院后2d时AIS患者中性粒细胞凋亡程度与血清尿酸水平呈显着负相关（R=-0.443,P=0.016）外,与其余临床参数间均无显着相关性（P>0.05）。但其中与血清糖化血红蛋白水平呈现正相关性趋势（R=0.325,P=0.086）,暂无统计学意义。（5）AIS患者入院后1d和2d时血浆内Annexin A1水平明显高于对照组（P<0.05）,其中1d时Annexin A1水平略高于2d（无统计学差异,P=0.732）。入院后8d时,Annexin A1水平已回落至基线水平,与对照组无显着差异（P>0.05）。此外,患者入院后1d时Annexin A1水平与2d时Annexin V MFI呈显着正相关（R=0.47,P=0.049）。各时间点的Annexin A1水平与其余各项临床参数间均无显着相关性（P>0.05）。但其中,入院后8d时Annexin A1分别与1d时CD16和Annexin V MFI呈负相关性趋势（无统计学意义,RCD16=-0.42,PCD16=0.09,RAnnexin V=-0.45,PAnnexin V=0.08）。结论:（1）AIS发病早期外周血中性粒细胞数量略升高,而活化状态迅速显着升高,随后逐渐下降。中性粒细胞粘附状态和凋亡程度同样在AIS发病早期显着升高后逐渐下降,但下降速度略慢。（2）AIS发病早期外周血Annexin A1有助于促进中性粒细胞凋亡的启动,从而促进炎症反应及时向消散方向转归。（3）高血压可能引起外周血中性粒细胞活化持续迁延,从而导致炎症反应无法及时向消散方向转归。（4）AIS发病时较高的血清尿酸水平可能引起外周血中性粒细胞凋亡程度减少。
许梦梦[2]（2020）在《IncRNA在大气颗粒物致儿童血管内皮功能障碍中的标志物研究》文中研究说明目的大气颗粒物污染已成为一个全球性的环境危险因素。PM2.5由于粒径小、比表面积大,表面易附着有机化学物质,危害更大。心血管疾病（CVD）是颗粒物污染造成的最高发病率和死亡率的疾病之一。内皮功能障碍是大多数CVD的早期事件和独立预测因子。儿童的部分器官系统尚在发育阶段,对大气颗粒物更为敏感。内皮功能障碍是大气颗粒物致心血管系统损伤的早期机制之一。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）是一种可促进内皮细胞（EC）增殖和迁移、增加血管通透性和抑制新生血管EC凋亡的可溶性蛋白。内皮素-1（endothelin-1,ET-1）是一种由EC合成和分泌的活性多肽,具有收缩血管、促进血管平滑肌细胞增殖等作用。细胞间粘附分子1（intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1）、L选择素（L-selectin）和P选择素（P-selectin）等,可促进血小板的活化和单核细胞与EC粘附,从而导致炎症性疾病。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）可在基因转录、转录后等多水平调控基因表达,影响疾病的发生和发展。已有研究证明lncRNA与EC功能改变密切相关。但目前关于大气颗粒物致儿童lncRNA表达改变的研究相对较少。因此,我们招募大气颗粒物暴露儿童为研究对象,观察血管内皮损伤的相关生物标志物,阐述大气颗粒物对儿童心血管损伤的早期作用,分析大气颗粒物对儿童外周血白细胞MALAT1、GAS5、LINC00341和HOTAIR等lncRNA的影响,以及lncRNA与内皮标志物的相关性,探讨lncRNA在大气颗粒物致儿童血管内皮功能障碍中的作用。方法采用横断面调查设计,选取济南不同污染水平的两个区域分别作为污染区和对照区。在污染区和对照区各选择一所中学,采用随机整群抽样选择调查对象,分别作为暴露组和对照组。我们共招募273名学龄儿童,其中暴露组163名,对照组1 10名。收集研究期间全年两个地区空气污染物监测数据,包括细颗粒物（fine particulate matter,PM2.5）、可吸入颗粒物（inhalable particulate matter,PM10）、NO2、CO的24小时平均浓度。采用电感耦合等离子体质谱（inductively coupled plasma-mass spectrometry,ICP-MS）法检测尿中金属水平,多重液相蛋白定量技术检测血清中VEGF水平,酶联免疫吸附法检测血清中ET-1水平,实时荧光定量 PCR（real-time quantitative PCR,RT-qPCR）法检测儿童外周血白细胞中 ICAM-1、L-selectin 和 P-selectin mRNA 及 lncRNA MALAT1、GAS5、LINC00341、HOTAIR表达水平。结果1.大气颗粒物致儿童内皮损伤标志物的改变（1）环境监测数据暴露组全年PM2.5、PM10浓度显着高于对照组（P<0.01）。（2）尿中金属水平暴露组儿童尿中砷、钡元素水平显着高于对照组（P<0.05）,但铜、锰、铬元素水平低于对照组（P<0.05）。（3）两组儿童HR、WBC和hs-CRP水平对照组儿童的心率（HR）高于暴露组,差异有统计学意义（P<0.01）;两组儿童的白细胞计数（WBC）和超敏C反应蛋白（hs-CRP）无显着差异（P=0.52和P=0.31）。（4）血清VEGF、ET-1水平在校正年龄、性别、BMI、尿中可替宁水平和血清肌酐后发现,暴露组儿童血清VEGF水平高于对照组,且差异有统计学意义（P<0.01）;没有发现两组儿童血清ET-1水平的差异（P=0.39）。（5）外周血白细胞中 ICAM-1、L-selectin 和 P-selectin mRNA 水平在校正年龄、性别、BMI、尿可替宁水平和ln（WBC）后,暴露组儿童外周血白细胞中ICAM-1、L-selectin和P-selectin mRNA表达水平均低于对照组,且有统计学差异（P<0.01、P<0.01和P=0.02）。（6）内皮标志物与尿金属水平的相关性分析在全人群中,尿中铜、镍、铬元素与血清VEGF水平呈显着负相关关系（相关系数r分别为-0.15、-0.18和-0.18）,砷元素与血清VEGF呈正相关关系（r=0.13,P=0.04）,镍元素与血清ET-1呈负相关关系（相关系数r=-0.18,P<0.01）,砷、钡元素与白细胞中ICAM-1呈显着负相关（相关系数r分别为-0.24和-0.15）,铬元素与ICAM-1呈正相关关系（r=0.29,P<0.01）,铬元素与白细胞中L-selectin呈正相关关系（r=0.19,P<0.01）。2.大气颗粒物致儿童外周血白细胞中lncRNA的改变（1）外周血白细胞中lncRNA水平大气颗粒物暴露组儿童白细胞中MALAT1、GAS5和LINC00341水平分别较对照组下降32%、16%和12%,且均有统计学差异（P<0.05）。没有发现两组儿童白细胞中HOTAIR表达水平的统计学差异（P=0.26）。对性别、BMI和尿可替宁浓度分层分析发现,在男孩、BMI正常和尿可替宁浓度<0.02 μg/mL儿童中,暴露组儿童白细胞中MALAT1水平显着低于对照组（P<0.01）;在男孩中,暴露组儿童白细胞中GAS5水平低于对照组,且有显着差异（P=0.02）;在尿可替宁浓度>0.02 μg/mL儿童中,暴露组儿童白细胞中LINC00341水平低于对照组,且差异有显着性（P<0.01）。（2）lncRNA与尿金属元素水平的相关性分析在全人群中,尿中铬元素水平与MALAT1、GAS5和LINC00341水平呈显着正相关（相关系数r分别为0.15、0.21和0.13）,铁元素水平与GAS5呈显着负相关（r=-0.13,P=0.04）,铜元素水平与HOTAIR水平呈显着负相关（r=-0.13,P=0.04）。（3）血清VEGF与lncRNA的相关性分析在全人群、超重和尿可替宁浓度<0.02μg/mL儿童中,血清VEGF与LINC00341呈显着负相关（相关系数r分别为-0.13、-0.27和-0.18）;在超重儿童中,血清VEGF与HOTAIR呈显着正相关（r=0.25,P=0.04）。（4）血清ET-1与lncRNA的相关性分析在全人群、暴露组和男孩儿童中,血清ET-1与MALAT1呈显着负相关（相关系数r分别为-0.15、-0.21和-0.18）;在全人群、暴露组、男孩、BMI正常和尿可替宁浓度≥0.02μg/mL儿童中,血清ET-1与GAS5呈显着负相关（相关系数r分别为-0.18、-0.25、-0.22、-0.16 和-0.34）。（5）粘附因子mRNA与lncRNA的相关性分析在全人群中,ICAM-1 与 MALAT1、GAS5、LINC00341 和 HOTAIR 呈显着正相关（相关系数 r 分别为 0.29、0.32、0.23 和 0.12）;L-selectin 与 MALAT1、GAS5、LINC00341呈显着正相关（相关系数r分别为0.51、0.69和0.50）,与HOTAIR呈显着负相关（r=-0.17）;P-selectin 与 MALAT1、GAS5 和 LINC00341呈显着正相关（相关系数r分别为0.15、0.24和0.24）。结论1.大气颗粒物会引起儿童内皮功能障碍,表现为儿童血清VEGF水平升高,白细胞ICAM-1、L-selectin和P-selectin表达水平的降低。2.大气颗粒物会引起儿童白细胞中MALAT1、GAS5和LINC00341等表达水平下调,并与血清VEGF等有较好的相关性。
杨南竹[3]（2020）在《注射用丹参多酚酸对急性缺血性脑卒中患者的保护作用及机制的研究》文中进行了进一步梳理急性缺血性脑卒中（Acute Ischemic Stroke,AIS）具有高致残率和高复发率的特点。一直以来AIS的各种药物治疗,特别是中药提取物治疗AIS一直是研究热点。丹参作为中国的传统中药,具有活血通络、散瘀止痛等功效,在临床上应用广泛。为此我们设计了本次研究方案,从抗炎、抗凋亡、调节纤溶功能三个方面,观察注射用丹参多酚酸（salvianolate injection,SLI）对AIS的保护作用,探讨可能的机制。第一部分SLI治疗AIS的临床疗效观察目的:对比SLI治疗前后AIS患者血液生化及凝血相关指标、炎性因子水平,及NHISS评分、m RS评分的变化,评估其临床疗效。方法:收集我院神经内科2016.1～2018.8首次发病的AIS患者共100例,随机分为SLI组和对照组,每组50例。对比两组患者的基线资料、治疗前后血液生化及凝血相关指标,以及NHISS评分、m RS评分的变化。随后从两组中各随机抽取30例患者,对比治疗前后ICAM-1、VCAM-1、IL-4、u PA、PAI-1/t PA水平。结果:1.两组人群入院时基线资料相比较无明显统计学差异,P>0.05。2.治疗后SLI组的PLT、FIB水平低于对照组,（P<0.01,P<0.05）而PDW水平显着高于对照组,P<0.01。SLI组治疗前后组间比较,PLT、FIB、hs CRP治疗后较前降低,P<0.01;对照组治疗后BUN水平升高,P<0.05;hs CRP、DD水平降低,P<0.01。3.治疗7天、1月后两组NHISS评分水平均较治疗前显着降低,P<0.01;治疗7天后的SLI组NHISS降低更显着,P<0.05;两组人群治疗1月后m RS评分、治疗3个月后的治疗有效率相比较无显着差异,P>0.05。4.SLI组治疗前后ICAM-1、VCAM-1、u PA、PAI-1/t PA水平显着降低,P<0.05;IL-4较前降低,但差异无显着性意义,P>0.05;对照组治疗前后ICAM-1、VCAM-1、IL-4、u PA、PAI-1/t PA水平显着降低,P<0.05。结论:1.SLI对治疗前后的肝功能、肾功能无显着影响,治疗期间无患者出现不良反应,提示其安全性较好,而无明显出血风险;在改善AIS患者的治疗效果及改善预后方面与对照治疗的效果相当。2.SLI可通过降低AIS患者的hs CRP、ICAM-1、VCAM-1水平,起到抑制体内炎症反应的治疗作用;3.SLI可通过降低AIS患者的PLT、FIB等水平,下调u PA、PAI-1、t PA的表达,升高PDW水平,起到调节血小板功能,从而调节凝血纤溶系统之间的平衡。第二部分H2O2诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）损伤模型的建立及SLI对血小板功能的影响目的:建立H2O2诱导的HUVECs损伤模型,观察不同浓度SLI对细胞活性的影响;对SLI的主要成分进行分析,观察SLI对大鼠体外血小板功能的影响。方法:建立H2O2诱导的HUVECs损伤模型,观察不同浓度SLI对细胞活性的影响。采用HPLC和LC-MS技术检测SLI的主要成分。应用流式细胞仪检测法不同浓度SLI对ADP诱导的大鼠血小板功能的影响。结果:1.成功建立了H2O2诱导HUVECs损伤模型,绘制HUVECs生长曲线。2.适合浓度（0.8,1.6mmol/L）的SLI会显着减轻H2O2造成的细胞损伤,P<0.01;其中60 min比30min的保护作用更强,P<0.01;3.应用HPLC法检测出SLI的主要成分为丹参多酚酸D（3.70%）、迷迭香酸（2.68%）、紫草酸（3.86%）及丹参多酚酸B（53.81%）;应用LC-MS法检测出SLI种包含29种明确的化学成分,这其中包括丹参素、丹参多酚酸B、丹参多酚酸A、丹参多酚酸D等14种常见酚酸;4.不同浓度（0.8,0.4,0.2mmol/L）的SLI对大鼠血小板聚集具有抑制作用,P<0.05;但各浓度之间的差异不明显,P>0.05。结论:1.SLI对HUVECs损伤模型具有保护作用,并可通过延长作用时间增加这一作用。2.SLI的成分明确,构成稳定,在临床使用中可通过其中的多种已知成分起到治疗作用。3.SLI对大鼠血小板聚集具有抑制作用,对缺血缺氧损伤起到保护作用。第三部分SLI对H2O2诱导的HUVECs损伤模型的保护作用目的:分析不同浓度SLI对H2O2诱导的HUVECs损伤后炎性因子、凝血纤溶相关因子的影响,探讨可能的机制。方法:应用ELISA法检测H2O2损伤后炎性因子及凝血纤溶相关因子的水平变化,观察不同浓度SLI对上述指标的影响;应用JC-1法和Hoechst法观察不同浓度SLI对H2O2造成的细胞凋亡的保护作用;应用Western Blot法测量Bcl-2、Bax、Cleaved-capcase-3等信号通路相关蛋白表达水平,观察不同浓度的SLI对上述指标水平的影响。结果:1.H2O2模型组的炎性因子（IL-1β、IL-17a、ICAM-1、VCAM-1、TNF-α）显着降低,P<0.0001;抗炎因子IGF-1显着升高,P<0.0001;不同浓度（0.05,0.1,0.2,0.4,0.8,1.6mmol/L）SLI能够浓度依赖性地降低上述炎性因子和IGF-1的水平,P<0.0001。2.H2O2模型组的凝血相关因子u PA、PAI-1、PAI-1/t PA显着增高,P<0.0001;不同浓度（0.05,0.1,0.2,0.4,0.8,1.6,3.2mmol/L）SLI能够浓度依赖性地降低u PA（P<<0.0001）、PAI-1（P<0.0001）、PAI-1/t PA（P<0.01）的水平。3.JC-1法显示不同浓度（0.1,0.2,0.4,0.8mmol/L）SLI对H2O2造成的细胞早期凋亡的具有保护作用:随着浓度的增加JC-1染色后的绿色荧光逐渐减少,红色荧光逐渐增加。4.Hoechst法显示不同浓度（0.4,0.8,1.6mmol/L）SLI对H2O2造成的细胞凋亡的保护作用:随着浓度的增加染色亮度逐渐趋向正常细胞,且细胞核固缩分叶程度较前减轻。5.H2O2模型组的Bax、Cleaved-caspase3表达显着升高,P<0.01,Bcl-2表达显着降低,P<0.01;加入适当浓度（0.2,0.4,0.8,1.6 mmol/L）的SLI能够下调Bax、Cleaved-caspase3的表达,上调Bcl-2的表达。结论:1.适合浓度的SLI对H2O2诱导的HUVECs损伤模型具有抗炎保护作用,这一作用可能是通过下调IL-1β、IL-17a、ICAM-1、VCAM-1、TNF-α的表达,上调IGF-1的表达而实现的;同时SLI还具有调节纤溶功能保护作用,这一作用可能是通过减少PAI-1、u PA的表达,上调t PA的表达而实现的。2.不同浓度SLI会剂量依赖性地抑制H2O2诱导的细胞凋亡,这一作用可能是通过上调Bcl-2的表达,减少Bax、Cleaved-caspase-3的表达实现的。
耿小勇[4]（2020）在《血小板微粒在心肌梗死、压力负荷心肌病中的价值》文中提出第一部分血小板微粒与心肌梗死面积相关性研究血小板激活或凋亡后可释放一种超微膜状囊泡,即血小板微粒（Platelet microparticles,PMPs）,PMPs可通过其表面携带或释放的多种炎性因子、受体及微核糖核酸等发挥众多的病理生理学作用,与多种疾病发病及预后相关。近年来研究显示PMPs不仅参与了动脉粥样硬化发生、发展及不稳定化全程,为急性冠脉综合征相关标志物,而且与心肌梗死损伤范围相关。PMPs在心肌梗死损伤评估中确切价值以及药物对其表达的影响、调控机制均需进一步研究明确。目的:1.观察PMPs与心肌梗死面积的相关性,探讨PMPs在心肌梗死损伤定量评估中的价值;2.观察抗血小板药物（阿司匹林、氯吡格雷、替格瑞洛）对PMPs及心肌梗死面积的影响,探讨药物干预对PMPs调控机制。方法:1.入选30只Wistar大鼠适应性喂养1周后随机分为5组:心肌梗死模型组（MI）、假手术组（sham）、心肌梗死+阿司匹林组（MI+A）、心肌梗死+阿司匹林+氯吡格雷组（MI+A+B）、心肌梗死+阿司匹林+替格瑞洛组（MI+A+T）。结扎左冠状动脉前降支制作心肌梗死模型。术前一周起至术后一周进行药物（阿司匹林10.42mg/kg,硫酸氢氯吡格雷18.75mg/kg,替格瑞洛7.81mg/kg）灌胃干预;2.术后7天处死大鼠,采集血液和心脏标本。血液标本经3000rmp,10min离心分离血清,Elisa检测PMPs及Calpain10水平;心脏标本用保鲜膜包裹好置于-20℃冷冻10-15min,1%TTC溶液37℃避光染色,使用数码相机拍照留取图片,并应用ipp6.0计算梗死面积;3.统计学分析:应用方差分析进行多均数比较,均数间两两比较采用LSD法和SNK检验。Pearson相关分析明确PMPs、Calpain10、心肌梗死面积之间相关性,线性回归分析PMPs与梗死面积相关性。结果:1.各干预组（MI+A+B、MI+A+T、MI+A）PMPs均较MI组降低（25±2.2 vs 84±6.9,27±2.5 vs 84±6.9,49±2.8 vs 84±6.9,P<0.01）;MI+A+B、MI+A+T组PMPs较MI+A组明显降低（25±2.2 vs 49±2.8,27±2.5 vs 49±2.8,P<0.01）;Sham组、MI+A+B组及MI+A+T组之间无统计学差异;2.各干预组（MI+A+B、MI+A+T、MI+A）心肌梗死面积均较MI组显着降低（10±0.96 vs 28±2.3,12±0.97 vs 28±2.3,20±1.6 vs 28±2.3,P<0.01）;MI+A+T组较MI+A组显着降低（12±0.97vs 20±1.6,P=0.001）;MI+A+B组与MI+A+T组之间无统计学差异;3.PMPs与梗死面积显着正相关（r=0.85 P<0.01）;4.应用线性回归分析得到PMPs与梗死面积回归模型y=4.61+0.28*x（y:梗死面积,x:血小板微粒）。结论:1.血清PMPs水平与梗死面积明显相关;2.可依据回归模型:y=4.61+0.28*x（y:梗死面积,x:PMPs）评估心肌梗死面积;3.抗血小板药物可能直接或通过Calpain10间接通过抑制血小板激活降低PMPs生成。。第二部分钙蛋白酶在心肌梗死中的作用及对血小板微粒的影响钙蛋白酶（Calpain）作为一种钙依赖蛋白酶,最初发现其作用主要为Z盘和蛋白水解活性,主要参与分解细胞膜和细胞骨架。后续研究发现Calpain参与了细胞信号转导、基因表达调控及细胞凋亡等众多病生理过程,与糖尿病、糖尿病并发症、肾功能不全及脑损伤等众多疾病相关。越来越多的证据显示Calpain参与了心肌缺血及缺血/再灌注损伤,并参与了PMPs调控过程。但其在心肌梗死损伤中的价值以及对PMPs表达的具体作用尚有待于进一步明确。目的:1.观察Calpain10与心肌梗死损伤的相关性,探讨Calpain10在心肌梗死损伤评估中的价值;2.观察Calpain10与PMPs相关性,探讨Calpain10对PMPs影响及调控机制;3.观察抗血小板药物（阿司匹林、氯吡格雷、替格瑞洛）对Calpain10及心肌梗死面积的影响,探讨抗血小板药物对Calpian10的作用机制。方法:1.入选30只Wistar大鼠,经适应性喂养1周后,随机分为5组,分别为心肌梗死模型组（MI）、假手术组（Sham）、心肌梗死+阿司匹林+氯吡格雷干预组（MI+A+B）、心肌梗死+阿司匹林+替格瑞洛干预组（MI+A+T）、心肌梗死+阿司匹林干预组（MI+A）。通过结扎左冠状动脉前降支方法制作心肌梗死模型。自模型制作术前一周起至术后一周进行药物（干预剂量分别为:阿司匹林10.42mg/kg,替格瑞洛7.81mg/kg,硫酸氢氯吡格雷18.75mg/kg）干预;2.术后7天处死大鼠,分别采集血液和心脏标本。Elisa检测血清Calpain10、PMPs表达水平;心脏标本处理后经1%TTC溶液37℃避光染色梗死心肌,使用数码相机拍照留取图片,并应用ipp6.0计算梗死面积;3.统计学分析:多均数比较应用方差分析,均数间两两比较采用LSD法和SNK检验。Calpain10与心肌梗死面积之间以及Calpain10与PMPs之间相关性应用Pearson相关分析及线性回归分析处理;结果:1.Sham组与MI+A+B组之间Calpain10无统计学差异（18±1.5 vs 21±1.9,P=0.422）;Sham组较MI组、MI+A组、MI+A+T组Calpain10明显降低（18±1.5 vs 67±4.2,18±1.5 vs 47±1.9,18±1.5 vs 30±2.4,P<0.01）;MI+A+B组较MI+A+T组Calpian10降低（21±1.9 vs 30±2.4,P=0.03）;MI+A+B组、MI+A+T组较MI+A组Calpain10明显降低（21±1.9 vs 47±1.9,30±2.4 vs 47±1.9,P<0.01）;2.Calpain10与梗死面积明显正相关（r=0.84 P<0.01）,PMPs与Calpain10明显正相关（r=0.90,P<0.01）;3.应用线性回归分析得到Calpain10与梗死面积回归模型Infarction Area=3.350+0.342×Calpain10;3.。结论:1.Calpain10与心肌梗死面积相关,可能直接或间接通过PMPs参与心肌梗死损伤过程;2.Calpain10可能通过血小板激活后α颗粒分泌、血小板聚集、伸展、突起形成、脱落等过程促进PMPs生成;3.抗血小板药物可能通过降低血小板细胞内钙内流而抑制Calpain10生成进而影响降低PMPs表达。第三部分血小板微粒在压力负荷心肌病评估中的作用既往研究显示血小板微粒（Platelet microparticles,PMPs）作为血小板激活、凋亡后产物参与了冠心病、心力衰竭等众多疾病发病过程,并在高血压病、肺动脉高压等疾病中具有重要的病情评估价值。但PMPs在心肌病中的具有何种价值,传统心肌病治疗药物是否能影响PMPs影响等一系列问题有待于研究明确。目的:1.观察PMPs在主动脉弓缩窄（transverse aortic constriction,TAC）压力负荷心肌病模型小鼠中的表达变化,探讨PMPs与肥厚性心肌病心肌重构及心功能的相关性;2.观察氯沙坦对PMPs及TAC模型小鼠心肌重构的影响,探讨其对PMPs影响机制;方法:1.研究共入选18只雄性C57BL/6J小鼠,经适应性喂养1周后,随机分为3组,分别为TAC模型组（TAC group）、假手术组（sham group）及TAC+氯沙坦干预组（TAC+ARB group）。通过结扎主动脉弓方法制作TAC模型。自模型制作术前一周起至术后一周进行药物（氯沙坦5mg/kg/day）干预;2.术后7天超声测定心功能后处死小鼠,采集血液标本。Elisa检测血清PMPs表达水平;3.满足正态分布且方差齐性数据采用方差分析进行多均数比较。均数间两两比较采用最小显着差异t检验（least significant difference,LSD）法检验;不满足正态分布或方差不齐数据采用Kruskal Wallis检验进行多均数比较,进一步采用Wilcoxon检验进行均数间两两比较。结果:1.TAC+ARB组与Sham组PMPs水平无统计学意义差异（23±2.9 vs 19±3.3,P=0.055）;TAC+ARB组较TAC组PMPs显着降低（23±2.9 vs 54±9.4,P=0.004）;TAC组较Sham组PMPs显着升高（54±9.4 vs 19±3.3,P=0.004）;2.各组间LVEF无统计学差异;3.TAC+ARB组较TAC组LV Mass明显降低（30±3.3 vs 38±2.2,P<0.001）;Sham组较TAC组LV Mass明显降低（27±3.5 vs 38±2.2,P<0.001）;TAC+ARB组与Sham组LV Mass无统计学差异（30±3.3 vs 27±3.5,P=0.106）;4.Pearson相关分析显示PMPs与LV Mass显着正相关（r=0.908,P<0.001）;PMPs与LVEF显着负相关相（r=-0.5,P=0.034）。结论:1.TAC压力负荷心肌病模型小鼠早期即可观察到PMPs升高,其水平与心肌重构显着相关,为心肌重构标志物;2.PMPs为心肌病、心力衰竭潜在干预靶点;3.氯沙坦可降低PMPs水平,对PMPs的作用可能为其改善心肌病、心力衰竭预后的又一作用机制;4.PMPs在压力负荷心肌病模型早期与LVEF呈显着负相关,为反应心功能的重要标志物。
李玉串[5]（2020）在《动脉粥样硬化发生发展中的肠道菌群变化及其致病机制》文中研究说明第一部分动脉粥样硬化小鼠病程进展中的肠道菌群表达变化目的:动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是一种发病机制复杂的慢性炎症与代谢相关性疾病,其具体的发病机制还未被阐明,限制了临床对该病的治疗。本研究旨在发现AS病程进展中肠道菌群的表达变化,为该病的发病机制提供新思路。方法:apo E-/-小鼠和野生型（wide type,WT）小鼠高脂喂养（high-fat diet,HFD）12周分别设为AS组和AS对照（atherosclerosis control,AS CTL）组,WT小鼠普通喂养12周设为空白对照（control,CTL）组。于喂养0、4、8、12周时分别采集三组小鼠新鲜粪便,提取粪便菌群DNA后进行16S r DNA高通量测序。喂养12周时采集血浆,测定三组小鼠血清总胆固醇（total cholesterol,TC）、甘油三酯（triglycerides,TG）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C）四项血脂指标。操作分类单元（operational taxonomic units,OTU）聚类分析中,使用Shannon指数和Simpson指数来比较各组之间的肠道菌群Alpha多样性,采用Uni Frac-PCo A分析和NMDS分析来比较各组之间的肠道菌群Beta多样性。结果:喂养0周时,apo E-/-小鼠拟杆菌门的相对丰度约为（70.33±12.34）%,厚壁菌门的相对丰度约为（19.60±10.22）%,变形菌门的相对丰度约为（8.48±5.30）%,WT小鼠拟杆菌门的相对丰度约为（56.98±10.85）%,厚壁菌门的相对丰度约为（26.18±10.47）%,变形菌门的相对丰度约为（14.35±9.31）%;apo E-/-小鼠肠道菌群Alpha多样性小于WT小鼠（p<0.05）,PCo A分析和NMDS分析均显示两者的肠道菌群Beta多样性无明显差异（p>0.05）。喂养开始后,不同时间点的组内比较显示与0周相比,AS、AS CTL组小鼠肠道拟杆菌门相对丰度于4周、8周、12周时均下降,厚壁菌门、变形菌门和脱铁杆菌门的相对丰度均增加;Simpson指数显示与0周相比,AS组肠道菌群Alpha多样性于8周、12周时明显增加（p<0.05）,AS CTL组肠道菌群Alpha多样性于4周、8周、12周时均下降（p<0.05）;PCo A分析显示与0周相比,AS组和AS CTL组肠道菌群Beta多样性均于12周时明显下降（p<0.05）;NMDS分析显示与0周相比,两组小鼠肠道菌群Beta多样性于4周、8周、12周时均发生变化。喂养12周AS小鼠造模成功时,组间比较显示AS组肠道拟杆菌门相对丰度下降和厚壁菌门、变形菌门相对丰度增加比AS CTL组更明显;AS组和AS CTL组肠道菌群Alpha多样性和Beta多样性无明显差异（p>0.05）。Simpson指数显示与0周相比,CTL组于喂养4、8、12周时肠道菌群Alpha多样性均无明显变化（p>0.05）,PCo A和NMDS分析显示Beta多样性均明显下降（p<0.05）;喂养12周时,与AS CTL组相比,CTL组肠道菌群Alpha多样性较大（p<0.05）,Beta多样性较小（p<0.05）。结论:肠道菌群拟杆菌门相对丰度下降,厚壁菌门、变形菌门相对丰度增加等组成改变与动脉粥样硬化的发生发展相关,而肠道菌群Alpha多样性和Beta多样性与疾病无明显相关性。第二部分肠道菌群对动脉粥样硬化小鼠血浆细胞因子表达水平的影响及其作用机制目的:动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是一种发病机制复杂的慢性炎症与代谢相关性疾病,炎症反应在AS发生发展中的作用已被广泛报道,但肠道菌群参与的炎症相关发病机制还未被阐明。本研究旨在发现AS小鼠模型中特定肠道差异菌群调控细胞因子及炎症的新机制。方法:apo E-/-小鼠和野生型（wide type,WT）小鼠高脂喂养（high-fat diet,HFD）12周分别设为AS组和AS对照（atherosclerosis control,AS CTL）组。于喂养0、4、8、12周时分别采集两组小鼠新鲜粪便,提取粪便菌群DNA后进行16S r DNA高通量测序,做组间的t-test检验来找出各分类水平（Phylum、Family、Genus）下具有显着差异的肠道菌群。喂养12周时采集血浆,测定两组小鼠血清CXC趋化因子配体（chemokine CXC motif ligand,CXCL）5和CXCL11的表达水平,采用高效液相色谱质谱联用分析法（high-performance liquid chromatography tandam mass spectrometry,HPLC-MS/MS）测定两组小鼠血清中氧化三甲胺（Trimethylamine oxide,TMAO）水平。采用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）小鼠血清中内皮细胞损伤相关蛋白水平。使用AAM-CYT-G1000芯片测定两组小鼠血浆中96种细胞因子表达,采用Foldchange来筛选差异表达蛋白（differentially expressed proteins,DEPs）。采用Spearman相关性系数作AS组与AS CTL组DEPs和不同分类水平下差异菌群的相关性分析。采用Fisher精确检验和R/Bioconductor软件的cluster Profiler数据包作DEPs蛋白质功能注释基因本体（Gene Ontology,GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）富集分析。用100u M/300u M TMAO刺激小鼠血管内皮细胞（vascular smooth muscle cells,VSCMs）12小时后检测细胞活力、凋亡和对THP-1单核细胞的吸附能力。采用Western Blot方法检测细胞磷酸化非受体酪氨酸激酶2-信号转导子和转录激活子3（phosphorylated Janus kinase 2-signal transducer and activator of transcription 3,p-JAK2/p-STAT3）蛋白表达水平。2u M WP1066用作STAT3的抑制剂。结果:喂养12周时,属分类水平下可见AS组Ruminiclostridium9、拟杆菌属（Bacteroides）、Akkermansia、Parabacteroides、teriumcoprostanoligenesgroup、未定义瘤胃菌属（unidentifiedRuminococcaceae）和Intestinimonas明显多于AS CTL组（p<0.05）,RikenellaceaeRC9gutgroup、Odoribacter、Rikenella、Roseburia和瘤胃菌属UCG-009（RuminococcaceaeUCG-009）明显少于AS CTL组（p<0.05）。LEf Se分析显示,AS组小鼠肠道菌群中影响较大的差异物种为瘤胃菌科（Ruminococcaceae）、拟杆菌科（Bacteroidaceae）和拟杆菌属（Bacteroides）。与AS CTL组相比,AS组共有13种DEPs,前6种分别为干扰素-gamma（interferon-gamma,IFN-gamma）、白介素-6（interleukin-6,IL-6）、白介素-9（interleukin-9,IL-9）、CXC趋化因子配体-5（Chemokine CXC motif ligand 5,CXCL5/LIX）、单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemo-attractant protein-1,MCP-1）和可溶性肿瘤坏死因子Ⅰ型受体（solubletumornecrosisfactorreceptor-I,s TNF-RI）。Spearman相关性分析显示,CXCL5、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,b FGF）、E选择素（E-Selectin）、糖皮质激素诱导肿瘤坏死因子受体（glucocorticoid-induced TNFR-related protein,GITR）、干扰素诱导T细胞趋化因子（Chemokine CXC motif ligand 11,ITAC/CXCL11）、金属蛋白酶组织抑制因子Ⅱ（tissue inhibitor of metalloproteinases-2,TIMP-2）与Akkermansia和疣微菌门（Verrucomicrobia）的相对丰度呈显着负相关（p<0.05）;拟杆菌属（Bacteroides）和拟杆菌科（Bacteroidaceae）的相对丰度与CXCL5、CXCL11呈显着负相关,与巨噬细胞来源的趋化因子（macrophage Derived Chemokine,MDC/CCL22）呈正相关（p<0.05）。另外,瘤胃菌科（Ruminococcaceae）的相对丰度与CXCL5、CXCL11呈负相关（p<0.05）;理研菌科（Rikenellaceae）的相对丰度与b FGF、GITR呈正相关（p<0.05）。对DEPs进行GO分析,在生物过程中发现的前四个子类别分别为细菌来源分子（molecule of bacterial origin）、脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）、白细胞游走（leukocyte migration）和JAK-STAT信号传导通路;在分子功能中发现的前四个子类别分别为细胞因子活性（cytokine activity）、细胞因子受体结合（cytokine receptor binding）、G蛋白偶联受体结合（G-protein coupled receptor binding）和生长因子活性（growth factor activity）;KEGG分析显示,DEPs富集程度最高的信号通路为细胞因子-细胞因子受体相互作用（Cytokine-cytokine receptor interaction）相关。相比于AS CTL组,AS组小鼠血清TMAO水平明显增高,CXCL5和CXCL11的表达水平明显升高,血清内皮细胞损伤相关因子浓度增加。100u M和300u M TMAO刺激12小时均能使VECs的细胞活力明显下降,细胞凋亡和对THP-1单核细胞的吸附增多;p-JAK2和p-STAT3的蛋白表达水平明显增加。抑制STAT3的表达后可以逆转TMAO对VECs的损伤作用。结论:动脉粥样硬化小鼠Akkermansia、疣微菌门、拟杆菌属、瘤胃菌科和理研菌科等肠道菌群的变化与外周血CXCL11、CXCL5、b FGF、MDC和GITR等细胞因子的表达水平相关,菌群代谢产物TMAO增加激活JAK/STAT信号通路引起的内皮细胞炎症损伤可能是引起动脉粥样硬化的发病机制之一。
孟德萍[6]（2019）在《Kupffer细胞和肝窦内皮细胞促进肝脏造血及其机制研究》文中提出研究目的:在胚胎时期胎肝是主要的造血器官。出生后,骨髓成为主要的造血位点。在某些病理条件下,由于骨髓造血功能衰竭,肝脏等实质器官可以发生髓外造血,提示成年肝脏中含有造血干祖细胞,具有长期造血重建的能力。然而,对于成年肝脏造血的特点、肝脏造血干祖细胞的发育来源、肝脏造血微环境的组成以及肝脏微环境对肝脏造血的具体调节机制尚不清楚。在本研究中,我们首先采用造血干细胞最经典的标志lineage-sca-1+c-kit+（LSK,包含造血干细胞和多潜能祖细胞）,检测到成年小鼠肝脏中存在造血干祖细胞。进一步发现成年肝脏中存在一群与胚胎肝脏相似而不同于骨髓的CD45+lineage-mac-1+sca-1+（LMS）细胞。通过造血干细胞移植实验,我们观察到肝脏LSK细胞和LMS细胞均可分化为成熟的淋巴细胞和髓系细胞。与骨髓来源的造血干细胞相比,肝脏LSK细胞和LMS细胞更倾向于分化为T淋巴细胞。我们进一步探讨了肝脏微环境中促进肝脏造血和T淋巴细胞分化的因素。一方面,我们发现肝脏固有巨噬细胞Kupffer细胞可以促进成年肝脏LSK细胞向淋巴细胞和髓系细胞分化,且以T淋巴细胞和B淋巴细胞分化为主。通过共培养实验证实,阻断Kupffer细胞上的细胞间粘附分子-1（ICAM-1）,可降低LSK细胞的黏附、增殖和分化。这些结果提示Kupffer细胞在维持和促进成年小鼠肝脏造血方面具有重要作用。另一方面,我们进一步证实了成年肝脏造血干细胞具有一群不同于骨髓的具有造血功能的LMS细胞。肝窦内皮细胞作为肝脏造血微环境的重要组成部分,可以通过Notch信号促进肝脏LMS细胞的分化,且以T淋巴细胞分化占优势。这些发现为了解肝脏髓外造血及其意义提供了重要的见解,为肝脏驻留免疫细胞的发育分化及肝脏疾病{如肝炎、非酒精性脂肪肝（NAFLD）和肝细胞癌（HCC）}的治疗等提供了一定的启示。研究方法:1.通过流式细胞术检测并比较了不同器官中肝脏造血干祖细胞（LSK和LMS）的比例。2.通过甲基纤维素半固体培养实验分析了肝脏造血干祖细胞的集落形成能力。3.采用多色流式细胞术分选肝脏或骨髓的造血干祖细胞,将CD45.2+小鼠的肝脏或骨髓造血干祖细胞与CD45.1+小鼠的骨髓单个核细胞混合,通过尾静脉注射到致死量照射的CD45.1+的小鼠体内,在不同时间点检测受者小鼠外周血中CD45.2+细胞、淋巴细胞及髓系细胞的比例,以确定成年肝脏造血干祖细胞的造血重建能力。4.通过LPS诱导的小鼠髓外造血模型来促进成年肝脏造血。5.采用氯磷酸二钠脂质体清除巨噬细胞和Kupffer细胞,观察清除Kupffer细胞之后对肝脏髓外造血的影响。6.通过ELISA方法检测Kupffer细胞分泌的造血生长因子及促炎因子的表达水平。7.采用共培养实验和流式细胞术在不同时间点检测肝脏造血干祖细胞向淋巴细胞和髓系细胞分化的情况。8.通过流式细胞术检测Kupffer细胞上ICAM-1和VCAM-1表达的变化及其相应配体LFA-1和VLA-4在肝脏LSK上表达的情况。9.在Kupffer细胞与LSK细胞共培养体系中加入ICAM-1阻断抗体,采用流式细胞术检测共培养体系中分化的淋巴细胞和髓系细胞的比例。10.通过实时荧光定量PCR检测了肝脏微环境造血调节因子及肝窦内皮细胞上Notch配体基因水平的表达情况。11.通过流式细胞术检测肝脏LMS细胞上Notch受体Notchl及Notch2的表达情况。12.通过流式细胞术检测了共培养体系中LMS细胞上Notch的活化形式NICD的表达情况。13.在肝窦内皮细胞和LMS细胞共培养体系中加入Notch信号抑制剂,通过流式细胞术观察肝脏LMS向淋巴细胞分化的情况。实验结果:1 Kupffer细胞促进肝脏造血机制研究1.1成年肝脏中含有造血干祖细胞通过流式细胞术检测并比较了不同发育阶段小鼠肝脏和骨髓中LSK细胞的比例。观察到成年肝脏中仍存在少量的LSK细胞。利用甲基纤维素半固体培养实验,发现虽然肝脏LSK细胞形成GM-CFU和M-CFU集落的数量明显低于骨髓,但是成年肝脏LSK细胞仍具有形成GM-CFU和M-CFU集落的能力。提示成年肝脏中存在具有造血功能的造血干祖细胞。1.2成年肝脏LSK细胞能够生成淋巴系和髓系细胞利用造血移植实验,观察到肝脏来源的LSK细胞能够重建致死量照射小鼠的淋巴细胞和髓系细胞,但是肝脏来源的LSK细胞的造血重建能力明显弱于骨髓。与骨髓相比,来源于肝脏的LSK细胞优先分化为T淋巴细胞,骨髓来源的LSK细胞主要以生成B淋巴细胞为主,产生较少的T淋巴细胞。并且发现肝脏来源的LSK细胞,主要是在肝脏中进一步分化为淋巴细胞和髓系细胞,却很少迁移到骨髓。然而,骨髓来源的LSK细胞可以同时迁移到骨髓和肝脏。1.3 Kupffer细胞促进LPS诱导的肝脏髓外造血连续3天给小鼠腹腔注射LPS建立髓外造血模型。采用流式细胞术检测肝脏中LSK细胞和长期造血干细胞（LT-HSC）的数量。发现与对照组相比,LPS处理组小鼠肝脏中LSK和LT-HSC细胞的绝对数显着增加。这提示LPS可以诱导肝脏髓外造血。利用氯磷酸二钠脂质体清除Kupffer细胞可明显削弱LPS诱导的肝脏LSK细胞和LT-HSC的数量增加。这说明Kupffer细胞在LPS诱导的肝脏髓外造血中发挥重要作用。1.4 Kupffer细胞促进肝脏造血干祖细胞分化为淋巴细胞和髓系细胞通过Kupffer细胞与LSK细胞共培养实验,观察到当只有培养基和SCF细胞因子的存在时肝脏LSK细胞不能分化为淋巴细胞和髓系细胞,只有当共培养体系中有Kupffer细胞的存在时肝脏LSK细胞才能分化为淋巴细胞和髓系细胞,如果在共培养体系中同时加入LPS可增强Kupffer细胞的这种促分化作用。这就提示Kupffer细胞可以促进肝脏造血干祖细胞的分化。1.5 Kupffer细胞促进肝脏造血干祖细胞的增殖利用LPS诱导的肝脏髓外造血模型,观察到与PBS对照组相比,LPS处理组增加肝脏Ki-67+LSK细胞的比例,而清除Kupffer细胞显着降低了 LPS处理组肝脏Ki-67+LSK细胞的比例。说明Kupffer细胞可以促进肝脏造血干祖细胞的增殖。1.6 Kupffer细胞通过ICAM-1/LFA-1相互作用促进LPS诱导的肝脏造血和淋巴细胞分化利用LPS诱导的肝脏髓外造血模型,采用流式细胞术检测了 Kupffer细胞表面黏附分子的表达。发现与对照组相比,LPS处理组ICAM-1的表达显着增加,但VCAM-1的表达没有改变。进一步检测了肝脏LSK细胞上ICAM-1和VCAM-1的相应配体LFA-1和VLA-4的表达情况。发现LPS处理之后肝脏LSK细胞上LFA-1的表达显着升高,而VLA-1的表达没有变化。在Kupffer细胞与LSK细胞共培养体系中,用抗体阻断ICAM-1与LFA的相互作用,无论是造血干祖细胞（LSK细胞和谱系阴性细胞）,还是分化的CD3+T细胞和CD19+B细胞数量都有所下降。提示Kupffer细胞可以通过ICAM-1/LFA-1相互作用促进LPS诱导的肝脏造血和淋巴细胞分化。2肝窦内皮细胞促进肝脏造血的机制研究2.1成年肝脏存在一群不同于骨髓的LMS细胞采用流式细胞术检测了胎肝、成年肝脏、脾脏及骨髓中LMS细胞的比例,并通过造血移植实验验证了胎肝LMS细胞的造血重建能力,观察到胎肝中确实存在LMS细胞并且具有造血功能,成年肝脏也存在较高比例的LMS细胞。但是,在脾脏和骨髓中几乎检测不到LMS细胞。提示LMS细胞可能仅存在于胎肝和成年肝脏,成年肝脏存在的LMS细胞可能来源于胚胎肝脏,而非骨髓。2.2成年肝脏中LMS细胞来自于胎肝给致死量照射小鼠分别转输胎肝和骨髓单个核细胞,在转输后第4周检测CD45.2+受体小鼠肝脏中供体来源的（CD45.1+）LMS细胞的生成情况。发现胎肝来源的单个核细胞在转输后4周能够在受体鼠肝脏中重建LMS细胞,但是骨髓来源的单个核细胞不能进行重建。进一步检测转输胎肝单个核细胞后受体鼠各个器官中LMS细胞重建情况,我们发现胎肝单个核细胞只能在肝脏中重建LMS细胞,而在骨髓、脾脏、外周血中几乎检测不到。这提示成年肝脏LMS细胞是来源于胎肝,而不是骨髓。2.3成年肝脏LMS细胞能够向淋巴系和髓系细胞分化给致死量照射小鼠转输成年肝脏LMS细胞,4周后能够在受体鼠外周血中检测到供体来源的CD45.1+LMS细胞,并且一直持续到第7周。进一步在受体鼠的肝脏、脾脏及骨髓中都观察到供体来源的CD45.1+的细胞,并且在受体肝脏中检测到供体来源的细胞可以分化发育为淋巴系（CD3+T、CD19+B、NK1.1+NK细胞）及CD11b+髓系细胞,但主要以CD3+T细胞为主。这说明成年肝脏LMS细胞能够向淋巴细胞和髓系细胞分化。2.4肝窦内皮细胞促进肝脏LMS细胞分化成淋巴细胞及髓系细胞通过肝窦内皮细胞与LMS细胞共培养实验,观察到肝窦内皮细胞能够促进LMS细胞分化成CD3+T、CD19+B、+NK1.1NK淋巴细胞和CD11b+髓系细胞,并且主要以生成CD3+T细胞为主。提示肝窦内皮细胞对LMS细胞的分化具有促进作用。2.5肝窦内皮细胞通过Notch信号促进了 LMS细胞向T细胞的分化将肝窦内皮细胞（LSEC）单独或肝窦内皮细胞和LMS细胞共培养（LSEC+LMS）,比较肝窦内皮Notch配体Jag1、Jag2、DLL1和DLL4基因表达水平。发现单独培养组和共培养组中肝窦内皮细胞都表达Jag1、Jag2、DLL1和DLL4,LSEC+LMS组与LSEC组相比DLL1的表达有所升高,Jag1和DLL4的表达没有差异,Jag2表达有降低的趋势。这就暗示肝窦内皮细胞有可能是通过Notch信号来促进了 LMS细胞向CD3+T细胞的分化。进一步检测LMS细胞上Notch受体Notch 1及Notch2的表达情况,发现LMS细胞表达一定比例的Notch 1及Notch2。随后我们检测了肝窦内皮细胞和LMS细胞共培养中分化的淋巴细胞的比例。我们观察到Notch抑制剂LY411575处理组与对照组相比,共培养体系中造血祖细胞Lin-细胞比例下降,分化的CD3+T细胞的比例下降,而CD19+B细胞的比例升高。这些表明肝窦内皮细胞是通过Notch信号促进了 LMS细胞向T细胞的分化。结论及意义:1.成年肝脏中存在LSK细胞和肝脏特有的不同于骨髓的LMS细胞。2.肝脏LSK细胞和LMS细胞具有向淋巴细胞和髓系细胞分化的能力,且以向T淋巴细胞分化占优势。3.本研究首次发现,在LPS诱导的肝脏髓外造血模型中,Kupffer细胞对LSK细胞的增殖具有促进作用。Kupffer细胞能够促进LSK细胞向淋巴细胞和髓系细胞的分化,且以向T和B淋巴细胞分化为主,LPS可增强Kupffer细胞的这种促分化作用。Kupffer细胞通过ICAM-1/LFA-1的相互作用促进LSK细胞在肝脏的驻留、增殖和分化。4.肝窦内皮细胞可以促进LMS细胞向淋巴细胞和髓系细胞的分化,主要以向T淋巴细胞分化为主,肝窦内皮细胞通过Notch信号促进LMS细胞向T淋巴细胞的分化。
刘玉杰[7]（2019）在《前列腺癌患者NK细胞活化受体NKG2D及其配体MICA的表达及临床意义》文中研究指明背景前列腺癌是全球第二常见的癌症,也是导致男性癌症相关死亡的第五大原因。用血清前列腺特异性抗原（PSA）筛查前列腺癌的目的是在早期、可干预的阶段发现前列腺癌,以便进行治疗并降低总体死亡率和疾病特异性死亡率。但是最近的回顾性研究发现PSA筛查导致前列腺癌诊断的增加,但并没有降低总体死亡率及疾病特异性死亡率。相反,筛查可能增加过度诊断和治疗带来的并发症的风险。PSA检测的假阳性率高,而且不能预测预后。因此需要额外的生物标志物辅助前列腺癌的诊断、治疗及预测预后。细胞毒性淋巴细胞是免疫监测的关键角色,这些淋巴细胞包括自然杀伤细胞（NK细胞）和T细胞,它们通过激活性受体（NKG2D）,被配体（NKG2DLs）激活后,参与各种应激应反应。因此,NKG2D-NKG2DLs相互作用是调节先天和适应性免疫反应的关键。当配体识别后,含有NKG2D的NK和T细胞被激活,触发靶细胞裂解。受体与其配体的结合也会触发细胞因子和趋化因子的产生,从而调节免疫反应,帮助维持组织的稳态。MICA和MICB是NKG2D识别的应激诱导分子,与NKG2D结合后,免疫效应细胞的NKG2D介导的溶细胞免疫反应将被激活,对抗病毒感染和表达MICA的肿瘤细胞。在早期肿瘤发生发展过程中,膜结合MICA是招募抗肿瘤免疫效应分子的关键信号。晚期肿瘤通过膜结合MICA分子的蛋白水解,下调细胞表面MICA的表达,释放出可溶性MICA（sMICA）,从而有利于肿瘤的增殖。MICA的多态特征及其在肿瘤进化过程中的表达失调导致了各种癌症类型的肿瘤逃避。因此,了解MICA相关肿瘤逃逸机制以及MICA的分子/细胞调控对肿瘤的诊断、治疗以及重建肿瘤免疫监测具有重要意义。第一部分血清可溶性MICA（sMICA）水平对前列腺癌患者预后的价值目的通过评价不同分期前列腺癌患者血清可溶性MICA（sMICA）水平、PSA水平、PS评分、EOD评分、肿瘤病理,明确前列腺癌患者预后的影响因素。方法检测136例前列腺癌患者血清sMICA水平,其中B期36例,C期20例,D期80例。使用单因素和多因素Cox回归模型分析评估肿瘤组织学、体力状况评分（PS）、骨转移、血清前列腺特异性抗原（PSA）水平和sMICA水平对疾病特异性存活的预后意义。结果1.B、C 和 D 期前列腺癌患者 sMICA水平是 198.4±7.2 pg/ml、229.8±8.3 pg/ml和578.4±12.2 pg/ml。B期与C期血清sMICA水平差异无统计学意义（P>0.05）,B期与D期、C期与D期血清sMICA水平差异有统计学意义（P<0.05）。2.B、C和D期前列腺癌患者的血清PSA水平分别是63.3±13.7 ng/ml,178.1±14.6 ng/ml 和 303.8±157.1 ng/ml,差异有统计学意义（P<0.05）。sMICA与 PSA 显着相关 r=0.76,P<0.05)。3.sMICA在前列腺癌中具有辅助诊断价值（AUC=0.92）,最佳截断值为283pg/ml,其约登指数为0.688,对应的敏感性为85.3%,特异性为83.3%。4.单因素分析显示患者 EOD≥1、sMICA≥283 pg/ml、PS≥1 和 PSA>100 ng/ml的生存时间明显低于他们各对应项（P<0.05）,肿瘤组织学与预后无显着相关性。多因素Cox回归分析结果表明,sMICA和EOD是影响前列腺癌患者生存时间的重要因素。结论1.远处转移前列腺癌（D期）患者血清sMICA水平明显高于局部浸润前列腺癌（C期）和局限性前列腺癌（B期）患者。2.前列腺癌患者血清sMICA水平与PSA水平呈正相关。3.sMICA在前列腺癌中具有辅助诊断价值。4.sMICA和EOD为影响前列腺癌患者生存时间的重要因素。第二部分前列腺癌患者NK细胞活化受体NKG2D及其配体MICA表达的相关性目的通过检测前列腺癌患者外周血NK细胞表面活化受体NKG2D及其配体MICA的可溶形式（sMICA）的表达水平,探讨前列腺癌患者NK细胞活化受体NKG2D及其配体MICA的表达的相关性及NKG2D-sMICA与前列腺癌免疫逃逸的关系及临床意义。方法ELISA和流式细胞术分别检测60例前列腺癌患者治疗前后和20例健康志愿者血清中可溶性MICA（sMICA）水平和外周血中NK细胞受体NKG2D的表达。结果1.sMICA表达水平前列腺癌组、正常组血清sMICA浓度分别为290.1±86.1 pg/ml、109.9±15.5 pg/ml,差别有统计学意义。前列腺癌患者中,B期22例、C期17例、D期21例,血清 sMICA 浓度分别为 199.8±14.9 pg/ml、283.8±26.7 pg/ml、389.8±40.6 pg/ml,D期明显高于B期、C期,差别有统计学意义（P<0.05）。2.NKG2D表达水平前列腺癌组、正常组NKG2D表达水平分别为78.9±3.8%、90.4±4.0%,差别有统计学意义。前列腺癌患者中B、C、D期NKG2D表达分别为81.0±4.8%、76.3±4.0%、67.0±4.0%,差别有统计学意义（P<0.05）。3.前列腺癌患者NKG2D与sMICA的相关性Spearman相关系数为-0.896,呈负相关,具有统计学意义（P<0.05）。4.治疗后sMICA和NKGD根治性前列腺切除术或雄激素剥夺治疗后3个月,前列腺癌患者中,B期17 例、C 期 22 例、D 期 21 例,血清 sMICA 浓度分别为 138.2±15.4 pg/ml、215.9±18.7 pg/ml、304.8.6±35.2 pg/ml,与治疗前比较明显降低,差别有统计学意义。术后前列腺癌患者中B、C、D期NKG2D表达分别为88.2±4.9%、81.8±4.0%、77.2±4.7%,各组与治疗前比较明显升高,差别有统计学意义（P<0.05）。结论1.前列腺癌患者NK细胞表面活化性受体NKG2D表达会降低,进而导致NK细胞杀伤肿瘤的活性下降,这可能是引起前列腺癌免疫逃逸的重要机制。2.随着前列腺癌的进展,MICA从前列腺癌表面脱落形成sMICA,血清中sMICA含量增高,而NK细胞受体NKG2D表达下调。前列腺癌患者血清sMICA水平与外周血NK细胞活化性受体NKG2D表达呈负相关。sMICA的异常增高可能是NKG2D表达下降的重要原因。3.根治性前列腺切除术、雄激素剥夺治疗可降低患者血清sMICA水平,同时提高NK细胞受体NKG2D的表达。第三部分重组sMICA蛋白及吉西他滨对NK细胞功能的影响目的研究重组人sMICA和化疗药物吉西他滨在体外对NK细胞活化性受体NKG2D及其分泌IFN-γ的影响。方法使用密度梯度离心法,分离健康成年男性外周血单个核细胞,然后使用免疫磁珠法分选NK细胞。将培养的NK细胞分为空白对照组及sMICA组、GEM组。空白对照组加等体积的完全培养基,sMICA组分别加不同浓度重组sMICA250 pg/ml、500 pg/ml、1000 pg/ml,GEM 组分别加入重组 sMICA250pg/ml、500pg/ml、1000pg/ml和吉西他滨5 mg/L,加入NK细胞,孵育过夜,收集NK细胞,使用流式细胞仪检测其NKG2D受体表达水平,然后收集培养液上清,用ELISA法检测其IFN-y的分泌水平。结果1.NKG2D表达水平sMICA1 组、sMICA2 组、sMICA3 组 NKG2D 表达率分别为 74.1±5.4%、57.83±3.9%、41.1±5.4%,实验组NKG2D表达率均明显低于空白对照组（90.6±4.0%）,差异有统计学意义（P<0.05）。sMICA3 组、sMICA2 组、sMICA3组NK细胞NKG2D受体的表达率逐渐降低,且不同浓度组间比较,差异有统计学意义（PO.05）。GEM1组、GEM2组、GEM3组NKG2D表达率分别为85.5±2.9%、66.3±5.0%、51.8±5.6%,差异有统计学意义（P<0.05）。sMICA1-GEM1、sMICA2-GEM2、sMICA3-GEM3组NKG2D表达水平（%）两两比较,差别均有统计学意义（P<0.05）。2.培养液上清中IFN-γ分泌水平sMICA1 组、sMICA2 组、sMICA3 组 IFN-γ浓度分别为 190.5±12.4 pg/ml、100.4±10.5 pg/ml、61±6.4 pg/ml,均明显低于空白对照 307.3±16.6 pg/ml,差异有统计学意义（P<0.05）。sMICA3 组、sMICA2 组、sMICA3 组 NK 细胞 IFN-γ的分泌水平逐渐下降,各浓度组间比较,差异有统计学意义（P<0.05）。GEM1组、GEM2 组、GEM3 组 IFN-y浓度分别为 216.3±18.8 pg/ml、161.8±11.1 pg/ml、93.3±18.5 pg/ml,各组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。sMICA1-GEM1、sMICA2-GEM2、sMICA3-GEM3组IFN-γ浓度之间比较,差别均有统计学意义（P<0.05）。结论1.重组可溶性MICA（sMICA）在体外可以下调NK细胞表面受体NKG2D的表达;2.重组可溶性MICA（sMICA）在体外可以降低IFN-γ的分泌水平;3.吉西他滨除具有免疫调节作用,可以通过上调NK细胞活化性受体NKG2D的表达,改善NK细胞的功能。NK细胞联合吉西他滨治疗晚期肿瘤值得深入研究。
熊丽林[8]（2019）在《PM2.5诱导的炎性反应对心血管内皮的损伤及分子机制研究》文中研究说明PM2.5是一种环境空气中空气动力学当量直径小于等于2.5μm,其化学成分多样、复杂的混合颗粒物。PM2.5作为空气污染物的重要组成成分,与心血管疾病密切相关。虽然目前研究揭示PM2.5诱导的炎性反应及继发的血管内皮损伤是心血管毒效应的重要机制,但是关注点大多集中在PM2.5导致了炎性效应后果上。对于血管炎症级联反应如何激发,炎性、粘附、血小板活化等血管炎性损伤相关细胞因子的来源及受哪些因素调控,以及炎性因子如何作用于血管内皮引起内皮功能紊乱等有待进一步深入研究。另外,评价PM2.5毒性效应时,仅仅考虑颗粒物本身还不够,还应充分评估其化学成分的毒性效应。鉴于此,本论文拟以大气PM2.5对南京居民心血管疾病的死因关系研究为切入点,通过人群健康效应大数据、固定群组人群重复测量观察、体外培养血管内皮细胞mRNA转录组测序,并在人群调查研究和生物信息学分析研究结果基础上,通过体外细胞实验和整体动物实验,进一步深入探讨PM2.5心血管系统血管内皮炎性作用机制,以寻找调控PM2.5炎性损伤级联反应的关键基因、PM2.5致心血管系统血管内皮炎性损伤的重要金属组分、评价心血管系统血管内皮炎性损伤的敏感指标及潜在的预防靶标,为PM2.5引起人群心血管疾病的防护提供理论依据。一、PM2.5对心血管疾病死亡影响的时间序列分析目的:了解2013-2017年南京市大气PM2.5日平均浓度及心血管疾病日死亡人数的变化趋势,定量评估南京市大气PM2.5对居民各类心血管疾病死亡的影响。方法:收集2013年1月1日-2017年12月31日南京市每日大气污染物资料(PM2.5、SO2、NO2、O3)、气象资料（平均温度、相对湿度）和心血管疾病死亡人数资料,根据ICD-10编码进行疾病分类。用时间序列分析方法建立广义相加模型,调整了长期时间趋势、气象因素、“星期几效应”后,定量研究2013-2017年南京市PM2.5在夏季、冬季、过渡季对不同性别、年龄人群心血管疾病总死亡,以及缺血性心脏病、高血压、心律失常等疾病死亡的影响,并计算PM2.5浓度增加每10μg/m3时,每日因各类疾病死亡人数的超额危险度。结果:（1）2013-2017年南京市主要大气污染物为PM2.5,且所有大气污染物和心血管疾病的死亡情况均呈季节性变化,除O3浓度夏季高于冬季外,其余均表现为冬季高于夏季。（2）单污染物模型分析结果显示:PM2.5对心血管疾病总死亡的效应有统计学意义。从全年水平看,PM2.5浓度每升高10μg/m3,心血管疾病死亡风险增加0.43%（95%CI:0.080.78%）。PM2.5对心血管疾病死亡风险夏季高于冬季和过渡季,且4565岁组更为敏感。在心血管疾病病种分层中,PM2.5对急性心肌梗死的效应在滞后7天（Lag7）最明显,PM2.5浓度每升高10μg/m3,急性心肌梗死的死亡风险增加1.02%（95%CI:0.401.64%）;PM2.5对动脉粥样硬化、冠脉供血不足、心绞痛等缺血性心脏病,以及高血压的效应均在滞后当天最明显,PM2.5浓度每升高10μg/m3,死亡风险分别增加1.10%（0.591.60%）和1.11%（0.142.09%）。（3）在双污染物及多污染物模型中调整其他污染物后,PM2.5对不同种类心血管疾病的效应较单污染物模型出现不同程度的变化,提示污染物之间可能存在相互作用。结论:PM2.5可以增加南京市居民急性心肌梗死、动脉粥样硬化、冠脉供血不足、心绞痛等缺血性心脏病,以及高血压死亡风险,且以夏季、4565岁组更敏感,但没有观察到PM2.5与心律失常死亡的相关性。二、PM2.5及金属成分对血清金属和心血管内皮炎性损伤相关细胞因子影响的人群重复测量研究目的:从人群水平探讨PM2.5及其金属成分心血管系统血管内皮炎性损伤效应和机制,寻找导致心血管系统血管内皮炎性损伤的主要金属成分,以及外周血中评价该类损伤的敏感指标。方法:利用重大活动保障期间政府采取的大气污染控制措施,带来的大气质量暂时改善,选择一组31人健康中年人群,在南京青奥会举办前、举办期间及举办后进行连续5次纵向、多时点的重复测量研究;跟踪观察在此期间大气PM2.5及金属成分浓度、人群金属血清浓度,以及血清中血管内皮炎性损伤相关细胞因子浓度的变化。运用线性混合效应模型,分析PM2.5金属成分（Al、Cr、Mn、Hg、Sb、Pb、Cd、Ni、As）与相应血清金属间、PM2.5与细胞因子（IL-18、IL-10、IL-1β、TNF-α、CRP、MCP-1、P-selectin、ICAM-1、VCAM-1、sCD40L）间、各血清金属与细胞因子间的相关性,以此探讨PM2.5及金属成分对体内金属负荷的影响,以及心血管系统血管内皮炎性损伤效应和机制。结果:严格的大气污染控制政策,使得大气PM2.5浓度在青奥期间下降33.82%,PM2.5金属成分,除了Be外(75%的PM2.5样品Be浓度低于检测限),Al、Cr、Mn、Hg、Pb、Cd、Ni、Tl、Se、Sb和As浓度在青奥会期间均下降,下降幅度前6位的金属为Hg、Mn、As、Cd、Pb、Se,其下降幅度分别为37.85%、33.13%、30.77%、29.45%、18.89%和16.18%。青奥会后,PM2.5浓度及上述金属成分浓度均回升,上升幅度前6位金属为Cd、Be、Hg、Pb、As、Ni,其上升幅度分别为63.04%、50.00%、30.45%、21.31%、21.20%和15.40%。该组人群血清金属浓度变化趋势总体与此变化趋势一致,大多数表现为青奥会期间浓度下降,赛事结束大气污染控制政策解除后回升,其中2448h PM2.5Ni与血清Ni、07d PM2.5Cd与血清Cd存在正相关。在研究的10种参与炎性、血管粘附、血小板激活等与心血管系统血管内皮炎性效应相关的细胞因子中,血清IL-1β、IL-18、sCD40L、VCAM-1、CRP等亦在青奥中下降,青奥后回升。大气PM2.5与血清IL-1β、IL-18、sCD40L、ICAM-1、VCAM-1和P-selectin浓度存在正相关,正相关效应大多出现在1324h和024h。大气PM2.5与血清IL-10在712h、024h表现为负相关。另外,血清金属浓度与血清细胞因子间存在一定的相关性,血清Sb的效应尤为明显,与MCP-1、TNF-α和IL-18存在正相关;血清As与ICAM-1、血清Al与IL-18、血清Mn与VCAM-1存在正相关。结论:PM2.5可以通过激发全身性炎性级联反应,分泌多种炎性、粘附、血小板活化相关细胞因子,以血管内皮为主要攻击标靶,引起血管内皮功能紊乱,PM2.5金属成分参与了此过程,在本研究中Sb、As、Al和Mn的心血管系统血管内皮炎性损伤效应较为显着。血清白介素类炎性因子IL-1β、IL-18、IL-10,参与血管粘附的ICAM-1、VCAM-1分子和血小板活化标记物sCD40L、P-selectin等细胞因子联合使用,可以作为PM2.5致心血管系统血管内皮炎性损伤的综合评价指标。三、PM2.5对EA.hy926细胞毒性及mRNA转录组分析目的:弄清PM2.5如何激发血管内皮细胞炎症级联反应、各类炎性因子如何相互作用导致血管内皮细胞损伤、该过程受哪些机制调控及金属离子是否参与其中?以转录组学较完整地了解PM2.5导致血管内皮细胞损伤的潜在复杂机制,为进一步的分子机制探讨提供线索。方法:用mRNA表达谱芯片的方法,对PM2.5处理的EA.hy926细胞进行mRNA转录组测序。染毒剂量由MTT法细胞活性检测、细胞周期试验和细胞凋亡试验来确定。mRNA表达谱芯片结果,通过差异表达mRNA筛选、GO分析、KEGG分析、基因相互作用网络分析等生物信息分析方法,了解基因间的相互作用,以及差异基因富集的主要生物过程和通路。结果:mRNA转录组测序设2个处理组:没有明显细胞死亡、细胞凋亡及细胞周期改变的2.5μg/cm2较低剂量组;细胞存活率接近80%,出现明显细胞凋亡和S期阻滞的10μg/cm2较高剂量组。通过差异表达mRNA筛选发现,与对照组相比,在2.5μg/cm2剂量组中有107个基因表达发生改变,其中75个基因表达上调,32个基因表达下调。在10μg/cm2剂量组中,有440个基因表达发生改变,其中297个基因表达上调,143个基因表达下调。高剂量组差异表达基因数量明显高于低剂量组。由GO分析、KEGG分析等生物信息分析,PM2.5对血管内皮细胞的损伤机制在2.5μg/cm2低剂量组以炎性反应为主,多个炎性相关通路和多种金属离子相关的生物学过程被激活,ROS负担也已开始增加。在10μg/cm2高剂量组,氧化应激和炎症级联反应进一步加重,粘附、血小板激活、血管收缩等效应突出;此外,吞噬、脂质代谢异常、纤维化等亦不能忽视。为了检验测序结果的可靠性,且为下一章机制研究提供线索,选择了与炎性、粘附、氧化应激相关的10个差异表达基因进行RT-qPCR验证,其中8个基因的RT-qPCR结果与mRNA表达谱芯片结果一致,说明测序结果可靠。结论:PM2.5激活了与膜受体介导的氧化应激、炎症反应、粘附效应、内吞作用、代谢异常,以及多种金属离子参与的生物过程和通路。mRNA信号网络分析提示PM2.5对血管内皮细胞的毒性由多个参与氧化应激、炎性和粘附生物过程的基因相互调控和作用。四、NOX1在PM2.5致心血管内皮炎性损伤中的作用目的:进一步验证和探讨NOX1在PM2.5对心血管系统血管内皮炎性损伤中的调控作用。方法:用NOX1抑制剂ML090对PM2.5染毒EA.hy926细胞进行干预,比较ML090干预前后,ROS水平及IL-1β、IL-18、IL-10、ICAM-1、VCAM-1和P-seletin等参与血管内皮细胞炎性损伤的细胞因子水平的变化。用平均粒径1μm的金属铝粉代替PM2.5染毒EA.hy926细胞,通过检测金属Al对EA.hy926细胞NOX1基因表达水平的影响,以此验证PM2.5金属成分是否参与了NOX1介导的氧化应激和血管炎性损伤。最后,对小鼠进行PM2.5动态吸入染毒,从整体动物水平观察血清中前炎性因子浓度的变化,以及心、肺、肾等脏器血管内皮NOX1和ICAM-1的表达。结果:EA.hy926细胞经PM2.5染毒后,在多个血管内皮炎性损伤相关细胞因子（IL-18、IL-10、VCAM-1、ICAM-1和P-seletin）水平尚未明显变化的2.5μg/cm2较低剂量组,NOX1基因表达水平和ROS水平已显着升高。ML090干预使PM2.5诱导的NOX1过表达水平下降了54.38%。同时,ML090干预后ROS水平、IL-1β、IL-18、ICAM-1水平较PM2.5染毒组显着下降,IL-10水平升高。C57BL/6小鼠0.4mg/m3 PM2.5吸入染毒,染毒3d和7d,小鼠血清IL-18和IL-10水平与对照组比均显着升高,染毒14d,肺、心脏和肾NOX1和ICAM-1免疫组化结果显示PM2.5染毒使小鼠肺泡壁血管内皮细胞和肾小球血管内皮细胞的NOX1和ICAM-1蛋白水平明显升高,心肌间质血管内皮细胞ICAM-1蛋白水平明显升高,但是心肌间质血管内皮细胞NOX1蛋白水平与对照组相比,未观察到染色增强。另外,本研究选择了在PM2.5金属成分构成比中较高的金属Al对EA.hy926细胞染毒观察NOX1基因表达水平的变化,研究发现金属Al使NOX1基因的表达水平显着上调。结论:NOX1参与了PM2.5诱导的血管内皮细胞ROS堆积和血管炎性反应,其可能是PM2.5致血管内皮炎性损伤的调控基因,下调NOX1可以降低ROS,减轻PM2.5所致的血管内皮细胞功能紊乱。金属Al对NOX1基因表达上调作用,提示PM2.5金属成分可能参与了NOX1调控ROS生成和血管炎性反应过程。综上,本研究进一步证实了PM2.5诱导的心血管系统血管内皮炎性损伤是其致急性心肌梗死、动脉粥样硬化、冠心病等多种心脏疾病的重要机制,且该过程是氧化应激、炎症反应、粘附等多个基因、多种生物功能和多条通路共同参与和相互作用的结果。PM2.5炎症级联反应激活了多种血管活性物质,其中血清白介素类炎性因子IL-1β、IL-18、IL-10,参与血管粘附的ICAM-1、VCAM-1分子和血小板活化标记物sCD40L、P-selectin等细胞因子联合使用,可以作为PM2.5致心血管系统血管内皮炎性损伤的综合评价指标。在PM2.5心血管炎性反应激活、级联反应增强过程中,ROS的地位不容忽视,NOX1可以通过ROS影响IL-1β、IL-18、IL-10、ICAM-1等因子的水平,从而调控PM2.5所致的血管内皮损伤。NOX1对血管内皮炎性损伤的调控作用,可以是PM2.5直接作用于血管内皮细胞引起,也可以是PM2.5经呼吸道进入机体,对肺、肾等多脏器ROS及血管炎症因子影响而产生的全身性反应。PM2.5金属成分在致血管内皮炎性损伤过程中扮演重要角色,这些金属可能参与了氧化应激、炎症反应、粘附反应相关的多个生物过程和通路。在PM2.5金属成分致心血管系统血管内皮炎性损伤中,可对Sb、As、Al和Mn的毒性效应给予更多的关注。
杨锦涛[9]（2019）在《滤泡辅助T细胞及单核/巨噬细胞来源的外泌体在肾移植术后抗体介导的排斥反应中的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理目的与意义:抗体介导的排斥反应是移植肾失功的关键因素,目前对于其免疫分子机制认识尚不充分,临床上对于ABMR的治疗仍停留在非特异性抑制或清除产生抗体的细胞或阻断已产生的抗体作用层面,靶向性差。滤泡辅助T细胞是一类促进B细胞成熟、形成抗体的CD4细胞。外泌体是一种小囊泡,由细胞装配和释放,参与譬如细胞迁移、抗原提呈、免疫应答、肿瘤侵袭等许多生物学过程。Tfh来源外泌体与B细胞分化以及与ABMR相关性尚无报道。肾移植术后,供者肾小球内皮细胞最先接触到受者免疫细胞,研究两者之间外泌体的传递对于研究移植排斥至关重要。移植肾进入体内后将立即激活受体的先天性免疫,大量的单核/巨噬细胞归巢和并浸润到移植物中。单核/巨噬细胞表面配体能作用于内皮细胞上受体,发挥粘附、促炎功能,因此其可作为一个有效模型,研究肾移植后免疫细胞同供体组织细胞之间外泌体传递。本课题在前期对Tfh细胞在ABMR中的作用机制研究的基础上,进一步研究其分泌的外泌体在ABMR的作用,检测CRAD患者循环CD4+CXCR5+外泌体,分析其与ABMR的相关性。并进一步分离Tfh细胞体外培养后获取Tfh细胞来源的外泌体,将其在SEB刺激下与B细胞共培养,分析其对B细胞增殖与分化的影响。不仅为阐明Tfh细胞辅助B细胞增殖和分化的机制提供了新的视角,而且为ABMR的预防和监测提供了新的途径。并且以Netrin-1作为一种分子模型来讨论神经分子对单核/巨噬细胞和肾小球内皮细胞信息交流的影响,为理解器官同种异体移植后神经、免疫和血管之间的相互作用和联系外泌体的传递提供新的见解。CD4+CXCR5+外泌体与肾移植术后ABMR的相关性研究方法:1、研究对象选择:选取在解放军总医院第八医学中心就诊的肾移植术后慢性移植肾失功（CRAD）患者作为研究对象,并选择同时期术后肾功正常患者做为对照组。2、标本的采集:入组的研究对象于清晨空腹收集液标本,ABMR组患者标本均为临床确诊ABMR针对治疗前及时收集血清标本。3、研究对象分组:依据2013年ABMR的Banff标准分两组,包括ABMR及非ABMR组。4、外泌体分离方法:利用聚合物沉淀法提取。5、鉴定外泌体:TEM鉴定外泌体形状和大小;NTA技术鉴定粒径和浓度;Western鉴定分子标志。6、流式检测:使用包被抗CD63抗体磁珠结合外泌体,应用流式细胞术检测CD4、CXCR5等表面标志:使用Invitrogen公司的Exosome-Human CD63分离/检测试剂,使外泌体和磁珠结合,应用流式检测CD4、CXCR5、CTLA-4、HLA-G,比较ABMR组患者与非ABMR组患者之间CD4+CXCR5+外泌体的差异,分析其与ABMR的相关性。7、收集临床资料:性别、年龄、肾移植术后的时间等和化验指标。8、数值数据记录为平均值土标准差（x±s）。应用SPSS 19.0对数据进行分析计算。使用双侧Wilcoxon秩和检验来比较临床资料。Spearman等级测试相关性和配对t检验比较实验数据。P<0.05设定为具备统计学差异。结果:1、外泌体的基本特点:TEM显示,分离的外泌体呈茶盘型/半球形,具有凹面,粒径50-100nm;NTA结果显示囊泡粒径约100nm;Western Blot检测外泌体蛋白表达;CD9、CD81及TSG101这三种标志蛋白在血清分离出的囊泡中均有表达。2、流式细胞仪比较各组受者血清分离的外泌体及其亚型的差异:CRAD组病例血清和移植肾功能正常病例血清CD4+CXCR5+外泌体比例无明显差异。在CRAD组中,CD4+CXCR5+CXCR3-外泌体的比例高于对照组。CRAD患者进一步分为ABMR组和非ABMR组,组间CD4+CXCR5+外泌体比例无显着差异,而ABMR组CD4+CXCR5+CXCR3-外泌体比例显着高于非ABMR组。3、流式检测Tfh细胞来源外泌体上HLA-G和CTLA-4水平:与对照组相比,CRAD组中HLA-G和CTLA-4的CD4+CXCR5+外泌体表达没有明显变化。CRAD患者中,ABMR组中CD4+CXCR5+外泌体上CTLA-4水平显着低于非ABMR组,但HLA-G水平差异不明显。结论:肾移植术后ABMR患者血清中CD4+CXCR5+CXCR3-外泌体增加,提示其和ABMR有关。ABMR患者血CD4+CXCR5+外泌体表面CTLA-4水平明显降低。ABMR患者外周血Tfh来源外泌体对B细胞的影响方法:1、研究对象及分组:同第一部分。2、标本的采集:获取外周血,保存抗凝管中。3、分离PBMC:淋巴细胞分离液获取PBMC。4、分选滤泡辅助T细胞:磁珠法先阴性分选标本CD4细胞;再阳性分选CD4+CXCR5+Tfh。5、培养滤泡辅助T细胞:将Tfh加入含10%去除外泌体胎牛血清RPMI1640培养基48h。6、分离Tfh细胞来源的外泌体:利用聚合物沉淀法提取。7、流式细胞术检测外泌体中HLA-G和CTLA-4的表达。8、外泌体示踪实验:使用PKH67进行染色,然后加至B细胞培养,验证其是否被吞噬。9、将外泌体加入耗尽Tfh细胞的淋巴细胞培养基共培养48h,流式细胞术测量其中B细胞（CD3-CD19+细胞）和浆细胞（CD3-CD19-CD38+细胞）的比例。并用ELISA检测Ig浓度。结果:1、在ABMR组患者中,Tfh细胞来源的外泌体上的CTLA-4表达降低,但HLA-G与非ABMR组无差异;2、Tfh细胞来源的外泌体可以被B细胞吞噬;3、ABMR患者Tfh来源外泌体刺激B细胞分化、扩增,相对于非ABMR组,B细胞和浆细胞的比例分别增加87.52%和110.2%;4、ABMR患者中Tfh来源外泌体刺激IgG和IgA产生,但对IgM产生没有显着影响。结论:1、Tfh来源外泌体可以被B细胞吞噬;2、ABMR患者Tfh来源外泌体促进B细胞分化、增殖,并且能够增加IgG、IgA抗体生成;3、ABMR组患者Tfh细胞来源的外泌体上的CTLA-4表达降低,但HLA-G的表达与非ABMR组无差异,推测外泌体可能是CTLA-4发挥免疫抑制效应的重要载体。单核细胞/巨噬细胞通过外泌体靶向递送HLA-G至内皮细胞方法:1、获取志愿者PBMC,分选单核/巨噬细胞;2、与丝裂霉素C处理过的肾小球内皮细胞以及来自相同志愿者的淋巴细胞进行混合淋巴细胞培养（MLC）;3、更换培养基继续培养单核/巨噬细胞,分组加入Netrin-1及外泌体抑制剂GW4869,流式细胞术检测单核/巨噬细胞的表型及HLA-G蛋白的表达;4、MLC48小时后,从单核/巨噬细胞中除去刺激因子,然后将细胞加入到室的上部,并且预先在室的下部放进肾小球内皮细胞。培养48h后获取下部内皮细胞;5、流式检测内皮细胞表面HLA-G及其受体、黏附分子水平;6、聚合物沉淀法试剂盒分离单核/巨噬细胞来源的外泌体,示踪实验检测是否被内皮细胞吞噬;7、外泌体同内皮细胞共培养,流式检测HLA-G蛋白水平。结果:Netrin-1促进了单核/巨噬细胞的表型转化和HLA-G的表达,神经突起导向因子Netrin-1刺激的单核/巨噬细胞通过外泌体的递送促进内皮细胞中HLA-G及其受体的表达,单核/巨噬细胞在Netrin-1刺激后外泌体HLA-G表达的显着增强;使用抗体密封外泌体上的HLA-G,可以显着抑制Netrin-1组中内皮细胞的HLA-G的表达。神经突起导向因子Netrin-1促进单核/巨噬细胞来源外泌体HLA-G靶向递送至内皮细胞。Netrin-1刺激的单核/巨噬细胞抑制内皮细胞中促炎分子表达。结论:1、MLC诱导单核/巨噬细胞向M1极化,增强其HLA-G表达,神经突起导向因子Netrin-1能部分逆转这种极化,进一步促进单核/巨噬细胞的HLA-G表达;2、单核/巨噬细胞通过外泌体靶向递送HLA-G至进内皮细胞,神经突起导向因子Netrin-1能促进这种传递方式。
徐新[10]（2019）在《VWF-A2对创伤性脑损伤神经保护作用及机制研究》文中研究指明背景和目的:创伤性脑损伤（Traumatic brian injury,TBI）是威胁人类生命的重大疾病,具有高致残、致死特点,目前尚缺乏有效的药物干预手段。TBI病理生理机制复杂,继发的凝血功能障碍（TBI associated coagulopathy,TBI-AC）及血脑屏障破坏被认为与其不良预后相关。前期研究发现,TBI急性期粘附配体血管性血友病因子（von Willibrand factor,VWF）水平升高且粘附活性增强,通过与脑源性微囊泡（brain-derived microvesicles,BDMVs）结合,协助BDMVs破坏血脑屏障及引起TBI-AC。有研究证明纯化的VWF-A2片段可抑制血小板与VWF以及血小板与纤维蛋白的相互作用。本研究拟通过重组质粒转染、表达、纯化获得高纯度重组VWF-A2蛋白,腹腔注射干预TBI小鼠。探索VWF-A2对TBI小鼠血脑屏障及凝血系统的影响,同时探索其可能的作用机制,为TBI患者药物治疗提供新思路。方法:（1）通过重组质粒转染、表达、纯化获得重组VWF-A2蛋白（组氨酸标签标记）。通过凝胶电泳、蛋白质印迹法及金属酶ADAMTS-13体外酶切实验对VWF-A2进行鉴定和初步功能性研究。（2）通过液压打击仪制备C57BL/6J小鼠重型TBI模型,伤后30 min腹腔注射VWF-A2（4 mg/kg）,检测不同时间点VWF-A2循环血浓度。评估VWF-A2对TBI小鼠伤后3天内死亡率的影响,改良版神经功能评分评估神经功能预后。（3）伊文氏蓝渗漏实验检测TBI小鼠血脑屏障通透性。苏木精-伊红染色评估TBI小鼠肺组织血管渗出情况。流式细胞术检测循环血MVs水平。Transwell小室系统和免疫荧光染色技术检测VWF-A2对TBI小鼠外周血源性MVs及体外冻融匀浆法制备的BDMVs介导的内皮屏障破坏的影响。（4）酶联免疫吸附试验检测TBI小鼠循环血VWF抗原、D-二聚体和纤维蛋白原含量及VWF结合胶原能力。磷钨酸-苏木精染色评估TBI小鼠肾脏纤维素沉积情况。凝血酶生成实验和活化凝血因子X凝血时间检测MVs介导的凝血反应。流式细胞仪和血细胞计数仪检测血小板激活水平及血小板计数。小鼠断尾流血时间检测TBI小鼠出血倾向。（5）免疫共沉淀法及表面等离子体共振技术检测TBI小鼠循环血及体外VWF与VWF-A2相互作用。同时评估VWF-A2对瑞斯托霉素辅因子活性和剪切力诱导的血小板聚集的影响。结果:通过VWF-A2重组质粒转染、表达、纯化成功获得大量高纯度重组VWF-A2蛋白（纯度90-95%）,金属酶ADAMTS-13可有效酶切VWF-A2,证明了其具有生物学活性。VWF-A2可减少TBI后循环血中携带VWF的脑源性、血小板源性及内皮细胞源性MVs释放,抑制VWF协助下BDMVs介导的血脑屏障破坏及内皮细胞激活,同时降低了TBI小鼠死亡率,改善存活小鼠神经功能预后。同时,VWF-A2可减少TBI后高活性VWF的释放并能抑制其粘附活性,减轻VWF引起的血小板激活及血小板减少症。此外,VWF-A2对凝血及纤溶级联反应也有抑制作用,表现为减轻了MVs介导的凝血酶生成及活化凝血因子Xa凝血反应,D-dimer水平下降,纤维蛋白原水平上升,并且缓解了TBI后出血倾向但不引起正常老鼠出血倾向。最后,通过体内、体外实验证实VWF-A2可结合到活化VWF暴露的A1结构域,抑制其活性,表现为减轻瑞斯托霉素或剪切力诱导的血小板聚集。结论:本研究成功纯化重组VWF-A2蛋白,证明VWF-A2可减轻TBI小鼠血脑屏障及凝血系统损害,降低死亡率,改善神经功能预后。其神经保护机制可能是结合并抑制了TBI后释放的高活性VWF功能,提示了其作为药物开发的可行性,为TBI药物治疗提供新思路。同时,VWF-A2还可能成为特异性检测高活性VWF的新手段,用于诊断血栓性血小板减少性紫癜、严重感染等疾病。
二、外周血中可溶型P选择素的ELISA检测（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、外周血中可溶型P选择素的ELISA检测（论文提纲范文）
（1）影响脑梗死急性期外周血中性粒细胞数量和状态的相关因素分析（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 急性脑梗死治疗现状 |
| 1.2 脑梗死后的炎症反应 |
| 1.3 中性粒细胞在调控炎症反应中发挥十分重要的作用 |
| 1.4 经典的中性粒细胞功能调控靶点 |
| 1.4.1 中性粒细胞的迁移和激活 |
| 1.4.2 中性粒细胞的粘附 |
| 1.4.3 中性粒细胞的极化 |
| 1.5 可能影响中性粒细胞的脑梗死危险因素 |
| 1.6 展望 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 临床样本收集 |
| 2.1.1 病例选择 |
| 2.1.2 纳入标准 |
| 2.1.3 排除标准 |
| 2.1.4 病例资料及样本采集 |
| 2.2 研究材料 |
| 2.2.1 主要实验试剂 |
| 2.2.2 主要实验仪器 |
| 2.3 研究方法 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 各组临床参数 |
| 3.2 各组间外周血中性粒细胞数量变化 |
| 3.3 AIS患者不同临床参数对外周血中性粒细胞数量的影响 |
| 3.4 各组外周血中性粒细胞Fcg RIII受体(CD16)表达情况 |
| 3.5 AIS患者临床参数不同时循环中性粒细胞FcgRIII受体(CD16)表达量情况 |
| 3.6 各组外周血中性粒细胞CD66b表达情况 |
| 3.7 AIS患者不同临床参数对外周血中性粒细胞CD66b表达的影响 |
| 3.8 各组循环中性粒细胞Annexin V表达情况 |
| 3.9AIS患者不同临床参数对外周血中性粒细胞凋亡的影响 |
| 3.10 各组血浆Annexin A1水平 |
| 3.11 AIS患者临床不同参数对血浆Annexin A1水平的影响 |
| 3.12 AIS患者血浆Annexin A1水平与中性粒细胞标志物之间的关系 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 AIS患者外周血中性粒细胞数量和表面标志物的变化及意义 |
| 4.2 AIS危险因素对梗死后循环中性粒细胞的影响 |
| 4.3 AIS患者循环中性粒细胞与炎症消散因子的关系 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）IncRNA在大气颗粒物致儿童血管内皮功能障碍中的标志物研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写说明 |
| 前言 |
| 第一部分 大气颗粒物致儿童血管内皮损伤标志物的改变 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二部分 大气颗粒物致儿童外周血白细胞中lncRNA的改变 |
| 2.1 材料及方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 全文结论 |
| 本研究的创新性 |
| 本研究的局限性 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间参与发表的论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（3）注射用丹参多酚酸对急性缺血性脑卒中患者的保护作用及机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、SLI治疗AIS的临床疗效观察 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 临床资料采集 |
| 1.1.3 试剂与仪器 |
| 1.1.4 化验室指标检测 |
| 1.1.5 ELISA法检测 |
| 1.1.6 统计学方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 入选患者基线特征 |
| 1.2.2 两组患者治疗前后NHISS评分的比较 |
| 1.2.3 两组患者治疗前后化验指标的比较 |
| 1.2.4 两组患者治疗前后mRS评分比较 |
| 1.2.5 两组患者治疗3个月后治疗有效率比较 |
| 1.2.6 两组患者治疗前后血清炎性因子变化的比较 |
| 1.2.7 两组患者治疗前后纤溶功能变化的比较 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 SLI对 AIS炎性反应的保护作用 |
| 1.3.2 SLI对 AIS 凝血纤溶功能紊乱的保护作用 |
| 1.3.3 SLI对 AIS患者临床结局的保护作用 |
| 1.4 小结 |
| 二、HUVECs损伤模型的建立及SLI对血小板功能的影响 |
| 2.1H_2O_2 诱导的HUVECs损伤模型的建立 |
| 2.1.1 对象和方法 |
| 2.1.2 结果 |
| 2.1.3 讨论 |
| 2.1.4 总结 |
| 2.2 SLI主要成分测定 |
| 2.2.1 对象和方法 |
| 2.2.2 结果 |
| 2.2.3 讨论 |
| 2.2.4 总结 |
| 2.3 SLI对血小板功能的影响 |
| 2.3.1 对象和方法 |
| 2.3.2 结果 |
| 2.3.3 讨论 |
| 2.3.4 总结 |
| 三、SLI对H_2O_2 诱导的HUVECs损伤的作用 |
| 3.1 SLI对H_2O_2 诱导的HUVECs损伤模型的抗炎保护作用 |
| 3.1.1 对象和方法 |
| 3.1.2 结果 |
| 3.1.3 讨论 |
| 3.1.4 总结 |
| 3.2 SLI对H_2O_2 诱导的HUVECs损伤模型的纤溶功能保护作用 |
| 3.2.1 对象和方法 |
| 3.2.2 结果 |
| 3.2.3 讨论 |
| 3.2.4 总结 |
| 3.3 SLI对H_2O_2 诱导的HUVECs损伤模型的抗凋亡保护作用 |
| 3.3.1 对象和方法 |
| 3.3.2 结果 |
| 3.3.3 讨论 |
| 3.3.4 总结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 论文局限性 |
| 参考文献 |
| 综述 丹参多酚酸治疗缺血性脑卒中机制的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）血小板微粒在心肌梗死、压力负荷心肌病中的价值（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 血小板微粒与心肌梗死面积相关性研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 钙蛋白酶在心肌梗死中的作用及对血小板微粒的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 血小板微粒在压力负荷心肌病评估中的作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 血小板相关因子在动脉粥样硬化中价值 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）动脉粥样硬化发生发展中的肠道菌群变化及其致病机制（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 第一部分 动脉粥样硬化小鼠病程进展中的肠道菌群表达变化 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 主要实验仪器 |
| 2.3 动物实验方法 |
| 2.4 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 三组小鼠体重及糖脂代谢变化 |
| 3.2 动脉粥样硬化小鼠主动脉斑块形成 |
| 3.3 动脉粥样硬化发展过程中肠道菌群的变化 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 肠道菌群对动脉粥样硬化小鼠血浆细胞因子表达水平的影响及其作用机制 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 四个不同时间点AS小鼠肠道菌群差异物种分析 |
| 3.2 AS小鼠血浆细胞因子水平变化及其与肠道菌群相关性分析 |
| 3.3 AS小鼠差异基因表达的功能学(GO)和相关信号通路(KEGG)分析 |
| 3.4 肠道菌群影响AS小鼠炎症相关病理机制的研究 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 研究创新点、局限性及下一步研究方向 |
| 综述 肠道菌群在动脉粥样硬化疾病发生发展中的作用及研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录表1 114个小鼠粪便样品的16S rDNA测序 |
| 作者简历及在读期间所取得的科研成果 |
（6）Kupffer细胞和肝窦内皮细胞促进肝脏造血及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语说明 |
| 第一部分: 造血干细胞及其造血微环境的研究进展(文献综述) |
| 1 造血干细胞定义 |
| 2 造血干细胞起源与发育 |
| 3 造血干细胞龛 |
| 3.1 成骨细胞 |
| 3.2 血管周围细胞 |
| 3.3 内皮细胞 |
| 3.4 巨噬细胞 |
| 3.5 脂肪细胞 |
| 3.6 巨核细胞 |
| 3.7 造血生长因子 |
| 3.8 造血调控的信号通路 |
| 4 髓外造血 |
| 4.1 髓外造血-脾脏 |
| 4.2 髓外造血-胎肝 |
| 4.3 髓外造血-成年肝脏 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 第二部分: Kupffer细胞促进肝脏造血及其机制研究 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料及试剂 |
| 1.2 相关试剂配制 |
| 1.3 仪器设备 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.5 统计分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 成年肝脏中存在造血干祖细胞 |
| 2.2 成年肝脏中造血干祖细胞具有形成集落的能力 |
| 2.3 成年肝脏LSK细胞能够生成淋巴系和髓系细胞 |
| 2.4 Kupffer细胞促进LPS诱导的肝脏髓外造血 |
| 2.5 Kupffer细胞在体外可以促进肝脏造血干祖细胞分化为T和B淋巴细胞 |
| 2.6 Kupffer细胞促进肝脏造血干祖细胞的增殖 |
| 2.7 Kupffer细胞通过ICAM-1/LFA-1相互作用促进LPS诱导的肝脏造血和淋巴细胞分化 |
| 3 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分: 肝窦内皮细胞促进肝脏造血及其机制研究 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料及试剂 |
| 1.2 相关试剂配制 |
| 1.3 仪器设备 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.5 统计分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 成年肝脏存在独特的lin~-mac-1~+sca-1~+细胞 |
| 2.2 成年肝脏LMS细胞来自于胎肝 |
| 2.3 成年肝脏LMS细胞能够生成淋巴系和髓系细胞 |
| 2.4 肝窦内皮细胞促进肝脏LMS细胞分化成淋巴细胞及髓系细胞 |
| 2.5 肝窦内皮细胞通过Notch信号促进了LMS细胞向T淋巴细胞的分化 |
| 3 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 论文创新点及意义 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 攻读学位期间参加的学术会议及奖励 |
| 外文论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况 |
（7）前列腺癌患者NK细胞活化受体NKG2D及其配体MICA的表达及临床意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 血清可溶性MICA (sMICA)水平对前列腺癌患者预后的价值 |
| 1.1 实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 结论 |
| 1.5 附图和附表 |
| 第二部分 前列腺癌患者NK细胞活化受体NKG2D及其配体MICA表达的相关性 |
| 2.1 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 2.5 附图和附表 |
| 第三部分 重组sMICA蛋白及吉西他滨对NK细胞功能的影响 |
| 3.1 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 3.5 附图和附表 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文Ⅰ |
| 英文论文Ⅱ |
（8）PM2.5诱导的炎性反应对心血管内皮的损伤及分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景和进展 |
| 1.1.1 PM_(2.5)相关心血管疾病的病理生理过程 |
| 1.1.2 PM_(2.5)金属成分的毒性作用研究 |
| 1.1.3 PM_(2.5)心血管疾病的人群研究 |
| 1.1.4 重大活动环境保护在空气污染健康影响研究中的应用 |
| 1.2 研究解决的关键问题及主要思路 |
| 1.3 研究的主要内容 |
| 第二章 PM_(2.5)对心血管疾病死亡影响的时间序列分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 研究现场 |
| 2.1.2 资料收集 |
| 2.1.3 统计学方法 |
| 2.1.4 评价标准 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 描述性分析 |
| 2.2.2 时间序列分析结果描述 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 南京大气污染物的一般水平和特征 |
| 2.3.2 PM_(2.5)对心血管疾病死亡数的影响 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 PM_(2.5)及金属成分对血清金属和心血管内皮炎性损伤相关细胞因子影响的人群重复测量研究 |
| 3.1 研究设计 |
| 3.1.1 设计思路 |
| 3.1.2 青奥会期间污染控制政策 |
| 3.1.3 调查时间 |
| 3.1.4 调查地点 |
| 3.1.5 研究对象 |
| 3.1.6 调查内容 |
| 3.1.7 质量控制 |
| 3.2 南京青奥会期间PM_(2.5)及金属成分浓度变化 |
| 3.2.1 资料收集 |
| 3.2.2 实验材料 |
| 3.2.3 实验方法 |
| 3.2.4 结果 |
| 3.3 PM_(2.5)及金属成分对人血清金属、心血管内皮炎性损伤相关细胞因子的影响 |
| 3.3.1 实验材料 |
| 3.3.2 实验方法 |
| 3.3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 南京青奥会期间PM_(2.5)及金属成分浓度变化 |
| 3.4.2 PM_(2.5)及金属成分对人血清金属、心血管内皮炎性损伤相关细胞因子的影响 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 PM_(2.5)对EA.hy926 细胞毒性及m RNA转录组分析 |
| 4.1 PM_(2.5)对EA.hy926 细胞毒性研究 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.1.3 结果 |
| 4.2 PM_(2.5) 染毒EA.hy926 细胞的MRNA转录组分析 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.3 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 PM_(2.5)对EA.hy926 的一般细胞毒性 |
| 4.3.2 PM_(2.5) 染毒EA.hy926 细胞的mRNA转录组分析 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 NOX1在PM_(2.5)致心血管内皮炎性损伤中的作用 |
| 5.1 体外细胞实验 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.1.3 结果 |
| 5.2 整体动物实验 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.2.3 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 总结 |
| 6.1 主要研究结论 |
| 6.2 主要创新点 |
| 6.3 研究不足 |
| 6.4 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（9）滤泡辅助T细胞及单核/巨噬细胞来源的外泌体在肾移植术后抗体介导的排斥反应中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 CD4+CXCR5+外泌体与肾移植术后ABMR的相关性研究 |
| 一、前言 |
| 二、材料及方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 ABMR患者外周血Tfh来源外泌体对B细胞的影响 |
| 一、前言 |
| 二、材料及方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 单核细胞/巨噬细胞通过外泌体靶向递送HLA-G至内皮细胞 |
| 一、前言 |
| 二、材料及方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 外泌体在免疫应答中的作用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章 |
| 致谢 |
（10）VWF-A2对创伤性脑损伤神经保护作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、人重组VWF-A2蛋白表达、纯化及功能鉴定 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验仪器与设备 |
| 1.1.2 实验试剂与耗材 |
| 1.1.3 实验溶液的配制 |
| 1.1.4 实验方法 |
| 1.1.5 统计分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 VWF-A2蛋白诱导与表达鉴定 |
| 1.2.2 VWF-A2蛋白纯化与鉴定 |
| 1.2.3 VWF-A2蛋白浓度检测 |
| 1.2.4 VWF-A2蛋白功能鉴定 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、VWF-A2减轻TBI后血脑屏障破坏及神经功能损害 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验仪器与设备 |
| 2.1.3 实验试剂与耗材 |
| 2.1.4 实验方法 |
| 2.1.5 统计分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 VWF-A2降低TBI小鼠死亡率,改善神经功能预后 |
| 2.2.2 VWF-A2减少TBI后携带VWF的BDMVs释放 |
| 2.2.3 VWF-A2减轻TBI后血脑屏障渗漏及内皮细胞激活 |
| 2.2.4 VWF-A2减轻TBI后肺组织毛细血管渗漏 |
| 2.2.5 VWF-A2减轻MV介导的体外内皮屏障渗漏及内皮细胞激活 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、VWF-A2减轻TBI后凝血系统功能障碍 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验仪器与设备 |
| 3.1.3 实验试剂与耗材 |
| 3.1.4 实验方法 |
| 3.1.5 统计分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 VWF-A2降低TBI后VWF抗原水平及粘附活性 |
| 3.2.2 VWF-A2减轻TBI后血小板激活及血小板减少症 |
| 3.2.3 VWF-A2减轻TBI后MV介导的凝血功能障碍 |
| 3.2.4 VWF-A2减轻TBI后纤溶系统功能亢进 |
| 3.2.5 VWF-A2减轻TBI后肾脏纤维素沉积 |
| 3.2.6 VWF-A2减轻TBI后出血倾向 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 四、VWF-A2结合并抑制TBI后高活性VWF功能 |
| 4.1 对象和方法 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 实验仪器与设备 |
| 4.1.3 实验试剂与耗材 |
| 4.1.4 实验方法 |
| 4.1.5 统计分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 VWF-A2可在体内、体外与活化的VWF结合 |
| 4.2.2 VWF-A2可与VWF-A1结合 |
| 4.2.3 VWF-A2抑制VWF介导的血小板聚集 |
| 4.2.4 VWF-A2抑制血栓形成 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 创伤性脑损伤相关凝血功能障碍的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、外周血中可溶型P选择素的ELISA检测（论文参考文献）
- [1]影响脑梗死急性期外周血中性粒细胞数量和状态的相关因素分析[D]. 卓拉. 吉林大学, 2021(01)
- [2]IncRNA在大气颗粒物致儿童血管内皮功能障碍中的标志物研究[D]. 许梦梦. 山东大学, 2020
- [3]注射用丹参多酚酸对急性缺血性脑卒中患者的保护作用及机制的研究[D]. 杨南竹. 天津医科大学, 2020(06)
- [4]血小板微粒在心肌梗死、压力负荷心肌病中的价值[D]. 耿小勇. 河北医科大学, 2020(01)
- [5]动脉粥样硬化发生发展中的肠道菌群变化及其致病机制[D]. 李玉串. 浙江大学, 2020(01)
- [6]Kupffer细胞和肝窦内皮细胞促进肝脏造血及其机制研究[D]. 孟德萍. 山东大学, 2019(02)
- [7]前列腺癌患者NK细胞活化受体NKG2D及其配体MICA的表达及临床意义[D]. 刘玉杰. 山东大学, 2019(02)
- [8]PM2.5诱导的炎性反应对心血管内皮的损伤及分子机制研究[D]. 熊丽林. 东南大学, 2019
- [9]滤泡辅助T细胞及单核/巨噬细胞来源的外泌体在肾移植术后抗体介导的排斥反应中的作用及机制研究[D]. 杨锦涛. 中国人民解放军医学院, 2019(02)
- [10]VWF-A2对创伤性脑损伤神经保护作用及机制研究[D]. 徐新. 天津医科大学, 2019(02)