一、人成骨蛋白成熟肽基因在毕氏酵母(Pichia Yeast)中的高效表达（论文文献综述）
郑彬琼[1]（2009）在《hBMP-4在毕赤酵母中的表达、纯化、活性鉴定及二聚体化研究》文中提出骨形态发生蛋白（Bone Morphogenetic Proteins,BMPs）是一类蛋白质生长因子,属于TGF-β超家族。BMP4又称骨形态发生蛋白2B,具有常位/异位诱骨能力,而且具有明显的促进细胞组织再生的作用,在某些情况下也可以修复软骨、肌腱和韧带,在骨科临床上有很高的应用价值。本研究尝试利用已被广泛应用的巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）真核表达系统表达hBMP-4,探讨在此表达系统中能否获得具有生物活性的rhBMP-4,研究能否获得二聚体结构的rhBMP-4。主要的研究工作包括:①在已经获得整合有编码hBMP-4成熟肽cDNA（全序列优化）重组菌株的基础上进行高密度发酵,实验结果表明高密度发酵rhBMP-4的表达量约是小量摇瓶发酵的5倍。②发酵上清液经过SP阳离子凝胶层析柱、肝素亲和凝胶层析柱两步纯化后的样品纯度达到90.3%。将纯化后的样品用Endo Hf糖基化酶处理后经SDS-PAGE和WESTERN-BLOT分析表明rhBMP-4存在高度糖基化的现象,去糖基化后的分子量约为13KD说明rhBMP-4是单聚体的结构。④通过小鼠股部肌袋包埋实验和碱性磷酸酶活性测定实验证明纯化后的rhBMP-4具有生物活性。⑤利用pfuDNA聚合酶扩增hBMP-4的全长cDNA,构建p-hBMP-4/full表达载体,该表达载体电转化毕赤酵母GS115,PCR筛选阳性重组子后进行摇瓶表达目的蛋白的实验,发酵产物经还原和非还原处理后经SDS-PAGE和WESTERN-BLOT分析表明部分rhBMP-4以二聚体的形式分泌到胞外。
刘蕾[2]（2007）在《人骨形态发生蛋白-7成熟肽的表达及其生物学活性的初步研究》文中认为骨形态发生蛋白（Bone morphogenetic proteins，BMPs）是一种多功能蛋白，是转化生长因子（transforming growth factor-beta，TGF-β）超家族成员之一，为目前发现的一类具有异位成骨能力的细胞因子，它能刺激间充质细胞向成骨细胞分化。人骨形态发生蛋白-7（hBMP-7）又称为成骨蛋白-1（Osteogenic Protein-1，OP-1），由于其具有较强的骨诱导能力而受到人们广泛关注。它与Ⅰ型胶原蛋白的缓释体移入骨干缺损部位，会导致有功能的新骨形成，显示出应用于骨与关节及软骨缺损修复的前景。而且同时对神经系统、造血系统的分化发育也有调控作用。hBMP-7基因编码431个氨基酸，由N端的信号肽、中间区域的前肽和C端的成熟肽三部分组成，翻译后的前体需要进一步的加工修饰，包括切掉信号肽和前肽，其成骨活性主要表现在C端的成熟肽区。hBMP-7成熟肽含有139个氨基酸，单体分子量约15.7kD，带有3个糖基化位点及7个半胱氨酸残基。天然hBMP-7存在同源或异源二聚体形式，二聚体的hBMP-7是其生物学活性的主要形式。制备hBMP-7成熟肽主要的研究工作包括以下三个方面：1．采用pMAL-p2x表达载体，在原核系统中获得了hBMP7-MBP融合蛋白的可溶性高效表达，并通过亲和纯化得到纯度约为80％的融合蛋白，利用Factor Xa蛋白酶对融合蛋白酶切后，得到目的蛋白hBMP-7成熟肽，以单体形式存在。2．鉴于毕氏酵母（Pichia pastoris）表达系统能对重组蛋白进行翻译后必要的剪接、正确的折叠和修饰，糖基化形式更接近于高等真核生物，因此选用此表达系统，将hBMP-7成熟肽基因克隆入表达载体pPIC9K，用SalⅠ酶将重组质粒线性化，电转化入Pichia pastoris SMD1168细胞，G418抗性筛选出阳性整合子，确定Mut+表型进行甲醇快速诱导，并对其培养和诱导条件进行一定的探索和优化。经过整合子的筛选和表达条件的优化，最终筛选到目的蛋白表达量占上清蛋白8％的分泌表达株，表达量为0.6mg／L，酶联免疫检测及蛋白印迹结果表明，表达的重组蛋白与抗hBMP-7抗体具有特异结合活性，提示重组表达蛋白具有天然蛋白的分子构象。3．为了提高目的蛋白的表达量，依据毕氏酵母的密码子偏好性，对hBMP-7成熟肽基因进行基因修饰，最终确定以含三个精氨酸突变位点的酵母菌作为表达株进行扩大培养，经Ni-NTA柱纯化得到纯度为80％的蛋白样品，基因修饰后的hBMP-7成熟肽在毕氏酵母中的表达水平提高了约4倍，产量为2.5mg／L。所得hBMP-7成熟肽在还原状态下以分子量约18kD的单体形式存在，在非还原状态下以二聚体形式存在，分子量约为36kD左右，重组蛋白经PNGase F糖苷酶酶切分析证明其在毕氏酵母中发生了N糖基化。细胞学实验证实制备的hBMP-7成熟肽具有一定的生物学活性，能够促进成纤维细胞向成骨细胞转化。综上所述，本研究利用毕氏酵母系统成功分泌表达了hBMP-7成熟肽，并能形成有生物学活性的二聚体形式，为今后hBMP-7的功能研究奠定了基础。
聂芬[3]（2006）在《人肥胖基因在毕赤酵母中的表达》文中研究表明肥胖基因编码的蛋白质（leptin）是反映体内脂肪含量和调节体重的重要信号因子，leptin能显着降低脂肪组织数量、促进青春期发育，对机体的免疫应答、繁殖功能、神经内分泌等功能具有重要的作用。本文根据已报道的人肥胖基因cDNA序列设计引物，PCR扩增出人肥胖基因的cDNA编码序列，然后将此定向克隆至毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K的α因子信号肽编码序列3′端，构建成重组酵母表达载体，测序分析表明该cDNA序列由438个核苷酸组成，编码146个氨基酸组成的多肽。用化学方法转化毕赤酵母GS115，经PCR鉴定证实，目的基因整合到重组酵母菌染色体中，对重组酵母进行G418筛选和4天的诱导表达，然后对阳性克隆进行了为期4天的诱导表达，SDS-PAGE未检测到目的产物的表达。根据巴斯德毕赤酵母表达系统的密码子偏爱性，对肥胖基因进行了简并改造和人工合成，然后将改造过的人肥胖基因以正确的读码框架插入到酵母分泌型表达载体pPIC9K的α因子信号肽编码序列3′端，构建成重组酵母表达载体，测序结果与预期一致。重组酵母用同样方法进行了为期4天的诱导表达，并通过SDS-PAGE和放免检测，得到一株表达目的蛋白量最高的重组酵母菌，该重组蛋白表达水平可达7.71mg／L，不同浓度G418筛选表明该酵母菌是高拷贝的。SDS-PAGE检测表明分泌蛋白分子量约为16kD。
郝军元[4]（2006）在《凋亡素重组蛋白导向治疗肿瘤的研究》文中认为凋亡素是鸡贫血病毒（CAV）vp3基因编码一个功能性蛋白,主要引起鸡单核细胞凋亡。多年来对凋亡素研究证明它能够特异诱导肿瘤细胞发生凋亡而对正常体细胞无损伤作用。凋亡素在肿瘤的治疗中是一个独立的因子,凋亡素诱导的细胞凋亡不依赖于p53基因,在肿瘤细胞内高水平表达的Bcl-2能够促进凋亡素诱导的凋亡。凋亡素的这些特征在肿瘤治疗中体现了巨大的潜力,已成为肿瘤治疗研究领域的热点。为探索凋亡素蛋白导向治疗肿瘤的方法,本研究将凋亡素基因与生长抑素基因和绿脓杆菌外毒素转膜系统基因重组,重组蛋白能以生长抑素为导向富集于肿瘤组织,并通过绿脓杆菌外毒素转膜系统将凋亡素进入肿瘤细胞,以促进肿瘤细胞的凋亡。本研究首先采用原核表达系统表达了凋亡素蛋白并制备其抗体为下一步凋亡素重组蛋白的检测奠定基础,随后通过PCR重叠延伸技术将凋亡素基因与生长抑素基因和绿脓杆菌外毒素转膜系统基因重组,获得凋亡素重组蛋白基因,并在杆状病毒和酵母表达系统实现了凋亡素重组蛋白的表达。凋亡素重组蛋白在体外对肿瘤细胞的凋亡作用试验表明,凋亡素重组蛋白对肿瘤细胞有凋亡作用,能够抑制肿瘤细胞增殖,但不同肿瘤细胞凋亡率存在差异。通过上述实验,证实凋亡素重组蛋白能够诱导肿瘤细胞凋亡,为进一步利用凋亡素治疗肿瘤奠定基础。
韩菡[5]（2005）在《1.利用毕赤酵母表达牛精蛋白的研究 2.牛Myostatin活性肽编码区基因的克隆突变及其真核表达载体构建》文中进行了进一步梳理巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是表达外源蛋白最理想的真核表达系统之一,具有严格调控外源蛋白的表达、加工修饰表达产物、表达量高、营养要求低等优点。本实验利用PCR方法扩增得到牛精蛋白全序列,将其克隆插入到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K的多克隆位点上,获得载体p9K-300。利用合成-扩增的方法得到去除内含子、优化的牛精蛋白基因序列,该基因用毕赤酵母菌偏好密码子替换野生型基因中毕赤酵母稀有密码子,同样将其克隆插入到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K的多克隆位点上,获得载体p9K-160。上述两个载体与pPIC9K载体用SalI酶切线性化后,用电击转化法分别转化毕赤酵母菌株GS115。每一转化体系通过G418筛选、MM-MD平板筛选和菌落PCR鉴定后获得若干含有目的基因不同拷贝数的阳性Mut+型菌株,多数阳性菌株拷贝数高于3个。阳性菌株经诱导表达、采样,用尿素-SDS凝胶电泳分析并采取银染的方法,可见p9K-160载体阳性转化子菌株表达产物中有低分子量目的产物条带,但表达量不高,且表达量不随拷贝数增加而呈线性增长关系。p9K-300载体阳性转化子菌株表达产物中无目的产物条带。
张丽[6]（2005）在《抗菌肽ABPS1提取纯化的初步研究及其与干扰素IFNa-2b融合表达载体的构建》文中认为抗菌肽（antibacterial peptide, ABP）是一种具有广谱抗菌活性的小肽类物质。研究表明,除了抗菌活性外,抗菌肽还具有抗病毒、抗真菌和抗肿瘤作用。干扰素（interferon, IFN）是一类具有广谱抗病毒活性的糖蛋白,而且还有抑制肿瘤增殖、抗纤维化以及免疫调节等功能。 在已有高效表达融合蛋白ABPS1-GFP的基因工程菌的基础上,对融合蛋白的纯化条件进行了初步研究。首先将高效表达抗菌肽ABPS1的工程菌扩大培养,诱导表达后所得的菌体离心后进行冰浴下超声裂解,继而用表面活性剂TritonX-100和低浓度的尿素对包涵体进行充分洗涤,接着用高浓度的尿素裂解包涵体,然后在变性条件下对融合蛋白进行Ni-NTA亲和层析纯化,最后采用尿素梯度透析法对变性蛋白进行复性,并对包涵体变性、复性等条件进行了初步优化。 然而,将融合蛋白ABPS1-GFP裂解获得抗菌肽ABPS1的蛋白单体,必须使用化学裂解剂CNBr。CNBr是一种剧毒化学物质,很难购买;而且在基因工程产品的生产中,禁止使用CNBr。为此,我们对此表达载体进行了改造,构建了含有1个IFNa-2b基因和2个ABPS1基因的融合表达载体。首先在基因水平上,通过PCR的方法在各单体分子之间引入凝血因子Xa切割位点的识别序列,以质粒pET-28b（+）为载体,利用同裂酶BamHI与BglⅡ可以切出相同粘性末端的特性,通过酶切、连接、转化等操作,构建干扰素和抗菌肽的融合表达载体。经PCR、双酶切和DNA测序分析表明,串联体的DNA序列及阅读框完全正确。将干扰素IFNα-2b基因和抗菌肽ABPS1基因融合在一起,在大肠杆菌中进行表达,通过纯化后裂解可以同时获得这两种蛋白,为将ABPS1和IFNα-2b单独或联合应用于临床和生产实践奠定基础。
陈黄实[7]（2004）在《17位丝氨酸突变体干扰素β融合基因的克隆、构建、表达及纯化》文中认为目的： 人β干扰素是一类具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节作用的重要的细胞因子，属于Ⅰ型干扰素。天然IFN-β由166个氨基酸组成，含有一个N糖基化位点和三个Cys，其中第17位的Cys对保持IFN-β的空间结构无明显的作用，该Cys被Ser替代后不但对其生物学活性无影响，反而减少其与第141位Cys形成二硫键的机率，使其分子更加稳定。美国FDA已于1993年批准IFN-β(17Ser)用于治疗多发性硬化症。本实验目的之一就是克隆17位为Ser的人干扰素β突变体基因，同时保留了未突变的HuIFN-β基因，以便于比较。 目前，基因工程人IFN-β主要从CHO细胞和大肠杆菌中表达得到。大肠杆菌中表达的干扰素是以包涵体形式存在且无糖基化。在哺乳动物细胞CHO生产的干扰素表达量很低，费用高。甲基营养型酵母作为 第四军医大学博士学位论文一种新型外源基因表达系统，兼有原核细胞良好的可操作性和真核系统的翻译后加工的双重特点，是外源基因表达的理想宿主，本实验目的之二就是在毕赤酵母中构建表达IFN一p基因，为基因工程人IFN一p的生产探索一种新方法。 由于在毕赤酵母中表达的蛋白可能会出现N末端不均一现象，我们在表达质粒构建设计时采取了两种方法:第一，直接将目的基因插在信号肤pro序列中的LyS一Arg后面，删除了Glu--Ala一Glu--Ala重复序列，这样就不会造成这四个多余氨基酸在N末端残留;第二，我们设计了两个融合蛋白，将6个组氨酸编码（HIS·Tag）、FaCtorXa酶切位点编码和p千扰素基因顺序插入Glu一Ala一Glu--Ala重复序列后的Ec0RI位点。这样，既能简便快捷的用金属鳌合亲和填料纯化表达产物，又能通过FaCtorXa高效完全切除可能出现的N末端多余氨基酸和HisTag，得到目的蛋白，提高蛋白的利用率，这也是本研究目的之三。方法与结果:1.人干扰素p、17丝氨酸突变干扰素p基因及两者融合基因的克隆 与构建 本实验共扩增了四段IFN一p基因:利用PCR点突变方法，将工FN一p基因中17位CyS换为Ser，得到人旦干扰素突变基因（’7Ser一工FN一p）;利用基因重组技术，将6个组氨酸编码（HIS·Tag）和FactorXa酶切位点编码融合到突变后的‘7Ser一工FN一p基因5’端，得到17位丝氨酸突变体干扰素p融合基因（‘7Ser一 FuIFN一p）;为了进行比较，同时扩增了这两个基因未突变前的，17位为CyS的对应基因，即‘7Cys一IFN一p和，℃ys一FuIFN一p。将这四段基因分别与巴斯德毕赤酵母质粒pP工CgK或改构质粒pP工CgK’进行重组，转化大肠杆菌DHSQ，进行筛选鉴定。 经过PCR、酶切和DNA序列测定，证实四段基因均正确插入质粒中， 第四军医大学博士学位论文成功构建重组表达质粒。2.四种干扰素p重组质粒在毕赤酵母中的转染和表达 分别用Sacl、Sal工和Bgln线形化四个干扰素重组质粒，并用电穿孔法、LICI法和Pichia EasyCom了Kit三种方法转染毕赤酵母GSxls菌株，筛选G418浓度大于49/L的多拷贝整合转化子，用玻璃珠法和酶法提取酵母基因组DNA，PCR检测目的基因整合，并进行摇瓶表达和产物鉴定，对四段IFN一p基因表达结果进行初步分析。 实验确定Sall线形化，PIChia EasyComp’Kit转染，G418抗性大于49/L，His十Mut‘表型的毕赤酵母Gsz一5表达菌株。vsv攻击的wish细胞病变法测定摇瓶表达结果:融合表达产物要稍高于非融合产物;而17位Ser突变体表达产物要高于17位Cys产物。3.17位丝氨酸突变体干扰素p融合蛋白的发酵、纯化及产物分析 在巧升发酵罐上用补料一分批发酵方式进行高密度培养发酵试验，对发酵工艺进行考察。表达产物分别用金属鳌合介质、颜料亲和介质、离子交换填料进行初纯，用凝胶过滤填料、反相高效液相色谱进行精纯。对纯化产物进行免疫学、生物活性检测，同时进行糖基化、Fac torXa酶切分析。 制定了四个阶段、以补料一分批发酵方式进行高密度发酵生产Ivser一FuIFN一p的发酵工艺。发酵过程中酵母细胞湿重达到200一3009/L，实现高密度发酵的目的。经过24小时的甲醇诱导，表达产物活性达到最高7.5 x 104工U/ml（3.75 mg/L）。通过一步或多步初纯后，‘了Ser一Fu工FN一p的纯度能达到70一80%。再通过凝胶过滤柱层析去除高分子量蛋白后，其纯度可高达85%以上。纯化产物比活性IJ工U/mg，同时收集到分子量为28KDa，具有103工U/mg比活性的蛋白，初步推测它为连接部分信号肤的”Ser一FuIFN一p蛋白。 第四军医大学博士学位论文结论:1.本研究成功构建了四个干扰素p基因，并首次成功实现了17位Ser 突变人工FN一p在巴斯德毕赤酵母中表达。由于17位Ser突变能提 高IFN一p稳定性，对生产过程和临床应用十分有意义。2.首次设计在17位Ser突变HuIFN一p蛋白和a因子信号肤之间融合了6 个组氨酸（HIS·Tag）和Factor Xa酶切位点。这样，既能简便快捷 的用金属鳌合亲和填料纯化表达产物，又能通过FactorXa高效完全 切除可能出现的N末端多余氨基酸和HisTag，得到目的蛋白，提高 蛋白的利用率。3.实验
陈凌[8]（2004）在《hBMP-7的定点突变及其在甲醇酵母中的表达鉴定》文中研究指明骨形态发生蛋白（Bone Morphogenesis Proteins，BMPs）是一类蛋白质生长因子，在动物（包括人类）的生长发育过程中对组织器官的决定与分化起重要作用。骨形态发生蛋白-7（BMP7）又称成骨蛋白-1（Osteogenic Protein-1，OP-1）具有促使细胞组织分化形成骨组织的作用。本研究尝试建立hBMP7成熟片段在毕赤酵母（Pichia pastoris）中的表达技术。主要研究工作包括：将hBMP7全长cDNA的成熟片段克隆到分泌型表达载体质粒pPIC9K多克隆位点上，构建能表达hBMP7成熟肽的载体质粒；以这一表达载体为基础，依据酵母密码子使用偏好性，将hBMP7成熟片段内3个酵母使用频率为0的精氨酸密码子突变为使用频率较高的同义密码子AGA，以期实现高效表达；表达质粒经转化酵母宿主菌株KM71，PCR鉴定基因整合后，摇瓶培养，甲醇诱导表达并用点杂交快速筛选高表达菌株。摇瓶表达上清经Tricine-PAGE分析表明在18KD处有一新增条带；Western-Blotting表明该条带具有良好的抗原性和特异性，证实为hBMP7，重组产物的理论分子量为15.6KD，实际值为18KD，推测产物带有一定程度的糖基化修饰，重组产物以单体形式存在，没有检测到预期的二聚体形式。利用蛋白质Bradford总蛋白定量，结合Glyko BandScan量化软件的分析发现，表达上清中特异性蛋白的表达量可达到25.45μg／ml，占总蛋白含量的76.2％；密码子优化使rhBMP7摇瓶培养表达量较未优化序列提高了4～5倍；对不同诱导条件的观察表明：诱导5d表达量达到最高水平；保持以终浓度为1％的甲醇进行诱导得到最高表达量；调整诱导前菌体生物量在10左右，蛋白的表达量最为理想。通过经典的小鼠股部肌袋包埋实验，初步证明毕赤酵母分泌表达的rhBMP7成熟片段能够诱导间充质干细胞（MSC）分化为软骨细胞。
王忠泽,王慧,荫俊[9]（2002）在《人成骨蛋白成熟肽基因在毕氏酵母（Pichia Yeast）中的高效表达》文中指出采用PCR方法,根据文献报道的人成骨蛋白（osteogenic protein-1,OP-1）成熟肽基因序列,设计并合成一对引物,从构建的含人成骨蛋白基因的质粒中扩增获得大小为420bp的DNA片段,连接到pGEM-T载体进行测序,证明获得人成骨蛋白成熟肽基因片段,并以pPIC9K为表达载体构建重组表达质粒,转化大肠杆菌细胞,经鉴定的阳性重组质粒并线形化,电转化毕氏酵母细胞GS115,于30℃进行甲醇诱导分泌表达,表达产物存在于培养基中,占分泌蛋白的10％.重组表达产物进行Western Blot可以检测到重组表达产物,ELISA检测其具有特异性结合活性.
王忠泽,王慧,荫俊,宋伟,侯晓军,张松乐[10]（2002）在《人成骨蛋白成熟肽基因在毕赤酵母中的克隆及其序列分析》文中提出采用PCR方法,根据文献报道的人成骨蛋白-1（OP-1）成熟肽基因序列,设计并合成一对引物,从含人成骨蛋白基因的质粒中扩增获得大小为420bp的DNA片段,连接到pGEM-T载体进行测序,证明获得人成骨蛋白成熟肽基因片段,继之以pPIC3.5K为表达载体构建重组表达质粒,并经PCR及酶切鉴定。
二、人成骨蛋白成熟肽基因在毕氏酵母(Pichia Yeast)中的高效表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人成骨蛋白成熟肽基因在毕氏酵母(Pichia Yeast)中的高效表达（论文提纲范文）
（1）hBMP-4在毕赤酵母中的表达、纯化、活性鉴定及二聚体化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中文文摘 |
| 绪论 |
| 1 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统 |
| 2 BMPs的研究与应用 |
| 3 分子伴侣 |
| 4 本研究的目的和意义 |
| 第一章 实验材料与方法 |
| 第一节 实验材料 |
| 1.1.1 菌株与质粒 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.1.4 常用培养基和缓冲液 |
| 1.1.5 寡聚核苷酸引物 |
| 第二节 实验方法 |
| 1.2.1 质粒的提取 |
| 1.2.2 限制性内切酶酶切质粒 |
| 1.2.3 PCR反应 |
| 1.2.4 连接反应 |
| 1.2.5 细菌的转化 |
| 1.2.6 细菌转化子的鉴定 |
| 1.2.7 电转化酵母细胞 |
| 1.2.8 酵母转化子的鉴定 |
| 1.2.9 酵母转化子的小量摇瓶培养 |
| 1.2.10 酵母转化子的高密度发酵 |
| 1.2.11 表达产物的DOT-BLOT分析 |
| 1.2.12 表达产物N-糖基化酶(Endo H_f)酶切分析 |
| 1.2.13 表达产物的WESTERN-BLOT分析 |
| 1.2.14 表达产物的分离纯化 |
| 1.2.15 SDS-PAGE电泳(考马斯亮蓝法) |
| 1.2.16 ELISA方法定量分析rhBMP-4 |
| 1.2.17 经纯化后的rhBMP-4生物活性测定 |
| 1.2.18 hBMP-4全长序列表达载体的构建 |
| 第二章 实验结果 |
| 第一节 hBMP-4成熟肽在毕赤酵母中的表达、纯化及其生物活性的测定 |
| 2.1.1 酵母转化子高密度发酵和小量摇瓶培养表达量差异 |
| 2.1.2 G8酵母转化子表达产物的纯化 |
| 2.1.3 G8酵母转化子表达产物N-糖基化分析 |
| 2.1.4 G8酵母转化子表达产物N端加工不完全 |
| 2.1.5 小鼠肌袋包埋法鉴定纯化后的rhBMP-4生物活性 |
| 2.1.6 碱性磷酸酶活性测定法鉴定纯化后的rhBMP-4生物活性 |
| 第二节 hBMP-4全长在毕赤酵母(GS115)中的表达 |
| 2.2.1 p-hBMP-4/full表达载体的构建(图2-13) |
| 2.2.2 p-hBMP-4/full酵母转化子的筛选 |
| 2.2.3 P-BMP4/full在毕赤酵母中的表达 |
| 第三章 分析与讨论 |
| 第一节 hBMP-4成熟肽在毕赤酵母中的表达、纯化及其生物活性的测定 |
| 3.1.1 hBMP-4成熟肽高密度发酵和小量摇瓶培养条件下的表量差异 |
| 3.1.2 G8酵母转化子表达产物N-糖基化分析 |
| 3.1.3 G8酵母转化子表达产物N端加工不完全 |
| 3.1.4 G8酵母转化子表达产物rhBMP-4生理活性鉴定 |
| 第二节 hBMP-4全长在毕赤酵母(GS115)中的表达 |
| 第四章 结论 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）人骨形态发生蛋白-7成熟肽的表达及其生物学活性的初步研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 hBMP-7成熟肽基因在原核系统中的分泌融合表达 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 hBMP-7成熟肽基因在毕氏酵母中的分泌表达 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 hBMP-7成熟肽基因修饰与分泌表达及其生物学活性初步研究 |
| 1 hBMP-7成熟肽基因修饰 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 2 突变基因和人工合成基因在毕氏酵母中的分泌性表达 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 3 hBMP-7重组蛋白的细胞学活性初步研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 攻读学位期间发表论文 |
| 致谢 |
（3）人肥胖基因在毕赤酵母中的表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 前言 |
| 1.1 人肥胖基因的发现 |
| 1.2 人ob基因和leptin的基本结构 |
| 1.2.1 ob基因的基本结构 |
| 1.2.2 leptin的基本结构 |
| 1.3 人leptin受体(ob-R) |
| 1.4 人leptin的功能 |
| 1.4.1 leptin与体重 |
| 1.4.2 leptin与生殖发育 |
| 1.4.3 leptin与免疫功能 |
| 1.4.4 leptin与妊娠和胎儿的发育 |
| 1.4.5 leptin与造血功能 |
| 1.4.6 leptin对骨代谢的作用 |
| 1.4.7 leptin对组织代谢的作用 |
| 1.5 人ob基因的体外表达研究 |
| 1.6 毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统 |
| 1.6.1 毕赤酵母表达系统 |
| 1.6.2 毕赤酵母表达系统的应用 |
| 2 本研究的目的与意义 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 质粒与菌株 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要溶液的配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 人ob片段的PCR扩增 |
| 3.2.2 人ob片段PCR扩增产物的回收 |
| 3.2.3 人ob片段和酵母表达载体pPIC9K的双酶切 |
| 3.2.4 酵母表达载体的构建 |
| 3.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法) |
| 3.2.6 连接产物的转化 |
| 3.2.7 重组质粒的快速鉴定 |
| 3.2.8 质粒的提取(碱裂解法) |
| 3.2.9 重组质粒的酶切鉴定 |
| 3.2.10 人ob基因的序列测定 |
| 3.2.11 重组表达载体的线型化 |
| 3.2.12 酵母菌感受态细胞的制备 |
| 3.2.13 酵母菌的转化 |
| 3.2.14 酵母基因组 PCR模板制备 |
| 3.2.15 酵母阳性重组子 PCR筛选 |
| 3.2.16 阳性转化子 Mut表型鉴定 |
| 3.2.17 重组酵母的小量诱导表达 |
| 3.2.18 多拷贝酵母重组子的筛选 |
| 3.2.19 表达产物的SDS-PAGE电泳检测 |
| 3.2.20 人ob基因的改造及其在毕赤酵母中的表达 |
| 3.2.21 放免检测分析 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 人ob基因cDNA的获得 |
| 4.2 重组质粒酶切鉴定 |
| 4.3 重组质粒的 PCR鉴定 |
| 4.4 人ob基因序列测定结果 |
| 4.5 重组酵母的鉴定与表达(基因未改造) |
| 4.6 人ob基因的密码子改造结果 |
| 4.7 基因改造后重组酵母的鉴定 |
| 4.8 Mut表型鉴定 |
| 4.9 诱导产物的放免分析及阳性重组子G418抗性分析 |
| 4.10 诱导产物的SDS-PAGE电泳检测 |
| 5 讨论 |
| 5.1 酵母表达重组质粒的构建 |
| 5.2 阳性克隆 PCR模板制备 |
| 5.3 酵母表达重组质粒转化与筛选 |
| 5.4 酵母的诱导表达 |
| 6 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）凋亡素重组蛋白导向治疗肿瘤的研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 第一篇:文献综述 |
| 第一章 导向治疗的研究进展 |
| 1 肿瘤导向治疗 |
| 2 肿瘤导向治疗药物的研究进展 |
| 3 导向治疗肿瘤的前景与展望 |
| 第二章 细胞凋亡与肿瘤的发生和治疗 |
| 1 细胞凋亡 |
| 2 细胞凋亡的机制 |
| 3 细胞凋亡与肿瘤的发生发展 |
| 4 细胞凋亡与肿瘤的浸润和转移 |
| 5 细胞凋亡的调控基因与肿瘤 |
| 6 细胞凋亡与肿瘤治疗 |
| 第三章 凋亡素重组蛋白各组件研究进展 |
| 1 生长抑素 |
| 2 绿脓杆菌外毒素(PEA)转膜系统 |
| 3 Apoptin 的研究进展 |
| 第二部分:研究内容 |
| 第一章 凋亡素原核表达及其抗体的制备 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 凋亡素重组蛋白在杆状病毒表达系统的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 凋亡素重组蛋白纯化及在体外对肿瘤细胞的抑制作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 凋亡素重组蛋白在酵母表达系统中的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的主要论文 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 致谢 |
| 导师简历 |
| 个人简历 |
（5）1.利用毕赤酵母表达牛精蛋白的研究 2.牛Myostatin活性肽编码区基因的克隆突变及其真核表达载体构建（论文提纲范文）
| 实验Ⅰ、利用毕赤酵母表达牛精蛋白的研究 |
| 摘要Ⅰ |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 毕赤酵母表达系统 |
| 1.1.1 概述 |
| 1.1.2 毕赤酵母表达系统生物学原理及组成 |
| 1.1.3 毕赤酵母转化、基因整合以及表达的常用方法和基本原理 |
| 1.1.4 影响外源蛋白表达的因素 |
| 1.2 精子介导转基因简述 |
| 1.3 精蛋白的合成、特性及应用 |
| 1.3.1 精蛋白的合成及其生物学功能 |
| 1.3.2 精蛋白的组成与进化 |
| 1.3.3 DNA-精蛋白结合模型 |
| 1.3.4 精蛋白在各学科领域中的应用 |
| 第二章 实验研究 |
| 2.1 牛精蛋白基因的毕赤酵母分泌型表达载体的构建 |
| 2.1.1 前言 |
| 2.1.2 实验材料 |
| 2.1.3 实验方法 |
| 2.1.4 实验结果 |
| 2.1.5 结果讨论 |
| 2.2 毕赤酵母的转化与阳性转化子的筛选 |
| 2.2.1 前言 |
| 2.2.2 实验材料 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.2.4 实验结果 |
| 2.2.5 结果讨论 |
| 2.3 毕赤酵母阳性转化子的诱导表达 |
| 2.3.1 前言 |
| 2.3.2 实验材料 |
| 2.3.3 实验方法 |
| 2.3.4 实验结果 |
| 2.3.5 结果讨论 |
| 2.3.6 结论 |
| 参考文献Ⅰ |
| 实验Ⅱ、牛Myostatin活性肽编码区基因的克隆突变及其真核表达载体构建 |
| 摘要Ⅱ |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 肌肉生成调控简述 |
| 1.2 动物双肌性状形成分子机理 |
| 1.2.1 肌肉生长抑制素的特点 |
| 1.2.2 牛的MSTN基因研究现状 |
| 1.2.3 MSTN作用机理 |
| 1.3 其他动物MSTN研究现状 |
| 1.3.1 人的肌肉生长抑制素基因 |
| 1.3.2 绵羊的肌肉生长抑制素基因 |
| 1.3.3 猪的肌肉生长抑制素基因 |
| 1.4 MSTN应用前景 |
| 第二章 实验研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1.PCR法克隆突变肌抑素活性肽基因 |
| 2.3.2.构建突变肌抑素活性肽基因真核表达载体 |
| 2.5 讨论 |
| 参考文献Ⅱ |
| 致谢 |
| 附录 |
（6）抗菌肽ABPS1提取纯化的初步研究及其与干扰素IFNa-2b融合表达载体的构建（论文提纲范文）
| 第一部分 文献综述 |
| 1.1 抗菌肽研究进展 |
| 1.1.1 抗菌肽的种类 |
| 1.1.2 抗菌肽的生物学作用 |
| 1.1.3 抗菌肽的结构和作用机理 |
| 1.1.4 抗菌肽基因工程 |
| 1.1.5 抗菌肽的应用前景 |
| 1.2 干扰素的研究进展 |
| 1.2.1 干扰素的产生及分类 |
| 1.2.2 干扰素的生物学作用 |
| 1.2.3 干扰素的分子结构及其产生机理 |
| 1.2.4 干扰素基因工程 |
| 1.2.5 干扰素的应用 |
| 1.3 包涵体蛋白的提取纯化 |
| 1.3.1 包涵体的初步纯化 |
| 1.3.2 包涵体蛋白的精制纯化 |
| 1.3.3 包涵体提纯条件的优化 |
| 第二部分 实验内容 |
| 实验一、抗菌肽ABPS1基因与IFN-α-2b融合表达载体的构建与表达 |
| 1.1实验 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.4 讨论 |
| 实验二、基因工程抗菌肽ABPS1提取纯化的初步研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）17位丝氨酸突变体干扰素β融合基因的克隆、构建、表达及纯化（论文提纲范文）
| 缩写词中英文对照表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 一、 人β干扰素研究进展 |
| 二、 巴斯德毕赤酵母表达系统的研究进展 |
| 研究内容 |
| 第一部分 人干扰素β、17位丝氨酸突变干扰素β基因及两者融合基因的克隆与构建 |
| 第二部分 四种干扰素β重组质粒在毕赤酵母中的转染和表达 |
| 第三部分 17位丝氨酸突变体干扰素β融合蛋白的发酵、纯化及产物分析 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 研究成果 |
| 致谢 |
（8）hBMP-7的定点突变及其在甲醇酵母中的表达鉴定（论文提纲范文）
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 1 BMPs的研究概况 |
| 2 毕赤酵母真核表达系统的优化策略 |
| 本实验的研究目的和意义 |
| 实验内容 |
| 1 hBMP7 毕赤酵母表达载体的构建及成熟片断的定点突变 |
| 2 hBMP7成熟片段在毕赤酵母中的表达及鉴定 |
| 3 rhBMP7生物活性的初步研究 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| 附录 |
| 1 重组质粒pPic9K／hBMP7／mut测序图 |
四、人成骨蛋白成熟肽基因在毕氏酵母(Pichia Yeast)中的高效表达（论文参考文献）
- [1]hBMP-4在毕赤酵母中的表达、纯化、活性鉴定及二聚体化研究[D]. 郑彬琼. 福建师范大学, 2009(S1)
- [2]人骨形态发生蛋白-7成熟肽的表达及其生物学活性的初步研究[D]. 刘蕾. 中国人民解放军军医进修学院, 2007(02)
- [3]人肥胖基因在毕赤酵母中的表达[D]. 聂芬. 华中农业大学, 2006(S1)
- [4]凋亡素重组蛋白导向治疗肿瘤的研究[D]. 郝军元. 吉林大学, 2006(09)
- [5]1.利用毕赤酵母表达牛精蛋白的研究 2.牛Myostatin活性肽编码区基因的克隆突变及其真核表达载体构建[D]. 韩菡. 中国农业大学, 2005(06)
- [6]抗菌肽ABPS1提取纯化的初步研究及其与干扰素IFNa-2b融合表达载体的构建[D]. 张丽. 中国农业大学, 2005(05)
- [7]17位丝氨酸突变体干扰素β融合基因的克隆、构建、表达及纯化[D]. 陈黄实. 第四军医大学, 2004(04)
- [8]hBMP-7的定点突变及其在甲醇酵母中的表达鉴定[D]. 陈凌. 福建师范大学, 2004(04)
- [9]人成骨蛋白成熟肽基因在毕氏酵母（Pichia Yeast）中的高效表达[J]. 王忠泽,王慧,荫俊. 生命科学研究, 2002(S1)
- [10]人成骨蛋白成熟肽基因在毕赤酵母中的克隆及其序列分析[J]. 王忠泽,王慧,荫俊,宋伟,侯晓军,张松乐. 生物技术通讯, 2002(05)