一、人MT-1E融合蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化（论文文献综述）
魏一鸣[1]（2021）在《玉米籽粒发育调控基因ZmNPF7.9和ZmAPP1的克隆与功能分析》文中提出玉米（Zea mays L.）是世界三大重要的粮食作物之一,也是饲料和工业原料的重要来源。而玉米籽粒发育又是产量和品质形成的重要基础,对玉米籽粒发育突变体的研究可以为玉米遗传改良提供理论参考。本研究中,我们从EMS诱变的B73突变体库中筛选了两个玉米籽粒发育突变体nrt1/ptr family 7.9（npf7.9）和a p-loop GTPase protein 1（app1）,并通过图位克隆鉴定到相应的基因,分别命名为Zm NPF7.9和Zm APP1。通过分子生物学、生物化学和遗传学的手段深入解析了这两个基因的功能,主要结果如下:1.Zm NPF7.9基因的克隆与功能分析npf7.9突变体籽粒变小、粒重显着下降。重要的是,突变体植株生长与野生型除了株高略微降低,其它性状无明显差异。遗传分析表明该突变表型为受单个核基因控制的隐性性状。图位克隆结果表明在npf7.9-ref突变体中基因Zm00001d019294发生了单核苷酸突变（G到A）,导致TGC（Cys/C）到TAC（Tyr/Y）密码子转变。同时我们检测了该基因在等位突变体npf7.9-1中的突变情况,发现在基因第四个外显子存在一个G→A的单碱基替换导致翻译提前终止。等位杂交测试进一步证实了Zm NPF7.9的突变是导致表型产生的原因。该基因编码一个NRT1/PTR Family（NPF）家族的硝酸盐转运蛋白,故命名为Zm NPF7.9。ZmNPF7.9基因在玉米胚乳传递细胞层中特异表达,透射电镜观察发现npf7.9突变体胚乳传递细胞发育迟缓,授粉后6天的传递细胞仍没有壁内突的结构,从而影响了玉米籽粒中贮藏物质的积累。利用异源表达爪蟾卵母细胞系统,对注射Zm NPF7.9-c RNA的卵母细胞进行功能分析发现,Zm NPF7.9是一个低亲和力、p H依赖的双向硝酸盐转运体。同时利用玉米原生质体表达Zm NPF7.9-e GFP融合蛋白,发现该蛋白定位于细胞质膜。以上结果表明,Zm NPF7.9在胚乳传递细胞层发挥功能,负责从母体组织向发育中的胚乳运输营养物质。通过检测野生型和npf7.9突变体成熟籽粒中的硝酸盐和淀粉含量发现,npf7.9突变体中硝酸盐及淀粉含量显着降低,这可能是导致npf7.9突变体粒重下降的原因。我们利用转录组学和代谢组学的方法深入解析了npf7.9突变体和野生型在基因表达和代谢水平方面的差异。结果发现在npf7.9突变体中多数与糖酵解/糖异生、碳固定、碳代谢和氨基酸生物合成途径相关的关键基因均显着下调。同时在突变体中脂类和氨基酸等代谢物也显着下调。以上结果表明,Zm NPF7.9通过调节营养物质的运输和代谢,在玉米籽粒发育和粒重中发挥了特定的作用,这可能为玉米遗传改良提供有用的基因资源。2.ZmAPP1基因的克隆与功能分析与野生型相比,app1突变体表现为籽粒变小、种皮皱缩、粒重显着下降的表型。组织学切片实验结果表明,app1突变体胚乳传递细胞层和糊粉层细胞结构分化异常,主要表现为胚乳传递细胞层结构呈不规则的立方体细胞形状,糊粉层细胞排列紊乱。app1突变体中央淀粉胚乳细胞发育迟缓,干物质积累减少。我们还发现app1突变体胚胎发育迟缓,其胚胎尽管可以分化出成熟胚的结构,但不能正常萌发。通过体外胚挽救实验,突变体的胚可以长出幼苗,但幼苗生长缓慢最终死亡。遗传分析表明,app1突变体的表型是受单个核基因控制的隐性性状。对籽粒性状进一步深入分析发现,app1突变体醇溶蛋白及淀粉含量降低、可溶性糖含量升高、碳氮比升高。这些结果表明突变体胚乳细胞发育缺陷导致营养物质积累失衡,从而产生了小籽粒的表型。图位克隆结果表明,基因Zm00001d047046的第一个外显子上发生了一个G→A的转变,该突变导致氨基酸由天冬氨酸转变为天冬酰胺。同时我们利用CRISPR技术获得了Zm APP1敲除的转基因株系并进行等位测验,进一步证实了Zm APP1蛋白的功能缺失导致了籽粒发育缺陷的表型。Zm APP1是一个组成型表达的基因,但在早期的籽粒表达较高,这说明Zm APP1在籽粒的早期发育过程中起关键作用。通过进化树及蛋白序列特征分析发现,Zm APP1含有一个保守GTP结合结构域,属于P-loop GTPase家族的一个成员。体外酶活实验进一步证实了Zm APP1具有GTP水解酶活性。同时利用玉米原生质体表达Zm APP1-e GFP融合蛋白发现APP1编码一个线粒体定位的GTPase。ZmAPP1与枯草芽孢杆菌的YIq F和人类中核糖体组装因子MTG1同源。定量检测发现app1突变体中编码线粒体核糖体蛋白的基因转录本积累,这暗示Zm APP1可能参与了线粒体核糖体的组装。同时我们发现编码电子传递链复合体组分的线粒体基因在app1突变体中转录水平提高。通过进一步检测野生型和app1突变体中线粒体蛋白的表达水平,发现突变体中线粒体蛋白水平存在不同程度地变化。这说明Zm APP1蛋白的突变影响了线粒体内的蛋白稳态平衡。另外我们发现app1突变体中线粒体超级复合体I+III2的丰度及活性均降低,突变体线粒体结构明显受损,没有明显的嵴结构,线粒体内多空腔,导致胚乳中活性氧过量积累,从而促使胚乳细胞程序化死亡提前,这表明Zm APP1通过维持线粒体的结构和功能影响籽粒发育。
刘维妙[2]（2021）在《芸薹属基本种扩展蛋白基因家族的进化分析及花粉发育相关扩展蛋白基因的功能分化研究》文中研究表明花粉发育和授粉受精过程是开花植物完成有性生殖的重要环节。花粉发育异常会影响其功能的正常完成,进而影响后代的繁衍。授粉受精过程的顺利进行离不开花粉管正常的萌发和伸长。花粉管的萌发通常起始于成熟花粉粒的内壁。在花粉管快速伸长的过程中尤其需要细胞壁的快速扩展,众多细胞壁合成和重塑蛋白都参与其中。植物扩展蛋白（expansins,EXP）是一类重要的细胞壁重塑蛋白,可以与细胞壁的多糖组分结合,通过破坏细胞壁组分之间的非共价键引起植物细胞壁的松弛,促进植物细胞的生长。扩展蛋白基因家族被细分为四个亚家族,分别是EXPA（expansin A subfamily,扩展蛋白A亚家族）、EXPB（expansin B subfamily,扩展蛋白B亚家族）、EXLA（expansin like A subfamily,扩展蛋白类A亚家族）和EXLB（expansin like B subfamily,扩展蛋白类B亚家族）。虽然近年来扩展蛋白基因的功能被广泛研究,但是有关扩展蛋白基因在植物生殖发育阶段的功能以及有关EXPA和EXPB亚家族基因协调作用都还鲜有报道。本文以白菜‘矮脚黄’（Brassica campestris ssp.chinensis,syn.B.rapa ssp.chinensis cv.Aijiaohuang）核雄性不育两用系ajhGMS‘Bcajh97-01A/B’和黑芥（B.nigra cv.Z1411-02）以及甘蓝（B.oleracea cv.Jingfeng 1）为材料,对芸薹属三个二倍体基本种的扩展蛋白基因家族进行鉴定、进化和表达分析,明确三个基本种扩展蛋白基因家族的进化特征,为探究扩展蛋白基因在花粉和花粉管发育过程中的功能提供相关基础;由基因家族分析筛选到两个在白菜花粉发育后期和花粉管中高表达的基因BrEXPB4和BrEXPB9,通过人工microRNA技术研究BrEXPB4和BrEXPB9在白菜花粉和花粉管发育中的功能;采用CRISPR/Cas9技术和过表达技术对两者在模式植物拟南芥中的同源基因AtEXPB5进行生物学功能的分析,并对与其在花粉和花粉管发育阶段具有冗余功能的AtEXPA4进行验证;通过酵母单杂交和双荧光素酶实验对AtEXPB5和BrEXPB4/9可能参与的转录调控路径进行研究。取得的主要结果与结论如下:（1）通过三步分析法,鉴定了芸薹属三个基本种（白菜、甘蓝和黑芥）的扩展蛋白基因家族,并经与模式植物拟南芥的系统发育、基因结构和理化特性的比较分析对它们的扩张模式和进化细节进行了研究,发现经过独立的进化,扩展蛋白基因家族在这三个基本种中的相似性较多,而分歧较少。通过比较启动子和编码序列的差异,发现在拟南芥和三个基本种的直系同源物之间存在显着正相关性。随后的表达分析表明这三个物种的扩展蛋白基因家族中存在广泛的功能差异,特别是在生殖发育过程中筛选到两个在白菜花粉和花粉管发育阶段强烈表达的基因BrEXPB4和BrEXPB9。（2）通过烟草和洋葱瞬时表达体系进行亚细胞定位的结果表明,BrEXPB4和BrEXPB9都定位在细胞壁上,这与它们都具有信号肽结构的预测结果一致。通过荧光定量PCR和GUS基因报告系统进行的时空表达分析表明,BrEXPB4和BrEXPB9的表达模式也很相似,都是从单核花粉后期开始表达,并随着花粉的发育,表达量逐步升高,并且可以一直持续到花粉管中。（3）采用人工microRNA技术分别和同时抑制BrEXPB4和BrEXPB9的表达,进而对它们的生物学功能进行鉴定。当它们被单独抑制时,对植株的生长发育并没有造成明显的影响。然而当它们的表达被同时抑制时,却造成约50%的花粉败育,并不能正常萌发。对败育花粉的细致观察显示,花粉的败育起始于单核花粉晚期,进一步使小孢子细胞质和花粉内壁降解,最终造成花粉败育和萌发异常。（4）通过亚细胞定位和时空表达分析,发现AtEXPB5定位在细胞壁上,并且其编码基因在成熟花粉粒和花粉管中强烈表达。然而,无论是敲除AtEXPB5还是过表达AtEXPB5都未对拟南芥的生长发育造成显着影响。结合前人相关电子表达谱的研究,发现仅有AtEXPA4在生殖发育阶段与AtEXPB5具有相似的表达模式。构建了AtEXPA4的敲除和过表达材料,并通过杂交获得AtEXPA4和AtEXPB5的双突变体,观察发现在双突变体中,花粉管伸长的速度显着减缓,并且无论是AtEXPB5还是AtEXPA4都可以恢复双突变体花粉管伸长减缓的表型,说明AtEXPA4和AtEXPB5冗余地参与了花粉管的发育。（5）通过亚细胞定位和时空表达分析,发现AtEXPA4定位在细胞壁上,其编码基因不仅在生殖发育阶段表达,也在拟南芥的根中优势表达。主根长度和根分生区的测量结果表明,AtEXPA4对于主根的生长具有促进作用。（6）通过酵母单杂交和双荧光素酶实验表明,AtEXPB5的表达可由AtTDF1和AtAMS共同激活,而这一调控途径在白菜中并不保守。这说明AtEXPB5和BrEXPB4/9的生物学功能产生分化,并且参与不同的转录调控路径。BrEXPB4/9及其同源基因AtEXPB5在表达模式、功能和调控网络上显示出巨大差异说明在进化过程中,同源基因物也会产生功能和调控的变化。
侯亚男[3]（2021）在《高亮度的单体化远红光与近红外藻胆蛋白荧光探针的研究》文中提出生物组织有一个光学“透明窗口”,这个区域的光谱范围在650-900 nm之间,由于血红蛋白、水、脂质和黑色素等细胞成分在这个区域吸收最小,导致光对组织的穿透力更强,同时该区域还具有较低的自发背景荧光和光散射率,所以发射光谱处于这个区域的荧光蛋白特别适合深层组织成像。目前胆素蛋白已经将荧光蛋白的光谱范围扩展到远红光（FR,650-700 nm）和近红外（NIR,700-770 nm）区域。远红光和近红外区域的荧光蛋白对于生物成像和多重标记非常重要。然而,随着荧光蛋白发射波长的增加,荧光量子产率和荧光强度也会相应的降低,所以在保持近红外区域发射光谱红移的基础上,同时保证荧光蛋白的高亮度和单体状态依旧是个挑战。在远红光光适应的蓝藻中,我们发现了两个藻胆体核心亚基ApcE2和ApcF2,其中ApcE2来自于Synechococcus sp.PCC7335,ApcF2来自于Chroococcidiopsis thermalis sp.PCC7203。我们首先以ApcE2为模板,分子进化出一个可溶的藻胆蛋白,命名为北斗荧光蛋白BDFP3,它与植物光敏色素PФB非共价结合得到BDFP3.1,吸收峰在708 nm,荧光峰在720 nm。其中色素PФB是通过外部添加与BDFP3结合产生荧光的,游离色素PФB可通过先对BDFP3.3酸性尿素变性,再氯仿萃取的方式获得。随后我们将两个BDFP1.1与一个BDFP3进行融合,设计了一个三联嵌合体,命名为BDFP1.1:3.1:1.1,它的发射波长达722 nm,以单体形式存在,在哺乳动物细胞内的有效亮度是i RFP720的2.7倍。其中BDFP1.1是由ApcF2衍生而来,可以共价结合胆绿素BV,荧光峰在710 nm。本实验将BDFP1.1共价结合BV的荧光亮度和BDFP3非共价结合PФB的红移光谱有效结合,利用荧光共振能量转移（FRET）,将BDFP1.1-BV（作为供体）的能量传递给BDFP3.1（作为受体）,从而提高720 nm处的荧光亮度。同时将嵌合体BDFP1.1:3.1:1.1融合不同目的蛋白进行荧光标记,无论在原核细胞还是真核哺乳动物细胞中都能产生明亮的荧光。在BDFP1.1:3.1:1.1三联嵌合体的启发下,紧接着我们又设计了两个新的三联嵌合体,分别是BDFP1.2:3.3:1.2和BDFP1.6:3.3:1.6。它们的发射波长在670 nm,在哺乳动物细胞中表达时荧光亮度极高,而且以单体形式存在。BDFP3.3是由BDFP3非共价结合色素PEB得到的,它是一个明亮的红色荧光蛋白,吸收峰在608 nm,荧光峰在619 nm,且荧光量子产率可达到66%。因为哺乳动物细胞中只存在胆绿素BV,所以在动物细胞中表达时,色素PEB需要外部添加才能与BDFP3结合产生荧光。对于色素PEB的获取,可采用胰蛋白酶水解BDFP3.3的方式来替代色素PEB的萃取。BDFP1.2和BDFP1.6是由ApcF2衍生而来,可共价结合胆绿素BV。对于BDFP1.2:3.3:1.2来说,本实验将BDFP1.2共价结合BV的红移光谱和BDFP3非共价结合PEB的荧光亮度有效结合,利用荧光共振能量转移（FRET）,将BDFP3.3（作为供体）的能量传递给BDFP1.2-BV（作为受体）,从而提高670 nm处的荧光亮度。BDFP1.6:3.3:1.6的设计理念与之相同。BDFP3.3和BDFP1.2/1.6:3.3:1.2/1.6与目的蛋白融合进行荧光标记,可以进行很好的超分辨SIM成像。作为藻胆蛋白荧光探针,首次实现了红光与远红光的双色成像,同时利用嵌合方式增加细胞亮度的方法也为开发更多优良的荧光蛋白提供了新思路。BDFPs是由远红光诱导的蓝藻Chroococcidiopsis thermalis sp.PCC7203的别藻蓝蛋白β亚基ApcF2进化而来的,它们可以共价结合胆绿素BV产生远红光和近红外两种类型的荧光。其中远红光BDFPs的最大发射波长在670 nm,近红外BDFPs的最大发射波长为710 nm。BDFPs具有分子量小、可溶性高且光谱红移等优点,是开发出优良近红外荧光探针的理想模板。以N端缺失20-31aa的BDFP1.2为分子进化模板,我们获得了一个远红光荧光蛋白突变体并得到了解析。它的晶体结构显示一个BV发色团与Cys72和Cys82双共价结合。基于晶体结构,我们进一步优化了一系列新的单体化远红光和近红外荧光蛋白BDFPs,这些新开发的单体化BDFPs比之前报道的远红光和近红外单体荧光蛋白要亮得多,更适合作为荧光探针用于生物标记。
孙红梅[4]（2020）在《桑树（Morus alba）三个干旱诱导基因的表达规律及MaCDSP32基因的功能分析》文中进行了进一步梳理桑树（Morus alba）根系发达,枝繁叶茂,生命力旺盛,具有较强的环境适应性,因此在世界范围内分布广泛。在我国,桑树作为生态防护林选用树种,可起到防沙固土,减少地表径流,保持原生态土壤结构的作用。另一方面,因桑树生长迅速,地上部分生物量大,被应用到自然生态修复系统中,例如修复被重金属污染的土壤、多石的贫瘠荒漠以及戈壁沙漠化区域等。桑树具有顽强的生存能力,源于其所拥有的独特生理特性,近年来在植物遗传学应用领域备受关注,涉及桑树抗逆基因资源挖掘及开发利用等研究。本研究从桑树中克隆得到3个干旱差异表达基因:叶绿体干旱胁迫诱导蛋白编码基因（chloroplast drought-induced stress protein of 32 k Da,Ma CDSP32）,IAA-氨基酸水解酶编码基因（ILR1-5（IAA-amino acid hydrolase ILR1-like 5,Ma ILR1）和抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase,Ma APX2））进行基因克隆、表达分析及基因功能分析,通过对目标序列的生物信息学分析、表达特性分析、转基因植株的抗逆性分析以及在干旱胁迫下的转录组数据分析,实现对目标基因在植物响应环境胁迫条件下分子功能的探索,为在未来以生物技术工程为手段改善植物的环境适应性和在实际生产中发挥桑树品种质资源优势等工作铺垫基石。本研究取得的主要结果如下:1.三个基因的克隆及亚细胞定位桑树中Ma CDSP32、Ma ILR1和Ma APX2基因的编码区长度分别为909 bp、1302 bp和750bp,分别编码303、434和250个氨基酸。预测结果显示,三个编码蛋白的亲水性和稳定性良好。Ma CDSP32编码的蛋白质定位在叶绿体基质中;Ma APX2编码的蛋白酶定位在细胞质内,主要富集在细胞膜和细胞核附近;Ma ILR1编码一个膜蛋白,为分泌型蛋白,定位在细胞膜上。2.三个基因在不同生长条件下的表达模式Ma CDSP32基因主要在桑树成熟叶片中表达,在桑树不同种间具有表达偏好性,但与基因组倍性无关;一天内,Ma CDSP32在15:00时达到表达高峰,呈生物钟节律表达规律;非生物胁迫和外源激素可诱导Ma CDSP32表达水平发生变化,但在叶片和根中表达模式不同。Ma ILR1基因主要在幼叶中表达,在桑树不同种间具有表达偏好性,但与基因组倍性无关;Ma ILR1无明显生物钟表达规律;非生物胁迫和外源激素可诱导Ma ILR1表达水平发生变化,但在叶片和根中表达模式不同。Ma APX2基因在地上部分表达量一致,在桑树不同种间具有表达偏好性,但与基因组倍性无关;一天内,Ma APX2在12:00时达到表达高峰,呈生物钟节律表达规律;非生物胁迫和外源激素可诱导Ma APX2表达水平发生变化,但在叶片和根中表达模式不同。3.Ma CDSP32瞬时表达桑叶的基因功能研究瞬时过表达Ma CDSP32的离体桑叶相比于未转化桑叶,在自然晾干过程中失水量增加。PEG模拟的水分胁迫下,桑叶中Ma MRSB、Ma P5CS、Ma PRX、Makds A、Ma DREB和Ma MAPK基因的表达水平以及ROS的积累量受Ma CDSP32过表达影响发生改变;盐胁迫下,桑叶中Ma WRKY、Makds A、Ma DREB和Ma MAPK基因的表达水平也受到Ma CDSP32过表达影响发生改变。这些结果表明Ma CDSP32会影响胁迫相关基因的表达水平,并参与植物非生物胁迫应答过程。4.Ma CDSP32在转基因烟草中的基因功能研究Ma CDSP32稳定转化烟草获得的转基因株系（OE-2和OE-7）与野生型烟草相比,在自然晾干过程其离体叶片失水量增加。转基因烟草对干旱敏感性增加,叶片中ROS积累和MDA含量增加,多种抗氧化酶活性降低,脯氨酸和可溶性糖积累减少;但复水后转基因植株的生长恢复能力增强,ROS积累减少,MDA含量减少,多种抗氧化酶活性增强,脯氨酸和可溶性糖积累增加。胁迫期间,转基因植株中Nt CAT、Nt ADC2、Nt LEA5和Nt MSRB基因的表达水平相对野生型发生改变。此外,Ma CDSP32通过促进转基因烟草种子和幼苗中Nt MSRB表达上调,减少ROS积累,显着增加了种子在渗透胁迫下的萌发率和幼苗生长。在盐胁迫下,叶绿素含量在Ma CDSP32转基因植株中增加,而在野生型植株中减少。这些结果揭示Ma CDSP32主要是通过参与氧化还原途径调节植物的抗逆性。5.Ma CDSP32在转基因拟南芥中的基因功能研究Ma CDSP32转基因拟南芥株系（OE-3和OE-9）与野生型拟南芥和At CDSP32突变拟南芥株系（mt-1和mt-2）相比,在干旱胁迫期间OE株系萎蔫较严重,ROS积累和MDA含量较多,SOD、POD和APX抗氧化酶活性较低。但OE株系相比野生型和突变体株系,在复水后成活率较高。在干旱和盐胁迫下,植株中不同Ma CDSP32或At CDSP32表达水平会影响At SOD、At POD、At CAT、At PRX、At APX2和At GR基因的表达水平。盐胁迫处理后,突变体株系的叶绿素含量相比野生型和OE株系降低。在渗透胁迫下OE拟南芥种子的萌发率较野生型和突变体种子显着增加。此外,OE拟南芥株系出现早花现象,其中At SOC1基因表达较野生型和突变体显着上调。这些结果表明Ma CDSP32主要是通过参与逆境应答的氧化还原途径影响植物的逆境生理和种子萌发过程,且Ma CDSP32通过影响At SOC1基因表达参与植物开花时间调节。6.Ma CDSP32过表达烟草干旱胁迫转录组学分析转基因烟草的转录组数据分析显示,在干旱处理期间,OE与WT株系差异表达基因主要集中在催化活性、核酸结合转录、转录因子活性、光合作用相关膜组件、糖类代谢进程和肽链内切酶调节因子酶活性等生理过程方面;复水后,OE与WT株系差异表达基因主要集中在高分子生物合成、氮化合物生物合成、催化活性和水解酶活性等生理过程方面。进一步分析发现,这些差异表达基因在苯丙素的生物合成、光合作用-触角蛋白、角质素,软木脂和蜡质的生物合成、核糖体和光合系统的固碳作用等通路中上调基因最多;这些差异表达基因在内质网蛋白加工、半乳糖代谢、倍半萜和三萜生物合成和脂肪酸延伸等通路中下调基因最多。此外,与WT株系相比,OE株系中在半胱氨酸和甲硫氨酸代谢途径、淀粉和糖类代谢途径、油菜素类固醇代谢途径、植物激素信号传导代谢途径和光合元件固碳作用代谢途径,以及抗氧化酶活性、脯氨酸合成代谢和糖合成代谢等方面所涉及的差异表达基因均出现干旱期间下调而复水后上调的变化趋势。推测这些差异表达基因是Ma CDSP32基因在干旱期间和复水后参与调节植物抗旱性相互作用的关键位点。综上,本研究得到的主要结果表明,桑树中的干旱持续表达基因Ma CDSP32通过参与植物抗逆过程中的ROS代谢调节过程,增强了植株的抗旱性,揭示了Ma CDSP32参与提高植物旱后恢复能力的分子机制。这项研究为桑树品种质资源优势的开发利用筛选了基因资源,为以分子生物技术手段改善植物的环境适应性和生存能力提供了新思路。
孙志会[5]（2020）在《沙眼衣原体CT135蛋白表达与功能鉴定》文中研究说明衣原体属家族是专性胞内寄生的革兰氏阴性菌,具有特殊的双相发育周期:具有传染性但无代谢活性的原体（EB）进入宿主细胞,并在其中分化为具有代谢活性的网状体（RB）。目前衣原体主要有三种:鹦鹉热衣原体、肺炎衣原体、沙眼衣原体。本文探究主要针对沙眼衣原体,沙眼衣原体有15个血清型,严重威胁人类健康,感染人多为隐性感染。血清型A-C是导致沙眼和可预防性失明的主要原因。目前虽然我国不是沙眼疫区,但在我国一些贫困地区和国外的非洲地区,其仍然大量传播。血清型D-K主要引起泌尿生殖道的急性和慢性炎症性疾病,可导致不孕或异位妊娠[1]。LGV1-3感染会引起腹股沟淋巴结[2]。沙眼衣原体感染多为隐性感染,若不及时治疗极易引起反复感染,大大提高宫颈癌发病率和HIV的感染风险[3],同时引起盆腔炎、子宫内膜炎、输卵管炎和尿道炎等多种并发症。[4,5]研究发现染色体CT135基因在沙眼衣原体中是一个重要的毒力因子[6],且沙眼衣原体质粒和包涵膜蛋白CT135是雌性小鼠生殖道感染发病机制中的毒力因子。当CT135基因发生无义突变时降低了沙眼衣原体的感染性和毒力[7]。目前尚无其蛋白功能研究的报道,功能研究亟待解决。第一章中,以p ET-32a（+）质粒为骨架,通过PCR扩增、无缝连接的实验技术连接,构建重组质粒WT-NS、WT-CS。考马斯亮蓝染色结果显示,两个重组蛋白都检测不到目的条带,结果提示CT135蛋白在大肠杆菌中表达量低。Western blotting结果显示,两个重组质粒均可表达重组蛋白,C端加有Strep-TagⅡ标签的重组质粒转入表达感受态后成功表达出CT135蛋白,蛋白大小为实际蛋白大小相符,且蛋白表达量随时间先增加后减少;而N端加有Strep-TagⅡ标签的重组质粒转入表达感受态后未检测到目的蛋白。另外做了m RNA的转录,进一步分析融合蛋白是否表达。结果提示N端和C端带有Strep-Tag II标签的重组质粒在大肠杆菌中都有RNA的转录,进而提示二者都有蛋白表达,且RNA水平随时间增加先增加后降低,这也与蛋白表达过程中蛋白量趋于稳定值的结果吻合。上述N端有Strep-Tag II标签的重组质粒一直无法检测到目的蛋白,想要探究具体原因,所以又考虑加构建GST标签的重组质粒。蛋白表达结果显示CT135没有移码时有融合蛋白的表达且大小为66×103左右,当CT135基因发生移码突变时,检测到目的蛋白大小为26×103左右,与实际大小相符,提示了蛋白可以正常表达。蛋白纯化结果显示,CT135蛋白不能大量纯化,究其原因主要是其表达量特别低,具体原因有待进一步探究。GST标签的两个重组质粒都检测到蛋白表达,证实了CT135蛋白编辑过程中N端没有被剪切,N端Strep-Tag II标签时检测不到目的蛋白很可能是标签太小被掩盖无法检测到。RNA结果提示CT135蛋白可能会影响自身RNA转录和自身蛋白翻译。第二章中,构建重组质粒,利用原核系统在大肠杆菌中表达CT135蛋白,首先以p ET-32a（+）质粒为载体,通过Nde I/Xho I双酶切,构建在CT135碳端含有His标签的重组质粒,并以此为基础,构建了氮端逐渐缩短的重组质粒MT1、MT2、MT3和碳端逐渐缩短的重组质粒MT4、MT5、MT6。蛋白表达结果显示,所有重组蛋白都能表达,但是表达量和表达量随时间变化情况都有所不同。WT蛋白大小为40×103,与实际蛋白大小相符,且蛋白表达量随时间先增加后减少,4～5h以后表达量接近本底水平,提示CT135蛋白表达量低且不稳定。而MT1～MT6截短突变体的小蛋白表达量随时间出现不同的变化趋势。其中MT1、MT2、MT4和MT5结果类似,蛋白表达量随着诱导时间增加几乎不变;MT3和MT6蛋白表达量随着时间增加而增加,二者不同的是后者表达量远远大于前者,于是选择MT6蛋白的大量纯化,用制备小鼠抗体。但由于MT6只是一个小蛋白,我们后续实验需要的是全长的CT135蛋白,所以制备出抗体后没有继续进行后续实验,将其分装冻存,进行后续研究。第三章主要是完成第二章中对CT135蛋白是否有毒性的一个初步验证。第二章中,目的蛋白在大肠杆菌中总是不能大量表达,我们怀疑是否当此蛋白大量表达时,就会对累积毒性杀死大肠杆菌或者抑制其生长。所以我们在第二章质粒的基础上构建了Lac I基因移码突变的重组质粒,并进行了涂板,观察结果。结果显示转化BL21（DE3）菌液涂板后空载体对照长势良好,而Lac I基因移码突变后的质粒转化涂板后几乎不长菌落或者只长少许菌落,与Lac I基因正常的板子相比菌落大量减少,结果提示CT135蛋白是有毒性的,且小片段蛋白也有毒性,初步验证了我们的推测,提示在原核细胞中CT135基因确实表达了一个毒性蛋白。第四章主要研究了在真核系统中CT135蛋白的表达情况,首先以pc DNA3.1（-）为载体,构建了含有RFP和CT135基因的七个穿梭质粒GWT、GMT1、GMT2、GMT3、GMT4、GMT5、GMT6,在大肠杆菌中大量制备,而后转染Vero细胞,通过WB和IFA实验观察CT135蛋白的表达情况。结果显示真核系统中,间接免疫荧光检测CT135蛋白能够表达,但不同的片段表达的小蛋白定位不同。不同小蛋白的不同定位为后续进一步研究其功能奠定基础。
杨月[6]（2020）在《穿膜肽TAT介导的河南华溪蟹金属硫蛋白的融合表达与活性研究》文中进行了进一步梳理金属硫蛋白（Metallothionein,MTs）是一类含有丰富的半胱氨酸的金属结合蛋白,能减少自由基对机体的损伤,其在抗衰老,抗氧化,抗肿瘤等过程中发挥着重要影响。本实验室前期成功从河南华溪蟹（Sinopotamon henanense）中克隆出MT cDNA全长并进行了一系列研究。以此为基础,本研究引入人免疫缺陷病毒反式激活因子（Human immunodeficiency virus transactivator,TAT）穿膜肽,旨在制备一种由TAT介导的能够跨膜转导进入生物体细胞的MT,并进一步研究其穿膜活性及对细胞氧化损伤的修复作用。主要研究内容为:首先利用生物信息学软件分析融合蛋白TAT-MT的理化性质及结构的变化;通过PCR技术在目的基因中加入TAT序列,构建pMD19-T-TAT-MT克隆载体和pEXsec1-TAT-MT、pET28a-SUMO-TAT-MT、pET28a-TAT-MT等原核表达载体;表达TAT-MT重组蛋白并用亲和层析方法进行分离纯化;利用免疫荧光技术检测重组融合蛋白TAT-MT的穿膜活性;测定TAT-MT的体外羟自由基清除率及总抗氧化能力;利用MTT实验确定重组蛋白对细胞氧化损伤的修复作用。研究结果如下:1.河南华溪蟹TAT-MT重组融合蛋白的生物信息学分析使用具有默认参数值的一系列在线软件在线分析预测TAT-MT生物信息学信息,结果显示MT是非跨膜蛋白,而TAT穿膜肽具有穿膜活性,所以融合蛋白TAT-MT是跨膜蛋白;融合蛋白的疏水性区域减少,蛋白稳定性降低;并且反式激活蛋白TAT并不改变融合蛋白中MT的二级结构及生物学活性,与His-MT相比,His-TAT-MT的亲水性和极性提高,等电点提高。2.河南华溪蟹TAT-MT重组融合蛋白原核表达载体的构建DNA测序证实,经长引物PCR技术扩增得到的MT、TAT-MT基因片段不存在核苷酸替换、无突变。然后经过常规的分子实验手段构建原核载体,实验表明,重组质粒pET28a-SUMO-TAT-MT、pEXsec1-TAT-MT、pET28a-TAT-MT原核表达载体构建成功。3.河南华溪蟹TAT-MT重组融合蛋白的优化表达与纯化通过对蛋白最佳诱导条件的筛选,结果显示融合蛋白TAT-MT的最适诱导条件为37℃,1mM IPTG、并且诱导8 h后,获得大量可溶性的TAT-MT,其蛋白的分子大小约为20kDa。经过SDS-PAGE实验检测,结果显示目的蛋白纯化效果良好,大部分杂蛋白被成功的去除,并在最佳诱导条件下大量纯化目的蛋白。4.河南华溪蟹TAT-MT重组融合蛋白穿膜作用及体内外活性研究进行体内细胞穿膜实验,通过免疫荧光实验结果可以看出:MT蛋白不能进入细胞内部,而TAT-MT蛋白与293T细胞共孵育之后,进入细胞膜内或者膜上,结果显示TAT具有体内细胞穿膜功能。利用过氧化氢造成细胞损伤,并通过MTT实验确定了融合蛋白对于细胞损伤的修复作用,体外测定TAT-MT具有良好的羟自由基清除率和总抗氧化能力。以上研究结果证明:TAT介导的金属硫蛋白能顺利进入细胞,对293T细胞的氧化损伤具有修复作用,并具有一定的体外抗氧化能力和羟自由基清除率。研究结论如下:本研究通过长引物PCR,成功克隆了TAT-MT基因,成功构建pET28a-SUMO-TAT-MT、pEXsec1-TAT-MT、pET28a-TAT-MT等多个原核表达载体,成功在大肠杆菌中表达TAT-MT重组融合蛋白。通过细胞免疫荧光实验检测了TAT-MT的穿膜作用,MTT实验表明重组蛋白对细胞氧化损伤具有一定的修复作用,体外抗氧化实验表明TAT-MT具有较高的羟自由基清除能力和总抗氧化能力,该研究为金属硫蛋白的进一步开发应用奠定基础。
魏珍珍[7]（2020）在《利用铁蛋白基因融合表达猪瘟病毒E2囊膜蛋白》文中指出“古典猪瘟”（Classical swine fever,CSF）,也被称为猪瘟（Swine fever）,是一种猪之间的高度接触性传染病,对养猪业是一个非常大的威胁。近几年来,该病不仅发病率明显增高,而且流行趋势和流行特点也越发复杂,其持续感染的情况在全世界普遍存在,这使得防控猪瘟的爆发遇到了新的瓶颈期。现有疫苗的预防效果有明显减弱的趋势,如传统的灭活猪瘟疫苗及弱毒（减毒）猪瘟疫苗存在免疫保护期短,毒力返强等缺点,而蛋白源性亚单位疫苗可以很好的解决这些问题。本研究选取具有强免疫原性的猪瘟病毒囊膜蛋白E2作为新型猪瘟疫苗的研究选材。随着交叉学科的发展,生物学与纳米材料技术的交叉渗透正日益增强,其中铁蛋白（Ferritin）自组装纳米颗粒技术引起了人们的关注。铁蛋白可自发组装形成均一、稳定的具有良好生物相容性的蛋白纳米颗粒,也因其独特的24亚基的空间结构,可成为理想的抗原呈递的多聚体纳米颗粒载体。大肠杆菌细胞E.coli（Escherichia coli,E.coli）的p ET表达系统是最常用来表达外源蛋白的,其具有清晰的遗传背景、生产成本低廉、繁殖速度快、表达产物易纯化、可高效表达外源蛋白及应用范围广等特点,但是因为是原核表达系统,所以会缺乏复杂的磷酸化、糖基化以及形成复杂二硫键等的翻译后修饰过程,对某些外源蛋白的正确折叠以及生物活性存在一定影响。本研究对猪瘟囊膜蛋白E2和铁蛋白的基因序列进行优化设计,并通过化学合成得到目的基因序列,利用融合PCR得到E2-Fe,将该基因克隆到p ET28a原核表达载体中,转化到E.coli BL21（DE3）中进行诱导条件的探索及其高效表达,将表达的融合蛋白进行Western-blotting验证、镍柱纯化、质谱及电镜检测。结果显示,融合基因E2-Fe已成功克隆到p ET-28a载体上,0.15%乳糖诱导6 h为融合蛋白表达的最优条件,Western-blotting与质谱图均显示融合蛋白的大小约51 KD与理论值相符,融合蛋白已成功在E.coli中大量表达,电镜观察到的纳米颗粒直径约为20 nm也与理论值相符,即融合铁蛋白的猪瘟病毒囊膜蛋白E2-Fe在大肠杆菌中得到高效表达。将大肠杆菌中表达的融合蛋白E2-Fe经纯化后制样腹腔注射小鼠,两次免疫后,其可诱导机体产生特异性抗体,效价可达1:6400,表明E2-Fe融合蛋白具有良好的免疫原性。杆状病毒-昆虫表达系统是重组蛋白生产的普遍选择。昆虫细胞中的蛋白表达包含翻译后修饰过程,此系统生产的蛋白质复合物以及高蛋白质产量是该真核表达系统的有利特征。后期随着研究的深入与生物技术的不断发展,杆状病毒开始在表面展示系统、基因治疗、疫苗研发等方面应用。在昆虫细胞和哺乳动物细胞中表达外源蛋白时,其糖基化修饰位点是一致的,但两者在修饰时所选用的寡糖种类却不尽相同。相对于哺乳动物细胞,昆虫细胞中相关的糖链加工酶表达量不足或者缺乏,在糖基修饰加工结束后无法合成复合型唾液酸结构,而是终止于寡甘露糖结构。这种寡糖修饰差异导致在昆虫细胞中表达的亚单位疫苗在理论上是不利于生产的,但是不完全加工的N-糖链修饰反而会增强禽流感病毒血凝素（hemagglutinin,HA）病毒样粒子与免疫细胞的亲和力。因此本研究也选择杆状病毒-昆虫表达系统来融合表达目的蛋白以期研制新型猪瘟疫苗。本研究对猪瘟囊膜蛋白E2和铁蛋白的基因序列进行优化设计,并通过化学合成得到目的基因序列,利用融合PCR得到E2-Fe,将融合基因克隆到杆状病毒转移载体p VL1393的多克隆位点中,获得重组载体p VL1393-E2-Fe,将重组转移载体p VL1393-E2-Fe与失活拯救型家蚕杆状病毒（re Bm Bac）共转染家蚕Bm5细胞,获得重组病毒,收集病毒液并感染五龄起家蚕,待家蚕有明显杆状病毒发病迹象后收集蚕血淋巴,随后进行Western-blotting、电镜观察验证。结果显示,重组转移载体p VL1393-E2-Fe测序结果正确,融合基因E2-Fe已成功克隆到p VL1393,且与re Bm Bac共转染家蚕Bm5细胞后获得有感染活性的重组杆状病毒re Bm Bac-E2-Fe;蚕血的Western-blotting图显示融合蛋白的大小约46 KD与理论值相符,融合蛋白已成功在家蚕中表达,而后通过电镜观察到大量直径约为20 nm且分布较为均匀纳米颗粒,也与理论相符,即融合铁蛋白的猪瘟病毒囊膜蛋白E2-Fe在家蚕中得到了高效表达。将含有E2-Fe融合蛋白的蚕血淋巴制样后腹腔注射小鼠,经两次免疫后,可诱导机体产生高滴度的特异性抗体,其效价可高至1:25600,即本研究所得E2-Fe融合蛋白具有较好的免疫原性。以上研究结果均说明融合蛋白在大肠杆菌及家蚕中都可进行高效表达,获得数量可观的纳米颗粒抗原,这为研究新的猪瘟疫苗拓宽了思路。
王琪[8]（2019）在《河南华溪蟹金属硫蛋白串联表达和工程菌富集与耐受重金属的研究》文中指出金属硫蛋白（Metallothionein,MTs）是一类低分子量且富含半胱氨酸的金属结合蛋白,在保持体内必需金属元素平衡以及解除重金属毒性方面起重要作用。本课题组前期从河南华溪蟹（Sinopotamon henanense）中成功克隆出镉诱导的MT cDNA全长。为提高MTs的金属结合效率以及深入研究MTs的金属结合特性,实验采用基因串联方法,利用重叠延伸PCR（SOE-PCR）技术将两个和三个拷贝的蟹MT基因串联整合,生物合成2MT、3MT基因片段;利用SUMO融合表达系统构建pET28a-SUMO-2MT、pET28a-SUMO-3MT重组表达质粒,以增加重组蛋白的稳定性和溶解度;亲和层析纯化得到的融合蛋白SUMO-MT、SUMO-2MT、SUMO-3MT经Tris-HCl缓冲液脱盐、超滤管浓缩,与体外金属再生,紫外光谱扫描检测金属簇吸收峰;最后,采用火焰原子分光光度法检测转MT、2MT、3MT工程菌富集Cu2+、Cd2+、Zn2+重金属离子的能力;通过药敏实验和菌体生长曲线测定,检测转MT、2MT、3MT工程菌对Cu2+、Cd2+、Zn2+重金属离子的耐受能力。研究结果如下:1.河南华溪蟹金属硫蛋白串联表达载体的构建DNA测序证实,经SOE-PCR技术扩增得到的2MT、3MT基因片段不存在核苷酸替换、无突变。实验表明,重组质粒pET28a-SUMO-2MT和pET28a-SUMO-3MT构建成功。2.河南华溪蟹金属硫蛋白串联体的优化表达与纯化实验通过对诱导条件的筛选,优化了SUMO原核表达系统,最终确定融合蛋白SUMO-MT、SUMO-2MT和SUMO-3MT的最适诱导条件分别为37℃,1mM IPTG、30℃,0.7 mM IPTG、30℃,0.7 mM IPTG。诱导8 h后,融合蛋白获得可溶性表达,其分子质量分别约为28 kDa、36 kDa和42 kDa。SDS-PAGE检测结果证明蛋白纯化效果良好,已去除大部分杂蛋白;紫外分光光度计分别在220 nm、245 nm、270 nm波长处检测到了特殊的金属簇吸收峰,证明apo-MT、apo-2MT、apo-3MT具有与Zn、Cd和Cu结合的能力。3.转金属硫蛋白及其串联体工程菌对重金属的富集与耐受火焰原子分光光度计检测结果显示:转MT、2MT、3MT工程菌对Cu、Cd、Zn的富集作用均极显着高于野生菌（P<0.01）,且对重金属的富集强度依次为转3MT工程菌?转2MT工程菌?转MT工程菌?野生菌。转3MT工程菌对Cu、Cd和Zn的生物富集能力分别是野生菌的5.8倍、3.1倍和6.7倍。药敏实验结果显示:与野生菌相比,转MT工程菌、转2MT工程菌和转3MT工程菌对不同浓度的Cu、Cd、Zn均具耐受性,且转3MT工程菌对重金属的耐受能力最强。转工程菌生长曲线测定结果显示:转MT工程菌、转2MT工程菌和转3MT工程菌在不同时间段测定得到OD600数值均明显高于野生菌,在重金属Cu、Cd、Zn的胁迫下,各工程菌的生长繁殖能力依次为:转3MT工程菌?转2MT工程菌?转MT工程菌?野生菌。以上研究结果证明:MTs串联重组体的可溶性表达可显着增强工程菌对Cu、Cd和Zn的富集和耐受。研究结论如下:本研究通过重叠延伸PCR（SOE-PCR）成功串联了两个和三个拷贝的蟹MTs基因,并在大肠杆菌中表达。通过SUMO融合表达系统,增加了重组串联SUMO-MTs的可溶性表达。MTs基因的串联表达显着增强了工程菌对重金属的生物富集能力,同时也显着增强了重组工程菌的金属耐受性。结果表明,转蟹多拷贝金属硫蛋白工程菌可以作为重金属污染生物修复的候选材料。
曹文佳[9]（2019）在《过表达分泌型植物金属硫蛋白增强转基因烟草富集重金属的机理和抗性》文中提出本实验室先前的研究表明,利用酿酒酵母MF-α信号肽和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）及人源金属硫蛋白（MT3）编码序列构建融合基因,在转基因植物中表达重组蛋白MF-α-EGFP-MT3,MF-α可介导EGFP-MT3分泌到植物体外,增加转基因植物对部分重金属的抗性。植物和动物的金属硫蛋白结构不同,水稻拥有庞大的金属硫蛋白基因家族（编码11种金属硫蛋白,OsMTs）,海篷子（Salicornia europaea L.）有耐盐碱、耐金属的超强能力,因此本研究论文尝试利用MF-α的介导作用在转基因植物中过量表达分泌型水稻金属硫蛋白基因OsMT-I-2b和海篷子金属硫蛋白基因SbMT-2。为了便于表达蛋白的检测,将这两个蛋白基因的编码区与报告基因EGFP融合表达,通过生物公司合成SbMT2和OsMT2与EGFP融合基因序列:EGFP-SbMT2和EGFP-OsMT2,利用Gateway技术构建两个含有α因子信号肽（MF-α）的植物表达载体pK-MF-α-EGFP-SbMT2和pK-MF-α-EGFP-OsMT2,转化烟草和天竺葵,获得相应的转基因株系,考察转基因株系对重金属的富集能力和抗性,进而分析过量分泌型金属硫蛋白的作用机理,获得如下研究结果:1、选取基因组PCR检测成功的转基因烟草植株,进行转基因转录水平和蛋白表达水平的检测,结果在转基因植株叶中证实有SbMT2和OsMT2的转录,根、茎及叶片中有EGFP-SbMT2和EGFP-OsMT2融合蛋白的表达。用Cd2+处理转基因植株根系,分析结果说明转基因植物中积累更多的Cd2+,且地上部大于地下部,分泌型金属硫蛋白的表达水平与转基因植物体内不同组织中Cd2+的积累量具有较好的相关性。收集根系处理液及叶片表面水洗液,电化学分析表明转基因根系处理液和叶片表面水洗液中均有EGFP-SbMT2、EGFP-OsMT2蛋白及Cd2+,说明MF-α成功介导金属硫蛋白从根和叶片组织内向外分泌,分泌的金属硫蛋白同时结合Cd2+。通过激光共聚焦扫描显微镜对表达蛋白进行亚细胞定位分析,结果发现转基因植物根毛、叶毛里有GFP荧光,此外在茎和叶脉皮层薄壁细胞的质外体空间也发现GFP荧光,这证实过量表达的EGFP-SbMT2和EGFP-OsMT2蛋白通过叶毛、根毛分泌到植物体外,另一部分会分泌至皮层薄壁细胞的质外体空间。2、用Cd2+（100μmol/L）、Pb2+（15 mg/L）、Cu2+（500μmol/L）分别处理WT和SbMT2、OsMT2转基因烟草植株的根系,考察分泌型金属硫蛋白的过量表达是否可以增强转基因植物对其他重金属的富集和吸收能力。处理一周后发现三种重金属处理的SbMT2、OsMT2转基因烟草植株的生长状况均比WT好,表明分泌型金属硫蛋白基因SbMT2、OsMT2的过量表达可以增强转基因植物对多种重金属的抗性。电化学分析三种重金属的吸收量,结果说明OsMT2转基因烟草植株吸收的Pb2+大于SbMT2植株,而SbMT2转基因植物对Cd2+和Cu2+的吸收效果较好,说明不同的金属硫蛋白对不同重金属离子的结合能力不同,从而使转基因植株对不同重金属具有不同的吸收能力。利用PI和FDA的复合染色分析根尖细胞凋亡情况,结果表明WT植株在Cu2+处理后根尖死亡细胞比SbMT2植株多,转基因SbMT2植物根尖的根冠和分生区死亡细胞虽较多,但在根尖伸长区的死亡细胞明显比WT植株要少,这证实分泌型金属硫蛋白基因SbMT2、OsMT2的过量表达可以增强植物对重金属引起根尖细胞凋亡的抗性。3、为了研究分泌型金属硫蛋白的过量表达增强转基因植物对重金属的富集和吸收机理,分别用Cd2+、Pb2+、Cu2+处理WT、MT3、SbMT2、OsMT2转基因烟草植株的根系,7天后分析光合相关指标的变化,结果说明Cd2+处理三种转基因植株的净光合速率（Pn）、蒸腾速率（E）、气孔导度（C1）及细胞间隙CO2浓度（CO2int）均显着高于WT植株,转基因植株的Pn达到WT的1.52倍,而SbMT2的蒸腾速率（E）为0.2 mmol/m2·s,达到WT的4倍。Pb2+处理烟草一周后,转基因植株的Pn、CO2int均比WT植株高,但是C1和CO2int都显着低于WT。Cu2+处理后三种转基因植株的Pn、E、C1及CO2int变化与Cd2+处理的相似,均显着高于WT植株。收集根茎叶测定不同组织内丙二醛（MDA）和H2O2含量,结果说明转基因植株不同组织中MDA的含量均比WT低23倍,转基因植株叶片中H2O2含量也显着低于WT植株。分析不同抗氧化物酶活性的变化,结果说明Cd2+、Pb2+、Cu2+处理后,转基因植株的POD、SOD、APX及CAT活性均大幅度高于WT植株,SOD、APX及CAT的增加幅度尤为显着。这些结果表明,植物吸收Cd2+、Pb2+、Cu2+在不同组织中富集,导致细胞内产生大量的H2O2、MDA等有害物质,影响气孔的导度,净光合速率和蒸腾作用,产生氧化胁迫和氧化损伤,致使叶片萎黄,茎变黑,根尖细胞死亡。而分泌型金属硫蛋白的过量表达可以通过调控POD、SOD、APX及CAT活性,及时清除Cd2+、Pb2+、Cu2+等重金属积累产生的活性氧,改善转基因植株的光合特性,从而显着增加转基因植物对重金属富集能力和抗性。
孟红恩[10]（2016）在《盐穗木金属硫蛋白HcMT的功能活性分析及转基因植物的研究》文中进行了进一步梳理在植物界广泛存在的金属硫蛋白（Metallothioneins,MTs）是一类可与金属离子结合的、富含半胱氨酸残基（10-30%）的小分子蛋白,可以被众多非生物因素诱导产生,其所具有的强烈的清除自由基和结合重金属离子的能力使其成为植物研究的热点。盐穗木（Halostachys caspica）金属硫蛋白HcMT含有78个氨基酸,其中半胱氨酸数量为14个,理论分子量为7.70 k D,理论等电点为5.05。生物信息学分析结果显示,HcMT符合典型的植物Type 2型MT序列特征,通过MEGA 4.0系统进化树分析与其它一些Type 2型MT进化起源表明,其和海蓬子（Salicornia brachiata）的亲缘关系较近,氨基酸相似性达93%。为研究HcMT的功能活性,将HcMT基因亚克隆至p GEX-6p-2原核表达载体上,在大肠杆菌BL21中表达,分离纯化融白蛋白GST-HcMT,通过原子吸收分光光度法测定GST-HcMT结合金属离子的量以判断其与金属离子的结合能力。结果显示,诱导表达的GST-HcMT分子量在34 k D左右,与预期一致,且通过Western blot进一步得到验证;诱导的同时添加金属离子,分离纯化GST-HcMT与金属离子复合物后,原子吸收结果表明其具有结合Cu2+、Zn2+、Pb2+、Cd2+的能力,结合量分别是对照的25倍、10倍、4倍和2倍,结合能力大小依次是:Cu2+>Cd2+>Zn2+>Pb2+。同时发现,工程菌pGEX-6p-2-HcMT/BL21具有耐受H2O2、NaHCO3、Na2CO3的能力。将其亚克隆至pET32a原核表达载体,E.coli BL21表达后分离纯化融合蛋白Trx A-HcMT,Western blot鉴定其活性。采取与GST-HcMT相同的研究策略,发现Trx A-HcMT与GST-HcMT相比可以特异性的结合更多的金属离子,如Cd2+、Co2+、Cu2+、Fe3+、Mg2+、Pb2+、Zn2+、Hg2+。在Cd2+、Cu2+、Zn2+胁迫下,含pET32a-HcMT/BL21的工程菌繁殖速度明显优于含pET32a/BL21的工程菌。GST-HcMT与Trx A-HcMT的这种差异,可能与标签蛋白中半胱氨酸残基含量相关。为初步探索HcMT工业化生产的可行性,通过单因素实验及20 L发酵罐放大培养优化了影响转盐穗木金属硫蛋白大肠杆菌发酵培养基的成分及其它因素。优化培养基为:每900 m L培养基含蔗糖4 g,酵母浸粉24 g,蛋白胨8 g;每100 m L磷酸缓冲液含KH2PO4 2.31g、K2HPO4?3H2O 12.54 g,两部分分别灭菌后混合。蛋白表达条件为:乳糖6 mmol/L,诱导4 h。通过20 L发酵罐发酵培养,可使菌体量达到2.68 g/L,比摇瓶培养提高了31%,每克干重菌体结合的铜离子达到315.3 mg,比摇瓶培养提高了69%,适宜放大培养。为进一步研究HcMT基因的功能活性及其应用于植物修复的可行性,将HcMT构建至p CAMBIA1301植物表达载体,通过EHA105农杆菌介导浸染烟草。基因组PCR鉴定筛选到转p CAMBIA1301-HcMT烟草阳性植株,转HcMT基因烟草的各种非生物胁迫耐受性以及对不同金属离子的富集情况有待于进一步的研究。
二、人MT-1E融合蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人MT-1E融合蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化（论文提纲范文）
（1）玉米籽粒发育调控基因ZmNPF7.9和ZmAPP1的克隆与功能分析（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 玉米籽粒发育概述 |
| 1.1.1 玉米籽粒的结构 |
| 1.1.2 玉米胚乳的发育 |
| 1.1.2.1 玉米胚乳的发育过程 |
| 1.1.2.2 玉米胚乳基底转移细胞的发育 |
| 1.1.3 玉米胚的发育 |
| 1.1.4 玉米籽粒发育调控 |
| 1.1.4.1 线粒体参与调控玉米籽粒的发育 |
| 1.1.4.2 核糖体生物合成相关基因调控玉米籽粒发育 |
| 1.1.4.3 醇溶蛋白相关基因调控玉米胚乳发育 |
| 1.1.4.4 物质转运相关基因调控玉米籽粒发育 |
| 1.2 硝酸盐转运蛋白家族研究进展 |
| 1.2.1 高等植物中硝酸盐转运蛋白和离子通道分类及生理特性 |
| 1.2.1.1 氮源的重要性 |
| 1.2.1.2 硝酸盐转运体的底物亲和力 |
| 1.2.1.3 硝酸盐转运体的分类 |
| 1.2.2 NRT1/PTR家族(NPF)蛋白的底物特异性 |
| 1.2.2.1 硝酸盐和多肽类转运 |
| 1.2.2.2 氯离子转运 |
| 1.2.2.3 钾离子转运 |
| 1.2.2.4 激素类转运 |
| 1.2.2.5 硫代葡萄糖苷和其他代谢物转运 |
| 1.2.3 硝酸盐转运蛋白的功能 |
| 1.2.3.1 硝酸盐感知/吸收与根系的发育 |
| 1.2.3.2 根-茎运输和硝酸盐分配 |
| 1.2.3.3 种子发育与氮素贮藏 |
| 1.3 GTPase蛋白家族研究进展 |
| 1.3.1 线粒体的结构和功能 |
| 1.3.2 线粒体的氧化磷酸化复合体 |
| 1.3.3 线粒体核糖体的结构 |
| 1.3.4 线粒体核糖体的组装 |
| 1.3.5 线粒体核糖体蛋白功能研究进展 |
| 1.3.6 P-Loop GTPase的结构和分类 |
| 1.3.7 GTPase的功能 |
| 1.4 目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株和载体 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要的仪器设备 |
| 2.1.5 引物合成与DNA测序 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 玉米基因组DNA的提取 |
| 2.2.2 Trizol法提取植物总RNA |
| 2.2.3 RNA的反转录 |
| 2.2.4 实时荧光定量PCR |
| 2.2.4.1 定量引物的设计 |
| 2.2.4.2 荧光定量PCR的反应体系及反应条件 |
| 2.2.5 种子活力检测 |
| 2.2.5.1 TTC染色 |
| 2.2.5.2 胚挽救实验 |
| 2.2.6 玉米籽粒储存蛋白检测 |
| 2.2.6.1 玉米籽粒总蛋白、醇溶蛋白、非醇溶蛋白的抽提 |
| 2.2.6.2 玉米籽粒总蛋白、醇溶蛋白、非醇溶蛋白的SDS-PAGE电泳检测 |
| 2.2.6.3 玉米籽粒总蛋白、醇溶蛋白、非醇溶蛋白的定量检测 |
| 2.2.7 玉米籽粒淀粉含量检测 |
| 2.2.8 玉米籽粒可溶性糖含量检测 |
| 2.2.9 玉米籽粒组织学切片与细胞学观察 |
| 2.2.9.1 材料的固定与包埋 |
| 2.2.9.2 石蜡切片 |
| 2.2.9.3 切片的脱蜡与染色观察 |
| 2.2.10 透射电镜样品制作 |
| 2.2.11 表达载体的构建 |
| 2.2.11.1 引物设计 |
| 2.2.11.2 PCR扩增目的片段 |
| 2.2.11.3 PCR产物回收纯化 |
| 2.2.11.4 酶切、连接反应 |
| 2.2.11.5 连接产物转化 |
| 2.2.11.6 PCR鉴定与测序验证 |
| 2.2.11.7 质粒提取 |
| 2.2.12 农杆菌介导的玉米遗传转化 |
| 2.2.12.1 CRISPR/Cas9表达载体构建 |
| 2.2.12.2 农杆菌EHA105感受态细胞转化 |
| 2.2.12.3 玉米遗传转化 |
| 2.2.13 线粒体复合物提取 |
| 2.2.14 线粒体复合物丰度分析 |
| 2.2.15 线粒体复合物I活性分析 |
| 2.2.16 ROS水平检测 |
| 2.2.16.1 DAB染色 |
| 2.2.16.2 NBT染色 |
| 2.2.16.3 H_2O_2含量测定 |
| 2.2.17 Western blot |
| 2.2.18 亚细胞定位 |
| 2.2.18.1 定位表达载体构建 |
| 2.2.18.2 表达载体质粒大量提取 |
| 2.2.18.3 玉米原生质体的提取与转化 |
| 2.2.19 ZmAPP1蛋白的原核表达与纯化 |
| 2.2.19.1 所需溶液配方 |
| 2.2.19.2 原核蛋白表达 |
| 2.2.19.3 His蛋白的纯化 |
| 2.2.20 ZmAPP1蛋白GTP水解活性测定 |
| 2.2.21 玉米胚乳线粒体分离 |
| 2.2.22 玉米胚乳核糖体分离与检测 |
| 2.2.23 原位杂交 |
| 2.2.23.1 材料的固定与包埋 |
| 2.2.23.2 切片 |
| 2.2.23.3 原位探针合成 |
| 2.2.23.4 原位探针半定量 |
| 2.2.23.5 原位杂交 |
| 2.2.24 硝酸盐含量测定 |
| 2.2.25 异源表达爪蟾卵母细胞实验 |
| 2.2.25.1 电生理实验 |
| 2.2.25.2 爪蟾卵母细胞对~(15)NO_3~-的吸收实验 |
| 2.2.25.3 爪蟾卵母细胞~(15)NO_3~-的动力学吸收实验 |
| 2.2.25.4 硝酸盐外排实验 |
| 2.2.26 转录组测序和数据分析 |
| 2.2.27 代谢组检测和数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 籽粒发育基因ZmNPF7.9的克隆与功能解析 |
| 3.1.1 npf7.9突变体鉴定及表型分析 |
| 3.1.1.1 npf7.9突变体果穗及籽粒表型分析 |
| 3.1.1.2 npf7.9突变体组织学切片分析及细胞形态学观察 |
| 3.1.1.3 npf7.9突变体植株表型分析 |
| 3.1.1.4 npf7.9突变体遗传分析 |
| 3.1.2 ZmNPF7.9基因克隆 |
| 3.1.2.1 粗定位 |
| 3.1.2.2 精细定位 |
| 3.1.2.3 等位测试 |
| 3.1.3 ZmNPF7.9蛋白定位 |
| 3.1.4 ZmNPF7.9基因表达模式分析 |
| 3.1.5 npf7.9胚乳基底传递细胞观察 |
| 3.1.6 电生理实验 |
| 3.1.7 ~(15)N-硝酸盐吸收实验 |
| 3.1.8 ~(15)N-硝酸盐外排实验 |
| 3.1.9 淀粉及硝酸盐含量检测 |
| 3.1.10 RNA-seq数据分析 |
| 3.1.11 代谢组数据分析 |
| 3.2 籽粒发育基因ZmAPP1的克隆与功能解析 |
| 3.2.1 app1突变体鉴定及表型分析 |
| 3.2.1.1 app1突变体果穗及籽粒表型分析 |
| 3.2.1.2 app1突变体遗传分析 |
| 3.2.1.3 app1突变体组织学切片分析及细胞形态学观察 |
| 3.2.1.4 app1突变体籽粒萌发及胚挽救实验 |
| 3.2.2 app1突变体生化成分检测 |
| 3.2.2.1 app1突变体醇溶蛋白检测 |
| 3.2.2.2 app1淀粉含量及可溶性糖检测 |
| 3.2.3 ZmAPP1基因的克隆和等位测试 |
| 3.2.3.1 ZmAPP1粗定位 |
| 3.2.3.3 ZmAPP1精细定位 |
| 3.2.3.4 ZmAPP1CRISPR/Cas9转基因株系鉴定和等位测试 |
| 3.2.4 ZmAPP1蛋白结构、亚细胞定位及表达模式分析 |
| 3.2.4.1 ZmAPP1基因表达模式分析 |
| 3.2.4.2 ZmAPP1蛋白结构分析 |
| 3.2.4.3 ZmAPP1蛋白亚细胞定位 |
| 3.2.5 ZmAPP具有GTP酶水解活性 |
| 3.2.5.1 ZmAPP1蛋白原核表达 |
| 3.2.5.2 ZmAPP1酶活动力学曲线检测 |
| 3.2.6 ZmAPP1可能参与线粒体复合体的组装 |
| 3.2.7 ZmAPP1蛋白影响线粒体功能和超微结构 |
| 3.2.7.1 线粒体基因表达量分析 |
| 3.2.7.2 线粒体蛋白表达分析 |
| 3.2.7.3 线粒体复合体的丰度及活性检测 |
| 3.2.7.4 app1突变体交替氧化酶基因表达量分析 |
| 3.2.7.5 线粒体超微结构观察 |
| 3.2.8 app1突变体细胞程序化死亡提前 |
| 3.2.8.1 app1胚乳中ROS过量积累 |
| 3.2.8.2 app1籽粒的珠心、糊粉层细胞出现严重的DNA损伤 |
| 3.2.9 RNA-seq数据分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 胚乳传递细胞层特异表达基因ZmNPF7.9在玉米籽粒发育过程发挥关键作用 |
| 4.2 ZmNPF7.9可能存在其他潜在的转运底物 |
| 4.3 ZmNPF7.9具有潜在的应用价值 |
| 4.4 ZmAPP1参与线粒体核糖体的组装 |
| 4.5 ZmAPP1影响线粒体功能 |
| 4.6 ZmAPP1蛋白调控玉米籽粒发育 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（2）芸薹属基本种扩展蛋白基因家族的进化分析及花粉发育相关扩展蛋白基因的功能分化研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 植物扩展蛋白基因家族的研究进展 |
| 1.1.1 扩展蛋白的结构特点和起源 |
| 1.1.1.1 扩展蛋白的结构特点 |
| 1.1.1.2 扩展蛋白基因的起源 |
| 1.1.2 不同植物扩展蛋白基因家族成员的比较 |
| 1.1.3 进化过程中扩展蛋白基因亚家族的基因结构和结构域较保守 |
| 1.1.4 扩展蛋白基因在染色体上广泛分布 |
| 1.1.5 染色体片段重复是扩展蛋白基因家族主要扩张模式 |
| 1.1.6 扩展蛋白基因在不同植物组织中的表达丰度不同 |
| 1.2 扩展蛋白在植物生长发育中的作用 |
| 1.2.1 扩展蛋白基因在植物营养生长中的功能 |
| 1.2.1.1 种子萌发 |
| 1.2.1.2 根的生长发育 |
| 1.2.1.3 叶片的生长发育 |
| 1.2.2 扩展蛋白基因在植物生殖生长中的功能和调控 |
| 1.2.2.1 花粉管发育 |
| 1.2.2.2 果实成熟软化 |
| 1.3 花粉内壁的发育和调控 |
| 1.3.1 花粉壁的形成 |
| 1.3.2 花粉内壁发育的调控 |
| 1.3.2.1 参与拟南芥花粉内壁发育的基因及其调控机制 |
| 1.3.2.2 参与水稻花粉内壁发育的基因及其调控机制 |
| 1.4 花粉管的发育和调控 |
| 1.4.1 花粉管壁的组成和发育 |
| 1.4.2 细胞壁组分对花粉管生长的影响 |
| 1.4.2.1 果胶合成 |
| 1.4.2.2 纤维素合成 |
| 1.4.3 花粉管生长过程中细胞壁的重塑 |
| 1.4.3.1 细胞壁扩展蛋白和糖苷酶水解蛋白 |
| 1.4.3.2 阿拉伯半乳糖蛋白 |
| 1.4.3.3 果胶甲酯酶和果胶乙酰化酶 |
| 1.4.4 花粉管细胞壁结构蛋白的信号通路 |
| 1.4.4.1 细胞壁结构蛋白LRXs |
| 1.4.4.2 快速碱化因子家族RALFs |
| 1.4.4.3 类受体激酶CrRLK1Ls——ANX1/2和BUPS1/2 |
| 2 芸薹属三个基本种扩展蛋白基因家族的鉴定和进化分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 植物材料和主要试剂 |
| 2.1.2 扩展蛋白家族成员的鉴定和理化性质预测 |
| 2.1.3 扩展蛋白家族成员系统发育遗传树的构建与结构分析 |
| 2.1.4 扩展蛋白家族基因的染色体分布、共线性和保留率分析 |
| 2.1.5 扩展蛋白家族基因编码序列和启动子的进化分析 |
| 2.1.6 扩展蛋白家族基因的表达分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 芸薹属基本种扩展蛋白基因家族的鉴定 |
| 2.2.2 扩展蛋白基因的系统发育、基因结构和功能域分析 |
| 2.2.3 扩展蛋白基因的染色体分布、复制机制和保留比例 |
| 2.2.4 扩展蛋白基因的编码序列和启动子的进化分析 |
| 2.2.5 扩展蛋白家族成员的表达模式 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 全基因组三倍化后芸薹属三个基本种的扩展蛋白基因家族规模 |
| 2.3.2 芸薹属三个基本种中EXLB亚家族在进化上最为保守 |
| 2.3.3 启动子的变异与扩展蛋白基因的编码序列进化密切相关 |
| 2.3.4 扩展蛋白基因在白菜生殖发育中可能扮演重要的角色 |
| 3 白菜扩展蛋白基因BrEXPB4和BrEXPB9 的表达模式和功能鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 植物材料和主要试剂 |
| 3.1.2 CTAB法提取基因组DNA |
| 3.1.3 总RNA 的提取(试剂盒法)与cDNA 的合成 |
| 3.1.4 BrEXPB4和BrEXPB9 的基因编码序列和启动子序列的扩增 |
| 3.1.5 氨基酸序列的特征分析 |
| 3.1.6 荧光定量PCR分析 |
| 3.1.7 proBrEXPB4::GUS和 proBrEXPB9::GUS融合表达载体的构建 |
| 3.1.8 BrEXPB4::eGFP和 BrEXPB9::eGFP融合表达载体的构建 |
| 3.1.9 人工microRNA(amiRNA)载体的构建 |
| 3.1.9.1 amiRNA序列的设计与合成 |
| 3.1.9.2 p35S::ami REXPB4/9、p35S::amiREXPB4和p35S::ami REXPB9 载体的构建 |
| 3.1.10 proBrEXPB4::GUS和 proBrEXPB9::GUS载体的遗传转化 |
| 3.1.10.1 proBrEXPB4::GUS和 proBrEXPB9::GUS载体浸花法转化野生型拟南芥 |
| 3.1.10.2 阳性转基因拟南芥植株的筛选 |
| 3.1.10.3 阳性植株组织的GUS染色观察 |
| 3.1.11 BrEXPB4和BrEXPB9 的亚细胞定位 |
| 3.1.11.1 利用烟草表皮细胞瞬时转化体系观察目标蛋白的亚细胞定位 |
| 3.1.11.2 利用洋葱表皮细胞瞬时转化体系观察目标蛋白的亚细胞定位 |
| 3.1.12 利用抽真空浸花法将amiRNA载体转化‘油青四九’菜心 |
| 3.1.13 菜心阳性转基因植株的筛选鉴定 |
| 3.1.13.1 转基因菜心基因组DNA的提取 |
| 3.1.13.2 利用PCR对转基因菜心植株进行初次筛选 |
| 3.1.13.3 利用qRT-PCR对转基因菜心植株进行再次筛选 |
| 3.1.14 阳性转基因菜心植株的表型观察 |
| 3.1.14.1 植株的形态学观察和角果长度的统计 |
| 3.1.14.2 花粉的细胞学染色观察 |
| 3.1.14.3 花粉的扫描电镜观察 |
| 3.1.14.4 花粉的半薄切片和透射电镜观察 |
| 3.1.14.5 花粉的体内萌发 |
| 3.1.14.6 花粉的体外萌发 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 成功扩增‘油青四九’菜心中BrEXPB4和BrEXPB9 的编码序列和启动子序列 |
| 3.2.2 BrEXPB4和BrEXPB9 主要在成熟花粉粒和花粉管中表达 |
| 3.2.2.1 BrEXPB4和BrEXPB9 主要在‘Bcajh97-01’的花序、三核花粉期以及授粉受精后优势表达 |
| 3.2.2.2 BrEXPB4和BrEXPB9 从单核晚期花粉中起始表达并持续到花粉管中 |
| 3.2.3 BrEXPB4和BrEXPB9 定位在细胞壁上 |
| 3.2.4 BrEXPB4和BrEXPB9 定位在细胞壁上 |
| 3.2.5 同时抑制BrEXPB4和BrEXPB9 的表达造成花粉和花粉管的发育异常 |
| 3.2.5.1 利用amiRNA技术实现对菜心中BrEXPB4和BrEXPB9 的表达抑制 |
| 3.2.5.2 抑制BrEXPB4和BrEXPB9 的表达不会影响菜心的营养生长和花器官形态 |
| 3.2.5.3 同时抑制BrEXPB4和BrEXPB9 的表达导致花粉败育以及花粉萌发和伸长异常 |
| 3.2.5.4 BrEXPB4/9~(KD)的花粉败育发生在单核花粉晚期,导致花粉内容物含量降低并伴随异常的内壁沉积 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 BrEXPB4和BrEXPB9 具有相似的表达模式和亚细胞定位 |
| 3.3.2 BrEXPB4和BrEXPB9 冗余地参与白菜花粉发育和花粉管萌发 |
| 3.3.3 BrEXPB4和BrEXPB9 通过调控花粉内壁的沉积影响花粉管的萌发 |
| 4 拟南芥EXPA4和EXPB5 的表达模式和功能鉴定 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 植物材料和主要试剂 |
| 4.1.2 CTAB法提取基因组DNA |
| 4.1.3 总RNA 的提取与cDNA 的合成 |
| 4.1.3.1 Trizol法提取总RNA |
| 4.1.3.2 cDNA的合成 |
| 4.1.4 AtEXPA4和AtEXPB5 的基因全长序列、编码序列和启动子序列的扩增 |
| 4.1.5 氨基酸序列的特征分析和启动子顺式作用元件分析 |
| 4.1.6 荧光定量PCR分析 |
| 4.1.7 proAtEXPA4::GUS和 proAtEXPB5::GUS融合表达载体的构建 |
| 4.1.8 AtEXPA4::eGFP和 AtEXPB5::eGFP融合表达载体的构建 |
| 4.1.9 AtEXPA4和AtEXPB5 敲除载体的构建 |
| 4.1.9.1 AtEXPA4和AtEXPB5 sgRNA的设计合成及中间载体的构建 |
| 4.1.9.2 构建以proYAO启动子驱动Cas9 表达的CRISPR/Cas9 载体 |
| 4.1.10 过表达载体proAtEXPA4::EXPA4和proAtEXPB5::EXPB5 的构建 |
| 4.1.11 利用浸花法将各载体转化野生型拟南芥以及T_1代抗性植株的筛选 |
| 4.1.11.1 通过浸花法对拟南芥进行遗传转化 |
| 4.1.11.2 T_1代抗性植株的筛选 |
| 4.1.12 proAtEXPA4::GUS和 proAtEXPB5::GUS植株的筛选和观察 |
| 4.1.13 AtEXPA4和AtEXPB5 的亚细胞定位 |
| 4.1.13.1 利用烟草表皮细胞瞬时转化体系观察目标蛋白的亚细胞定位 |
| 4.1.13.2 利用洋葱表皮细胞瞬时转化体系观察目标蛋白的亚细胞定位 |
| 4.1.14 敲除植株的筛选鉴定 |
| 4.1.14.1 通过PCR检测敲除植株的T-DNA插入情况 |
| 4.1.14.2 敲除植株的基因编辑检测 |
| 4.1.14.3 敲除纯合植株的筛选 |
| 4.1.15 双突变体atexpa4expb5 的获得和F_2代基因分离比的统计 |
| 4.1.16 利用PCR和 qRT-PCR对过表达植株进行筛选和鉴定 |
| 4.1.17 双突变体atexpa4expb5 的回补实验 |
| 4.1.17.1 过表达载体proAtEXPA4::EXPA4和proAtEXPB5::EXPB5对atexpa4expb5 的遗传转化 |
| 4.1.17.2 利用PCR和 qRT-PCR对回补植株进行筛选 |
| 4.1.18 敲除、过表达以及回补植株的表型观察 |
| 4.1.18.1 植株的形态学观察 |
| 4.1.18.2 花粉的细胞学染色观察 |
| 4.1.18.3 花粉的扫描电镜观察 |
| 4.1.18.4 花粉的体内萌发 |
| 4.1.18.5 主根长度和根尖分生区长度的测量与统计 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 AtEXPA4和AtEXPB5 的基因全长序列、编码序列和启动子序列 |
| 4.2.2 AtEXPA4和AtEXPB5 的表达分析 |
| 4.2.3 AtEXPA4和AtEXPB5 定位在细胞壁上 |
| 4.2.4 AtEXPA4和AtEXPB5 突变体、过表达以及回补植株的获得 |
| 4.2.4.1 atexpa4和atexpb5株系T-DNA插入和基因编辑类型的统计 |
| 4.2.4.2 AtEXPA4和AtEXPB5 敲除植株的脱靶检测 |
| 4.2.4.3 通过杂交获得AtEXPA4和AtEXPB5 双突变体atexpa4expab5 |
| 4.2.4.4 导入过表达载体使野生型拟南芥和atexpa4expab5 中相应基因的表达量升高 |
| 4.2.5 AtEXPA4和AtEXPB5 的同时突变使花粉管伸长速度减缓 |
| 4.2.5.1 AtEXPA4和AtEXPB5 的突变和过量表达对植株形态和花粉发育未观察到显着影响 |
| 4.2.5.2 双突变体atexpa4expab5 的花粉管伸长速度减缓 |
| 4.2.5.3 AtEXPA4和AtEXPB5 的突变对花粉的竞争力和配子传递无明显影响 |
| 4.2.6 AtEXPA4或AtEXPB5 都可以恢复atexpa4expab5 花粉管的伸长速度 |
| 4.2.7 AtEXPA4 促进主根的伸长 |
| 4.2.8 AtEXPA4和AtEXPB5 的启动子上顺式作用元件的分布情况 |
| 4.2.9 AtEXPA4和AtEXPB5 的启动子上顺式作用元件的分布情况 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 AtEXPA4和AtEXPB5 冗余地参与花粉管的发育 |
| 4.3.2 AtEXPA4 参与主根的生长发育 |
| 4.3.3 AtEXPA4和AtEXPB5 可能在MYB转录因子的调控下参与花粉管的发育 |
| 5 AtEXPA4和AtEXPB5 与其白菜中的同源基因的功能分化 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 植物材料和主要试剂 |
| 5.1.2 转录因子TDF1、AMS和 MYB结合位点的分析 |
| 5.1.3 酵母单杂交实验 |
| 5.1.3.1 TFs-AD和 proBrEXPB4A-E-AbAi、proBrEXPB9A-C-Ab Ai、pAtEXPB5A-Ab Ai载体的构建 |
| 5.1.3.2 线性化启动子载体并转化Y1H感受态细胞 |
| 5.1.3.3 检测转录因子对目的基因的调控作用 |
| 5.1.4 双荧光素酶实验 |
| 5.1.4.1 报告器载体proBrEXPB4-LUC、proBrEXPB9-LUC、pAtEXPB5A-LUC和效应器载体TFs-SK的构建 |
| 5.1.4.2 效应器和报告器质粒电击法转化农杆菌GV3101(MP90)感受态细胞 |
| 5.1.4.3 效应器和报告器载体瞬时转化烟草叶片并检测荧光强度 |
| 5.1.5 qRT-PCR分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 TDF1和AMS对白菜EXPB4/9 和拟南芥EXPB5 的转录激活分析 |
| 5.2.2 其他转录因子与BrEXPB4和BrEXPB9 的启动子结合分析 |
| 5.2.3 BrEXPA11/19/22 的表达模式及其在BrEXPB4/9~(KD)中的表达分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 AtEXPB5 与其在白菜中的同源基因BrEXPB4和BrEXPB9 产生功能分化 |
| 5.3.2 AtEXPB5和BrEXPB4/9 参与不同的调控路径 |
| 5.3.3 白菜扩展蛋白基因家族在进化过程中产生功能分化 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间发表的论文 |
（3）高亮度的单体化远红光与近红外藻胆蛋白荧光探针的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 序言 |
| 1.1 蓝细菌的光合作用 |
| 1.1.1 藻胆体及其能量传递机制 |
| 1.1.2 藻胆蛋白 |
| 1.1.3 胆色素及其生物合成 |
| 1.1.4 藻胆蛋白的生物合成 |
| 1.1.5 连接蛋白 |
| 1.2 光敏色素 |
| 1.3 荧光蛋白的研究进展 |
| 1.3.1 绿色荧光蛋白家族 |
| 1.3.2 橙红色荧光蛋白家族 |
| 1.3.3 结合胆绿素的近红外荧光蛋白 |
| 1.4 超分辨显微技术 |
| 1.5 本课题研究目的与意义 |
| 2 基于7335ApcE2与7203ApcF2嵌合的近红外荧光探针研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与仪器 |
| 2.2.1 主要材料 |
| 2.2.2 培养基与试剂 |
| 2.2.3 主要实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 定点诱变和缺失诱变 |
| 2.3.2 制备感受态细胞 |
| 2.3.3 蛋白的表达与纯化 |
| 2.3.4 吸收和荧光光谱的测定 |
| 2.3.5 摩尔消光系数、荧光量子产率及分子亮度的测定 |
| 2.3.6 序列比对 |
| 2.3.7 三维结构的模拟 |
| 2.3.8 色素的萃取 |
| 2.3.9 荧光寿命的测定 |
| 2.3.10 融合基因表达质粒的构建 |
| 2.3.11 融合基因标记质粒的构建 |
| 2.3.12 动物细胞的复苏、培养与转染 |
| 2.3.13 荧光蛋白在动物细胞内亮度的测定 |
| 2.3.14 蛋白浓度和色素浓度的测定 |
| 2.3.15 蛋白pH稳定性的测定 |
| 2.3.16 蛋白热稳定性的测定 |
| 2.3.17 蛋白聚集态的体外分析 |
| 2.3.18 蛋白聚集态的体内分析 |
| 2.3.19 正置荧光显微镜对色素蛋白的成像 |
| 2.3.20 蛋白标记细胞的SIM成像 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 由ApcE2进化的可溶性藻胆蛋白BDFP3的获得 |
| 2.4.2 色素PФB制备产量的提高 |
| 2.4.3 7335ApcE2与7203ApcF2三联嵌合体的获得 |
| 2.4.4 BDFP1.1/1.2: BDFP3.1: BDFP1.1/1.2的荧光寿命的研究 |
| 2.4.5 FRET提高融合蛋白在细胞内有效亮度的研究 |
| 2.4.6 融合蛋白聚集态的分析 |
| 2.4.7 融合蛋白稳定性的分析 |
| 2.4.8 融合蛋白在哺乳动物细胞中超分辨成像 |
| 2.5 小结与讨论 |
| 3 基于7335ApcE2与7203ApcF2嵌合的远红光荧光探针研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.2.1 主要材料 |
| 3.2.2 培养基与试剂 |
| 3.2.3 主要实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 蛋白的表达与纯化 |
| 3.3.2 吸收和荧光光谱的测定 |
| 3.3.3 蛋白光谱参数的计算 |
| 3.3.4 圆二色光谱的测定 |
| 3.3.5 荧光寿命的测定 |
| 3.3.6 SDS-PAGE和染色 |
| 3.3.7 融合基因表达质粒的构建 |
| 3.3.8 融合基因标记质粒的构建 |
| 3.3.9 动物细胞的复苏、培养与转染 |
| 3.3.10 细胞内亮度的测定 |
| 3.3.11 蛋白浓度和色素浓度的测定 |
| 3.3.12 色素蛋白的酶解 |
| 3.3.13 蛋白pH和热稳定性的测定 |
| 3.3.14 蛋白聚集态的体外分析 |
| 3.3.15 蛋白聚集态的体内分析 |
| 3.3.16 融合蛋白的SIM超分辨成像 |
| 3.3.17 高分辨率激光共聚焦扫描显微成像 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 可溶性BDFP3非共价结合PEB的研究 |
| 3.4.2 极亮的红色荧光蛋白BDFP3.3的获得 |
| 3.4.3 7335ApcE2与7203ApcF2三联嵌合体的获得 |
| 3.4.4 BDFP1.2/1.6: BDFP3.3: BDFP1.2/1.6的荧光寿命的研究 |
| 3.4.5 FRET提高融合蛋白在细胞内有效亮度的研究 |
| 3.4.6 用BDFP3.3的酶解液代替游离的色素PEB |
| 3.4.7 BDFP3.3及其融合蛋白的聚集态分析 |
| 3.4.8 BDFP3.3及其融合蛋白的稳定性分析 |
| 3.4.9 BDFP3.3及其融合蛋白在哺乳动物细胞中标记成像 |
| 3.5 小结与讨论 |
| 4 基于ApcF2的远红光单体高亮度荧光蛋白的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与仪器 |
| 4.2.1 主要材料 |
| 4.2.2 培养基与试剂 |
| 4.2.3 主要实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 诱变体库的构建方法 |
| 4.3.2 诱变体的蛋白表达与纯化 |
| 4.3.3 诱变体的序列鉴定 |
| 4.3.4 蛋白的聚集态分析 |
| 4.3.5 蛋白的序列比对 |
| 4.3.6 三维结构的模拟 |
| 4.3.7 诱变体的结晶 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 远红光单体BDFPs的随机诱变筛选结果 |
| 4.4.2 诱变体的亮度分析 |
| 4.4.3 诱变体v9的晶体筛选 |
| 4.4.4 诱变体v9的晶体结构的分析 |
| 4.4.5 smURFP晶体结构的分析 |
| 4.4.6 基于诱变体v9晶体结构的BDFPs的优化 |
| 4.5 小结与讨论 |
| 5 论文总结 |
| 5.1 本文小结 |
| 5.2 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（4）桑树（Morus alba）三个干旱诱导基因的表达规律及MaCDSP32基因的功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 干旱对植物生长的影响 |
| 1.2 植物抗旱性的研究进展 |
| 1.2.1 植物的抗旱性与旱后复水恢复生长的调节机制 |
| 1.2.2 植物的抗旱性评价体系及提高植物抗逆性的需求和措施 |
| 1.3 植物非生物胁迫下的氧化还原调节系统 |
| 1.3.1 非生物胁迫对植物氧化还原系统的影响 |
| 1.3.2 非生物胁迫下植物细胞中ROS的产生和代谢 |
| 1.4 植物硫氧还蛋白家族(Trxs)及其广泛作用 |
| 1.4.1 Trxs功能概况 |
| 1.4.2 叶绿体中的Trxs系统 |
| 1.4.3 叶绿体中一种类硫氧还蛋白-CDSP32 |
| 1.5 植物胞质抗坏血酸过氧化物酶(APX)研究进展 |
| 1.6 植物生长素氨基酸水解酶家族(ILR-like)研究进展 |
| 1.7 参与植物抗逆性几种胁迫应答因子的研究进展 |
| 1.7.1 脯氨酸参与抗逆性的研究进展 |
| 1.7.2 甜菜碱参与抗逆性的研究进展 |
| 1.7.3 可溶性糖类参与抗逆性的研究进展 |
| 1.7.4 脱落酸(ABA)参与抗逆性的研究进展 |
| 1.7.5 超氧化物歧化酶(SOD)参与抗逆性的研究进展 |
| 1.8 桑树抗逆性及资源应用研究进展 |
| 1.8.1 古老的桑树物种及其生存能力 |
| 1.8.2 桑树资源应用发展现状 |
| 1.8.3 桑树抗旱性分子机制研究进展 |
| 1.9 本研究前期工作基础和技术依据 |
| 1.9.1 前期工作基础 |
| 1.9.2 技术流程 |
| 第二章 桑树中MaCDSP32、MaILR1和MaAPX2 基因克隆和序列分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 植物材料 |
| 2.2.2 主要仪器设备 |
| 2.2.3 主要试剂及菌株 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 桑树叶片总RNA提取与鉴定 |
| 2.3.2 桑树叶片cDNA合成 |
| 2.3.3 基因克隆 |
| 2.3.4 序列的生物信息学分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 桑树中三个基因编码区克隆及测序 |
| 2.4.2 核酸和氨基酸序列的生物信息学分析 |
| 2.4.3 编码蛋白的系统发育树分析 |
| 2.4.4 GO(Gene ontology)数据库预测目标基因功能 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 MaCDSP32、MaILR1和MaAPX2 的表达模式分析及多克隆抗体制备 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.2.1 植物材料与胁迫处理 |
| 3.2.2 主要试剂耗材及仪器 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 总RNA提取和反转录cDNA |
| 3.3.2 基因定量引物设计 |
| 3.3.3 实时荧光定量qRT-PCR |
| 3.3.4 叶片含水量测定 |
| 3.3.5 脯氨酸含量测定 |
| 3.3.6 原核表达载体的构建 |
| 3.3.7 多克隆抗体制备 |
| 3.3.8 多克隆抗体效价检测 |
| 3.3.9 数据统计分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 基因在桑树地上部分组织的表达规律 |
| 3.4.2 基因在不同桑树品种中的表达规律 |
| 3.4.3 基因在桑树中的生物钟节律表达规律 |
| 3.4.4 盐胁迫对基因表达水平的影响 |
| 3.4.5 高温胁迫对基因表达水平的影响 |
| 3.4.6 水分胁迫对基因表达水平的影响 |
| 3.4.7 施加外源ABA对基因表达水平的影响 |
| 3.4.8 施加外源乙烯利对基因表达水平的影响 |
| 3.4.9 施加外源水杨酸对基因表达水平的影响 |
| 3.4.10 氨基酸序列的抗原性分析 |
| 3.4.11 基因表达与蛋白纯化 |
| 3.4.12 多克隆抗体效价检测 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 MaCDSP32、MaILR1和MaAPX2 的瞬时表达分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 试验材料 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 植物表达载体构建 |
| 4.3.2 重组质粒转化农杆菌 |
| 4.3.3 基因瞬时转化桑叶的处理方式 |
| 4.3.4 qRT-PCR检测基因表达量 |
| 4.3.5 叶片中H_2O_2和O_2~-的含量测定 |
| 4.3.6 转化烟草的亚细胞定位分析 |
| 4.3.7 数据统计分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 基因瞬时转化浸染后离体桑叶的状态 |
| 4.4.2 基因产物的亚细胞定位 |
| 4.4.3 瞬时表达MaCDSP32 基因对离体桑叶持水能力的影响 |
| 4.4.4 MaCDSP32 瞬时表达离体桑叶的自然失水情况 |
| 4.4.5 NaCl胁迫下离体桑叶气孔开度的变化 |
| 4.4.6 PEG胁迫下离体桑叶气孔开度的变化 |
| 4.4.7 PEG处理下胁迫相关基因表达量的变化 |
| 4.4.8 NaCl处理下胁迫相关基因表达量的变化 |
| 4.4.9 基因产物的亚细胞定位确认 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 桑树MaCDSP32 转化烟草的功能研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 试验材料 |
| 5.2.1 植物材料和生长条件 |
| 5.2.2 主要试剂和耗材 |
| 5.2.3 主要仪器 |
| 5.3 试验方法 |
| 5.3.1 叶盘法转化烟草及转基因烟草鉴定 |
| 5.3.2 MaCDSP32 表达产物亚细胞定位 |
| 5.3.3 转基因烟草非生物胁迫处理 |
| 5.3.4 转基因烟草种子萌发和幼苗生长处理 |
| 5.3.5 丙二醛、脯氨酸、可溶性糖和甜菜碱含量测定 |
| 5.3.6 叶片中ROS的组织定位和含量测定 |
| 5.3.7 SOD、APX、POD和 CAT抗氧化酶活性测定 |
| 5.3.8 光合作用气体交换参数测定 |
| 5.3.9 叶绿色素含量测定 |
| 5.3.10 数据统计分析 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 CDSP32序列在桑树和烟草中的同源性比对 |
| 5.4.2 阳性转基因烟草PCR鉴定 |
| 5.4.3 MaCDSP32 表达产物的亚细胞定位 |
| 5.4.4 MaCDSP32 对转基因烟草抗逆性的影响 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 桑树MaCDSP32 转化拟南芥的功能研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 试验材料 |
| 6.2.1 植物材料和生长条件 |
| 6.2.2 主要试剂和耗材 |
| 6.2.3 主要仪器 |
| 6.3 试验方法 |
| 6.3.1 构建MaCDSP32 过表达拟南芥植株 |
| 6.3.2 突变体拟南芥T-DNA插入鉴定 |
| 6.3.3 转基因拟南芥种子胁迫处理 |
| 6.3.4 转基因拟南芥植株非生物胁迫处理 |
| 6.3.5 生理生化指标测定 |
| 6.3.6 拟南芥叶片气孔开度测量 |
| 6.3.7 数据统计分析 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 MaCDSP32和AtCDSP32 序列同源性分析 |
| 6.4.2 AtCDSP32 突变体拟南芥植株鉴定 |
| 6.4.3 转基因拟南芥株系在非生物胁迫下的抗逆性分析 |
| 6.4.4 干旱胁迫对转基因拟南芥气孔开度的影响 |
| 6.4.5 非生物胁迫对转基因拟南芥抗氧化物酶活性的影响 |
| 6.4.6 非生物胁迫对拟南芥抗氧化物酶编码基因表达量的影响 |
| 6.4.7 渗透胁迫对拟南芥种子萌发及幼苗生长的影响 |
| 6.4.8 MaCDSP32 过表达拟南芥植株的早花现象 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 MaCDSP32 转基因烟草干旱胁迫转录组数据分析 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 试验材料 |
| 7.2.1 植物材料 |
| 7.2.2 胁迫处理方式及取样 |
| 7.3 试验方法 |
| 7.3.1 样品转录组文库构建 |
| 7.3.2 上机测序 |
| 7.3.3 信息分析流程 |
| 7.4 结果与分析 |
| 7.4.1 OE和WT烟草干旱样品转录组数据总体分析 |
| 7.4.2 OE和WT烟草干旱转录组样品差异表达基因分析 |
| 7.4.3 OE和WT烟草干旱转录组差异表达基因维恩图 |
| 7.4.4 OE和WT烟草干旱转录组差异表达基因聚类热图 |
| 7.4.5 OE和WT烟草干旱差异表达基因GO富集分析 |
| 7.4.6 OE和WT烟草复水差异表达基因KEGG通路分析 |
| 7.4.7 半胱氨酸和甲硫氨酸代谢途径差异基因KEGG通路分析 |
| 7.4.8 淀粉和糖代谢途径差异基因KEGG通路分析 |
| 7.4.9 油菜素类固醇代谢途径差异基因KEGG通路分析 |
| 7.4.10 植物激素信号传导代谢途径差异基因KEGG通路分析 |
| 7.4.11 光合元件固碳作用代谢途径差异基因KEGG通路分析 |
| 7.4.12 硫代谢途径差异基因KEGG通路分析 |
| 7.5 干旱和复水相反生理参数涉及差异表达基因GO富集分析 |
| 7.6 小结 |
| 第八章 结论 |
| 8.1 本研究总结 |
| 8.2 本研究创新点 |
| 8.3 有待进一步研究的问题 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）沙眼衣原体CT135蛋白表达与功能鉴定（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 Strep-Tag Ⅱ标签的CT135 重组质粒的构建及蛋白表达 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株、细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 主要试剂的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 质粒构建 |
| 2.2 蛋白表达 |
| 2.3 蛋白纯化 |
| 2.4 检测mRNA |
| 2.5 构建GST标签的重组质粒 |
| 3 结果 |
| 3.1 CT135基因序列分析和跨膜区预测结果 |
| 3.2 质粒构建结果 |
| 3.3 蛋白表达结果 |
| 3.4 mRNA检测结果 |
| 3.5 蛋白纯化结果 |
| 3.6 GST标签的蛋白表达和mRNA检测结果 |
| 4 讨论 |
| 第二章 CT135重组质粒以及截短突变体的蛋白表达和抗血清制备 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株、细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 主要试剂的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 质粒构建 |
| 2.2 蛋白表达 |
| 3 结果 |
| 3.1 质粒构建结果 |
| 3.2 蛋白表达结果 |
| 3.3 多克隆抗体制备及检测 |
| 4 讨论 |
| 第三章 沙眼衣原体CT135蛋白对大肠杆菌生长的影响 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株、细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 主要试剂的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 质粒构建 |
| 2.2 涂板 |
| 2.3 鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 质粒构建结果 |
| 3.2 转化感受态涂板结果 |
| 3.3 鉴定结果 |
| 4 讨论 |
| 第四章 沙眼衣原体CT135在真核细胞中的蛋白表达 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株、细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 主要试剂的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 质粒构建 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 间接免疫荧光实验 |
| 3 结果 |
| 3.1 质粒构建结果 |
| 3.2 IFA实验结果 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
（6）穿膜肽TAT介导的河南华溪蟹金属硫蛋白的融合表达与活性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 综述 |
| 1 金属硫蛋白概述 |
| 1.1 金属硫蛋白的理化特性 |
| 1.2 金属硫蛋白的生理功能 |
| 2 细胞穿膜肽概述 |
| 2.1 HIV-TAT穿膜肽的结构 |
| 2.2 TAT蛋白穿膜的机制 |
| 2.3 TAT蛋白的应用 |
| 3 重组蛋白表达系统的选择 |
| 4 本论文的研究目的及意义 |
| 第二章 河南华溪蟹TAT-MT重组融合蛋白的生物信息学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 TAT-MT融合蛋白理化性质分析 |
| 2.2 TAT-MT融合蛋白亲水性/疏水性预测与分析 |
| 2.3 TAT-MT融合蛋白跨膜区预测与分析 |
| 2.4 TAT-MT融合蛋白二级结构预测与分析 |
| 2.5 TAT-MT融合蛋白三级结构预测与分析 |
| 3 讨论 |
| 第三章 河南华溪蟹TAT-MT融合蛋白表达载体的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 长引物PCR扩增TAT-MT、MT基因 |
| 2.2 克隆载体的构建 |
| 2.3 原核表达载体pET28a-SUMO-MT、pET28a-SUMO-TAT-MT的构建 |
| 2.4 原核表达载体pEXsec1-TAT-MT、pET28a-TAT-MT的构建 |
| 3 讨论 |
| 第四章 河南华溪蟹TAT-MT融合蛋白的优化表达与纯化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组SUMO-MT、SUMO-TAT-MT、TAT-MT诱导表达条件的优化 |
| 2.2 重组TAT-MT融合蛋白的纯化 |
| 3 讨论 |
| 第五章 TAT-MT的细胞膜穿透作用及活性检测 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 TAT介导的金属硫蛋白的细胞穿膜能力 |
| 2.2 TAT介导的金属硫蛋白对细胞氧化损伤的修复作用 |
| 2.3 TAT介导的金属硫蛋白羟自由基清除率的测定 |
| 2.4 TAT介导的金属硫蛋白总抗氧化能力(T-AOC)的测定 |
| 3 讨论 |
| 第六章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简况及联系方式 |
（7）利用铁蛋白基因融合表达猪瘟病毒E2囊膜蛋白（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 猪瘟疫苗的研究现况 |
| 1.1.1 猪瘟病毒 |
| 1.1.2 猪瘟病毒的致病机理 |
| 1.1.3 猪瘟疫苗的现况 |
| 1.2 铁蛋白 |
| 1.2.1 铁蛋白的结构及其修饰 |
| 1.2.2 重组铁蛋白的人工制备 |
| 1.2.3 铁蛋白纳米颗粒的应用 |
| 1.3 大肠杆菌表达系统 |
| 1.3.1 大肠杆菌的遗传背景 |
| 1.3.2 优化大肠杆菌表达系统的方法 |
| 1.4 杆状病毒表达系统 |
| 1.4.1 杆状病毒 |
| 1.4.2 杆状病毒表达系统 |
| 1.4.3 杆状病毒表达系统研究现状 |
| 1.4.4 杆状病毒表达系统的应用 |
| 1.5 研究内容和意义 |
| 1.5.1 研究的主要内容 |
| 1.5.2 研究目的及意义 |
| 第2章 E2-Fe融合蛋白在大肠杆菌中的表达 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验材料和试剂 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 常用试剂的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 猪瘟囊膜蛋白E2基因及铁基因的获取 |
| 2.2.2 重组表达质粒p ET28a-E2-Fe及基因工程菌的构建 |
| 2.2.3 核酸快速抽提法粗筛阳性克隆 |
| 2.2.4 蛋白E2及融合蛋白E2-Fe在大肠杆菌中的表达及纯化 |
| 2.2.5 制备小鼠多克隆抗体 |
| 2.2.6 ELISA法检测小鼠血清抗体效力 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.3.1 构建原核表达质粒p ET28a-E2-Fe及基因工程菌的构建 |
| 2.3.2 E2-Fe融合蛋白在E.coli BL21 中的表达鉴定及其表达量的条件优化 |
| 2.3.3 E2-Fe融合蛋白的纯化及电镜观察 |
| 2.3.4 小鼠血清抗体效价检测 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 总结 |
| 第3章 重组融合蛋白E2-Fe在家蚕中表达 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验材料及试剂 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 猪瘟囊膜蛋白E2基因及铁蛋白基因的获取及合成融合基因E2-Fe |
| 3.2.2 构建重组杆状病毒转移载体p VL1393-E2-Fe |
| 3.2.3 构建重组杆状病毒r Bm Bac-E2-Fe及在家蚕中表达 |
| 3.2.4 制备小鼠多克隆抗体 |
| 3.2.5 ELISA法小鼠血清抗体效力检测 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 鉴定重组转移载体的构建 |
| 3.3.2 构建重组杆状病毒 |
| 3.3.3 在家蚕生物反应器中表达融合蛋白 |
| 3.3.4 重组杆状病毒侵染家蚕后融合蛋白E2-Fe表达的鉴定 |
| 3.3.5 E2-Fe融合蛋白的纯化及电镜观察 |
| 3.3.6 小鼠血清抗体效价检测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 总结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 1 |
| 附录 2 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 致谢 |
（8）河南华溪蟹金属硫蛋白串联表达和工程菌富集与耐受重金属的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 综述 |
| 1 金属硫蛋白概述 |
| 1.1 金属硫蛋白的理化特性 |
| 1.2 金属硫蛋白的生理功能 |
| 1.3 无脊椎动物金属硫蛋白的研究进展 |
| 2 重金属污染生物修复技术概述 |
| 3 金属硫蛋白生物富集重金属能力的研究进展 |
| 4 基因串联技术概述 |
| 5 本论文的研究目的及意义 |
| 第二章 河南华溪蟹金属硫蛋白串联表达载体的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 SOE-PCR扩增2MT、3MT融合基因 |
| 2.2 原核表达载体pET28a-SUMO-2MT、pET28a-SUMO-3MT的构建 |
| 3 讨论 |
| 第三章 河南华溪蟹金属硫蛋白串联体的优化表达与纯化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组SUMO-2MT、SUMO-3MT诱导表达条件的优化 |
| 2.2 重组SUMO-MT、SUMO-2MT、SUMO-3MT融合蛋白的纯化及鉴定 |
| 3 讨论 |
| 第四章 转金属硫蛋白及其串联体工程菌对重金属的富集与耐受 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 转金属硫蛋白及其串联体工程菌对重金属的富集 |
| 2.2 转金属硫蛋白及其串联体工程菌对重金属的耐受 |
| 3 讨论 |
| 3.1 转 MT 串联体工程菌对重金属的生物富集作用 |
| 3.2 转 MT 串联体工程菌对重金属的金属耐受作用 |
| 第五章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简况及联系方式 |
（9）过表达分泌型植物金属硫蛋白增强转基因烟草富集重金属的机理和抗性（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 重金属污染的现状及治理 |
| 1.1.1 重金属污染现状 |
| 1.1.2 重金属污染的治理方法 |
| 1.1.3 重金属污染对植物生长和人体健康的影响 |
| 1.2 植物对重金属富集机制的研究进展 |
| 1.2.1 植物对土壤中重金属的活化机制 |
| 1.2.2 植物对镉的富集机制 |
| 1.2.3 植物对铅的富集机制 |
| 1.2.4 植物对铜的富集机制 |
| 1.3 金属硫蛋白 |
| 1.3.1 金属硫蛋白概况 |
| 1.3.2 植物金属硫蛋白的分类及空间结构 |
| 1.3.3 植物金属硫蛋白在重金属富集中的功能及机理 |
| 1.4 金属硫蛋白基因工程研究进展 |
| 1.4.1 动物金属硫蛋白基因工程研究进展 |
| 1.4.2 植物金属硫蛋白基因工程研究进展 |
| 第二章 植物分泌型金属硫蛋白基因SbMT2和OsMT2 过表达载体的构建 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 菌株及载体 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 培养基的配制 |
| 2.1.4 实验中常用的抗生素 |
| 2.1.5 植物材料的培养 |
| 2.1.6 植物表达载体pK-35S-MF-α-EGFP-SbMT2/OsMT2 的构建 |
| 2.1.7 野生型烟草和天竺葵的转化 |
| 2.1.8 基因组PCR |
| 2.1.9 转基因烟草SbMT2、OsMT2 转录水平检测 |
| 2.1.10 植物样品中镉含量的测定 |
| 2.1.11 植物样品中MF-α-EGFP-SbMT2/OsMT2 蛋白的测定 |
| 2.1.12 激光共聚焦显微镜观察转基因烟草 |
| 2.2 结果分析 |
| 2.2.1 植物表达载体pK-35S-MF-α-EGFP-SbMT2/OsMT2 的分子检测 |
| 2.2.2 转基因烟草和天竺葵的筛选和分子检测 |
| 2.2.3 转基因烟草SbMT2、OsMT2 转录水平检测 |
| 2.2.4 镉胁迫下分泌型金属硫蛋白MF-α-EGFP-SbMT2/OsMT2 的测定 |
| 2.2.5 镉胁迫下镉含量与分泌型金属硫蛋白的相关性 |
| 2.2.6 转基因烟草MF-α-EGFP-SbMT2、MF-α-EGFP-OsMT2的亚细胞定位 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 转基因烟草对重金属镉、铅和铜胁迫的富集和抗性分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 植物材料的培养 |
| 3.1.2 烟草植株的镉、铅和铜的胁迫处理 |
| 3.1.3 植物样品中镉含量的测定 |
| 3.1.4 培养液中铅含量的测定 |
| 3.1.5 培养液中铜含量的测定 |
| 3.1.6 植物样品的PI染色 |
| 3.2 结果分析 |
| 3.2.1 镉、铅、铜胁迫处理对烟草生长的影响 |
| 3.2.2 烟草植物对镉、铅、铜离子的吸收 |
| 3.2.3 胁迫对烟草根细胞凋亡的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 分泌型金属硫蛋白在转基因烟草重金属胁迫下的作用机理研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 植物材料的培养 |
| 4.1.2 不同重金属离子对烟草植株的处理 |
| 4.1.3 烟草叶片光合指标的测定 |
| 4.1.4 烟草叶片MDA和 H2O2 含量测定 |
| 4.1.5 烟草叶片抗氧化物酶活性测定 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 重金属镉胁迫转基因植物后对光合指标的影响 |
| 4.2.2 重金属铅胁迫转基因植物后对光合指标的影响 |
| 4.2.3 重金属铜胁迫转基因植物后对光合指标的影响 |
| 4.2.4 重金属镉、铅和铜胁迫处理对转基因烟草MDA和 H2O2的影响 |
| 4.2.5 重金属镉、铅和铜胁迫处理对转基因烟草POD活性的影响 |
| 4.2.6 重金属镉、铅和铜胁迫处理对转基因烟草SOD活性的影响 |
| 4.2.7 重金属镉、铅和铜胁迫处理对转基因烟草APX活性的影响 |
| 4.2.8 重金属镉、铅和铜胁迫处理对转基因烟草CAT活性的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 总结与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（10）盐穗木金属硫蛋白HcMT的功能活性分析及转基因植物的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 植物金属硫蛋白的研究进展 |
| 1.植物MTs的分类及一般特征 |
| 2.植物MTs基因的结构及其表达调控 |
| 3.植物MTs的结构特征 |
| 4.植物金属硫蛋白的功能及其应用 |
| 4.1 自由基清除 |
| 4.2 参与金属离子的供给与运输 |
| 4.3 解除重金属离子毒害与植物修复 |
| 5.植物MT的分离纯化及检测方法 |
| 5.1 植物MT的分离纯化 |
| 5.2 植物MT的检测方法 |
| 6.展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 |
| 第一章 盐穗木金属硫蛋白HcMT在大肠杆菌中高效表达及功能活性分析 |
| 第一节 HcMT基因在pGEX-6p-2 原核表达体系中的研究 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二节 HcMT基因在pET-32a原核表达体系中的研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 盐穗木金属硫蛋白发酵条件的优化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 碳源及其浓度对重组菌生长的影响 |
| 2.2 酵母粉浓度对重组大肠杆菌生长的影响 |
| 2.3 蛋白胨浓度对重组大肠杆菌生长的影响 |
| 2.4 磷酸盐浓度对重组大肠杆菌生长的影响 |
| 2.5 优化后培养基的验证 |
| 2.6 乳糖浓度对重组大肠杆菌表达重组蛋白的影响 |
| 2.7 乳糖不同诱导时间重组蛋白表达情况 |
| 2.8 20L发酵罐的放大培养 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 盐穗木HcMT基因植物表达载体的构建及对烟草的转化 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 植物材料 |
| 1.1.2 质粒和菌株 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 培养基 |
| 1.1.5 实验引物 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 HcMT植物表达载体的构建 |
| 1.2.3 根瘤农杆菌的转化 |
| 1.2.4 目的基因转化烟草 |
| 1.2.5 转基因植株的筛选 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组质粒pCAMBIA1301-HcMT的构建及其转化农杆菌的鉴定 |
| 2.2 pCAMBIA1301-HcMT转基因植株的鉴定 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 结论与展望 |
| 结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、人MT-1E融合蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化（论文参考文献）
- [1]玉米籽粒发育调控基因ZmNPF7.9和ZmAPP1的克隆与功能分析[D]. 魏一鸣. 山东农业大学, 2021
- [2]芸薹属基本种扩展蛋白基因家族的进化分析及花粉发育相关扩展蛋白基因的功能分化研究[D]. 刘维妙. 浙江大学, 2021(01)
- [3]高亮度的单体化远红光与近红外藻胆蛋白荧光探针的研究[D]. 侯亚男. 华中农业大学, 2021(02)
- [4]桑树（Morus alba）三个干旱诱导基因的表达规律及MaCDSP32基因的功能分析[D]. 孙红梅. 西北农林科技大学, 2020
- [5]沙眼衣原体CT135蛋白表达与功能鉴定[D]. 孙志会. 军事科学院, 2020(02)
- [6]穿膜肽TAT介导的河南华溪蟹金属硫蛋白的融合表达与活性研究[D]. 杨月. 山西大学, 2020(01)
- [7]利用铁蛋白基因融合表达猪瘟病毒E2囊膜蛋白[D]. 魏珍珍. 江苏科技大学, 2020(03)
- [8]河南华溪蟹金属硫蛋白串联表达和工程菌富集与耐受重金属的研究[D]. 王琪. 山西大学, 2019(01)
- [9]过表达分泌型植物金属硫蛋白增强转基因烟草富集重金属的机理和抗性[D]. 曹文佳. 昆明理工大学, 2019(04)
- [10]盐穗木金属硫蛋白HcMT的功能活性分析及转基因植物的研究[D]. 孟红恩. 新疆大学, 2016(06)