一、大肠杆菌焦磷酸酶基因的克隆和序列分析（论文文献综述）
孙红梅[1]（2020）在《桑树（Morus alba）三个干旱诱导基因的表达规律及MaCDSP32基因的功能分析》文中研究说明桑树（Morus alba）根系发达,枝繁叶茂,生命力旺盛,具有较强的环境适应性,因此在世界范围内分布广泛。在我国,桑树作为生态防护林选用树种,可起到防沙固土,减少地表径流,保持原生态土壤结构的作用。另一方面,因桑树生长迅速,地上部分生物量大,被应用到自然生态修复系统中,例如修复被重金属污染的土壤、多石的贫瘠荒漠以及戈壁沙漠化区域等。桑树具有顽强的生存能力,源于其所拥有的独特生理特性,近年来在植物遗传学应用领域备受关注,涉及桑树抗逆基因资源挖掘及开发利用等研究。本研究从桑树中克隆得到3个干旱差异表达基因:叶绿体干旱胁迫诱导蛋白编码基因（chloroplast drought-induced stress protein of 32 k Da,Ma CDSP32）,IAA-氨基酸水解酶编码基因（ILR1-5（IAA-amino acid hydrolase ILR1-like 5,Ma ILR1）和抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase,Ma APX2））进行基因克隆、表达分析及基因功能分析,通过对目标序列的生物信息学分析、表达特性分析、转基因植株的抗逆性分析以及在干旱胁迫下的转录组数据分析,实现对目标基因在植物响应环境胁迫条件下分子功能的探索,为在未来以生物技术工程为手段改善植物的环境适应性和在实际生产中发挥桑树品种质资源优势等工作铺垫基石。本研究取得的主要结果如下:1.三个基因的克隆及亚细胞定位桑树中Ma CDSP32、Ma ILR1和Ma APX2基因的编码区长度分别为909 bp、1302 bp和750bp,分别编码303、434和250个氨基酸。预测结果显示,三个编码蛋白的亲水性和稳定性良好。Ma CDSP32编码的蛋白质定位在叶绿体基质中;Ma APX2编码的蛋白酶定位在细胞质内,主要富集在细胞膜和细胞核附近;Ma ILR1编码一个膜蛋白,为分泌型蛋白,定位在细胞膜上。2.三个基因在不同生长条件下的表达模式Ma CDSP32基因主要在桑树成熟叶片中表达,在桑树不同种间具有表达偏好性,但与基因组倍性无关;一天内,Ma CDSP32在15:00时达到表达高峰,呈生物钟节律表达规律;非生物胁迫和外源激素可诱导Ma CDSP32表达水平发生变化,但在叶片和根中表达模式不同。Ma ILR1基因主要在幼叶中表达,在桑树不同种间具有表达偏好性,但与基因组倍性无关;Ma ILR1无明显生物钟表达规律;非生物胁迫和外源激素可诱导Ma ILR1表达水平发生变化,但在叶片和根中表达模式不同。Ma APX2基因在地上部分表达量一致,在桑树不同种间具有表达偏好性,但与基因组倍性无关;一天内,Ma APX2在12:00时达到表达高峰,呈生物钟节律表达规律;非生物胁迫和外源激素可诱导Ma APX2表达水平发生变化,但在叶片和根中表达模式不同。3.Ma CDSP32瞬时表达桑叶的基因功能研究瞬时过表达Ma CDSP32的离体桑叶相比于未转化桑叶,在自然晾干过程中失水量增加。PEG模拟的水分胁迫下,桑叶中Ma MRSB、Ma P5CS、Ma PRX、Makds A、Ma DREB和Ma MAPK基因的表达水平以及ROS的积累量受Ma CDSP32过表达影响发生改变;盐胁迫下,桑叶中Ma WRKY、Makds A、Ma DREB和Ma MAPK基因的表达水平也受到Ma CDSP32过表达影响发生改变。这些结果表明Ma CDSP32会影响胁迫相关基因的表达水平,并参与植物非生物胁迫应答过程。4.Ma CDSP32在转基因烟草中的基因功能研究Ma CDSP32稳定转化烟草获得的转基因株系（OE-2和OE-7）与野生型烟草相比,在自然晾干过程其离体叶片失水量增加。转基因烟草对干旱敏感性增加,叶片中ROS积累和MDA含量增加,多种抗氧化酶活性降低,脯氨酸和可溶性糖积累减少;但复水后转基因植株的生长恢复能力增强,ROS积累减少,MDA含量减少,多种抗氧化酶活性增强,脯氨酸和可溶性糖积累增加。胁迫期间,转基因植株中Nt CAT、Nt ADC2、Nt LEA5和Nt MSRB基因的表达水平相对野生型发生改变。此外,Ma CDSP32通过促进转基因烟草种子和幼苗中Nt MSRB表达上调,减少ROS积累,显着增加了种子在渗透胁迫下的萌发率和幼苗生长。在盐胁迫下,叶绿素含量在Ma CDSP32转基因植株中增加,而在野生型植株中减少。这些结果揭示Ma CDSP32主要是通过参与氧化还原途径调节植物的抗逆性。5.Ma CDSP32在转基因拟南芥中的基因功能研究Ma CDSP32转基因拟南芥株系（OE-3和OE-9）与野生型拟南芥和At CDSP32突变拟南芥株系（mt-1和mt-2）相比,在干旱胁迫期间OE株系萎蔫较严重,ROS积累和MDA含量较多,SOD、POD和APX抗氧化酶活性较低。但OE株系相比野生型和突变体株系,在复水后成活率较高。在干旱和盐胁迫下,植株中不同Ma CDSP32或At CDSP32表达水平会影响At SOD、At POD、At CAT、At PRX、At APX2和At GR基因的表达水平。盐胁迫处理后,突变体株系的叶绿素含量相比野生型和OE株系降低。在渗透胁迫下OE拟南芥种子的萌发率较野生型和突变体种子显着增加。此外,OE拟南芥株系出现早花现象,其中At SOC1基因表达较野生型和突变体显着上调。这些结果表明Ma CDSP32主要是通过参与逆境应答的氧化还原途径影响植物的逆境生理和种子萌发过程,且Ma CDSP32通过影响At SOC1基因表达参与植物开花时间调节。6.Ma CDSP32过表达烟草干旱胁迫转录组学分析转基因烟草的转录组数据分析显示,在干旱处理期间,OE与WT株系差异表达基因主要集中在催化活性、核酸结合转录、转录因子活性、光合作用相关膜组件、糖类代谢进程和肽链内切酶调节因子酶活性等生理过程方面;复水后,OE与WT株系差异表达基因主要集中在高分子生物合成、氮化合物生物合成、催化活性和水解酶活性等生理过程方面。进一步分析发现,这些差异表达基因在苯丙素的生物合成、光合作用-触角蛋白、角质素,软木脂和蜡质的生物合成、核糖体和光合系统的固碳作用等通路中上调基因最多;这些差异表达基因在内质网蛋白加工、半乳糖代谢、倍半萜和三萜生物合成和脂肪酸延伸等通路中下调基因最多。此外,与WT株系相比,OE株系中在半胱氨酸和甲硫氨酸代谢途径、淀粉和糖类代谢途径、油菜素类固醇代谢途径、植物激素信号传导代谢途径和光合元件固碳作用代谢途径,以及抗氧化酶活性、脯氨酸合成代谢和糖合成代谢等方面所涉及的差异表达基因均出现干旱期间下调而复水后上调的变化趋势。推测这些差异表达基因是Ma CDSP32基因在干旱期间和复水后参与调节植物抗旱性相互作用的关键位点。综上,本研究得到的主要结果表明,桑树中的干旱持续表达基因Ma CDSP32通过参与植物抗逆过程中的ROS代谢调节过程,增强了植株的抗旱性,揭示了Ma CDSP32参与提高植物旱后恢复能力的分子机制。这项研究为桑树品种质资源优势的开发利用筛选了基因资源,为以分子生物技术手段改善植物的环境适应性和生存能力提供了新思路。
王守栋[2]（2020）在《柿原花青素前体转运相关基因DkAHA1的克隆和功能研究》文中研究表明原花青素（PAs）是柿中的化合物,赋予果实涩感特征。在植物细胞中,PAs在细胞质内的不同位置合成,而后被运输并最终储存在液泡中。模式植物拟南芥液泡膜P-ATP酶TT13（AHA10,autoinhibited H+-ATPase isoform 10）可以驱动原花青素前体转运到液泡中,AHA10在柿中功能尚未得到阐明。本研究以中国甜柿‘鄂柿1号’为主要试材,结合柿转录组数据库,通过同源克隆挖掘到编码ATPase的候选基因DkAHA1,克隆得到DkAHA1启动子序列,通过瞬时转化验证了该基因功能。主要结果如下:1.通过BLAST得到柿AHA基因家族5个候选基因,其中DkAHA1编码长度2853bp。系统发育分析表明DkAHA1属于P3A型ATPase;氨基酸序列比对表明其保守性较强。2.DkAHA1在柿叶片和萼片中表达量均较高,DkAHA2在果心中表达丰度高,DkAHA3和DkAHA4在叶片中表达量较高,DkAHA5则主要在萼片中表达。DkAHA1在完全甜柿、完全涩柿和非完全甜柿等三类柿品种果实发育各阶段的表达与原花青素在果实中的积累具有相似的趋势。3.烟草亚细胞定位结果显示DkAHA1的绿色荧光与液泡膜蛋白红色荧光可以良好的重合,表明DkAHA1在液泡膜上分布;通过柿圆片瞬时干涉表达和超表达DkAHA1后,原花青素含量表现出相应的降低和上升。4.利用‘鄂柿1号’基因组DNA为模板,克隆获得DkAHA1基因的1132bp启动子序列,预测启动子上具有17个响应环境变化的顺式元件;构建了Y1HGold[p AHA1-Ab Ai]诱饵酵母菌株,其报告基因Ab Ar本底表达最低抑制浓度为600 ng/m L,为调控基因的筛选做铺垫。综上所述,DkAHA1在柿中的表达模式与原花青素积累模式相同,可能参与原花青素的积累过程;DkAHA1作为液泡膜蛋白可促进PAs的积累,可能与PAs前体跨膜转运有关。
李靖怡[3]（2020）在《酸性磷酸酶OsACP1在水稻缺磷适应性中的功能研究》文中研究说明磷是植物生长发育所必需的大量元素之一,不仅参与组成DNA、RNA和磷脂等植物中多种重要的大分子有机物,也在植物的光合作用、呼吸作用和能量代谢等基础生理代谢过程中起十分重要的作用。植物只能直接吸收利用可溶性无机磷（Pi）,但土壤中大部分磷素以有机磷或固定态无机磷的形式存在,因此土壤中的有效磷往往不能满足植物的生长发育需要。为了应对土壤有效磷缺乏,植物进化出了一系列低磷适应性反应来维持自身的正常生长,包括改变根系构型、形成菌根共生体、诱导高亲和磷酸盐转运体、诱导分泌有机酸和酸性磷酸酶等多种生物学途径,从而增加磷的吸收与利用,以维持体内磷稳态。其中植物受缺磷诱导的酸性磷酸酶不仅增加了土壤中能被植物吸收的无机磷含量,而且能够加强植物内部磷素的循环再利用。通过对水稻转录组数据分析,前期研究中我们发现酸性磷酸酶Os ACP1显着受缺磷和Os PHR2的诱导表达,说明该基因可能参与水稻的缺磷适应性反应。根据生物信息学分析,证实Os ACP1属于卤酸脱卤素酶（haloacid dehalogenases,HAD）超家族成员,在不同作物中存在多个同源基因,目前对这些同源基因的研究发现,多个成员受缺磷诱导表达并参与调控作为的缺磷适应性反应,但是其中的分子机制还不清楚。为了研究Os ACP1的生理生化功能,我们首先分析了Os ACP1基因的时空特异性表达。RT-PCR分析证实Os ACP1特异性受缺磷诱导表达,而对其它营养缺乏条件没有显着反应。进一步利用实时定量PCR和Os ACP1启动子::GUS转基因材料分析发现Os ACP1在地上部分和地下部分均显着受缺磷诱导表达。为了研究Os ACP1的酶活特性,我们利用无缝克隆技术构建了Os ACP1的原核表达载体,并通过原核表达系统纯化了Os ACP1蛋白。酶学活性和底物特异性测定结果表明,Os ACP1蛋白的最适p H为6.0,辅酶离子为镁离子,对不同的有机磷底物均表现出活性,其中对磷酸乙醇胺的活性最高。进一步利用水稻原生质体转化系统确定Os ACP1蛋白的亚细胞定位,我们发现Os ACP1-GFP融合蛋白主要定位于水稻细胞中的内质网膜以及高尔基体膜上。为了解析Os ACP1在水稻缺磷适应性中的功能,我们克隆了该目的基因,并通过农杆菌介导的转基因技术创制了Os ACP1的超表达和CRISPR突变体材料。将超表达Os ACP1基因的水稻进行正常和缺磷处理培养发现,与野生型相比,正常磷供给条件下,水稻超表达材料植株生长受到显着抑制,但是磷含量显着升高,在10 d大小幼苗的第一片叶尖出现磷中毒表型,缺磷处理条件下,该叶尖磷中毒表型消失。因此,说明超表达Os ACP1会影响水稻正常生长条件下细胞内的磷平衡,继而影响其生长。在正常和缺磷条件下,与野生型相比,突变体生长表型也受到抑制,但是其叶片磷含量没有显着变化。田间农艺性状分析进一步证实,Os ACP1的超表达和突变体生长均受到显着抑制。综上所述,本课题利用分子生物学、生理学和生物化学等一系列技术手段,分析了水稻Os ACP1基因的生理生化功能,初步证明了Os ACP1可能参与缺磷条件下内质网和高尔基体膜磷脂的重构,通过代谢磷酸乙醇胺和磷酸胆碱等有机磷,维持缺磷条件下水稻细胞内的磷稳态。
高萌[4]（2020）在《苹果种质资源有机酸含量评价及酸含量调控候选基因MtPEPP功能分析》文中提出酸度是果实品质的重要组成部分,影响苹果等果实的口感。苹果是温带地区主要的果树之一,不同苹果种质资源果实的酸度存在明显差异,对苹果种质资源果实酸度候选基因的筛选和功能分析对改善果实品质具有重要意义。本研究使用高效液相色谱法测定了101个苹果属果实的有机酸含量,选出酸度性状显着差异（高酸和低酸）的种质,对有机酸变化特殊的变叶海棠（Malus toringoides）不同发育时期果实进行转录组测序,筛选出了果实酸度候选基因焦磷酸化质子泵PEPP（Pyrophosphate-energised proton pump）,并对该基因功能进行了研究,获得的主要结果如下:（1）对野生和栽培苹果果实中有机酸含量进行测定,结果表明,野生苹果果实的酸含量高于栽培苹果。野生苹果中含有苹果酸和柠檬酸,苹果酸的含量为2.58至29.27mg/g FW,柠檬酸含量为0至24.21 mg/g FW。栽培苹果果实中苹果酸的含量为1.72至10.10 mg/g FW。从101个苹果属植物中发掘了果实发育期间柠檬酸和苹果酸变化趋势比较特殊的种质变叶海棠。随着果实发育,变叶海棠果实苹果酸含量呈下降趋势,柠檬酸含量明显上升。（2）对变叶海棠三个不同发育时期果实进行转录组测序,鉴定出差异基因约14000个,三个比较组共同存在的差异基因3337个。在这些差异基因中筛选出与总有机酸积累模式较为一致的基因MDP0000280551。该基因编码焦磷酸酶质子泵,命名为PEPP。该基因在栽培苹果成熟期果实中的表达量与苹果酸含量并未表现出一致性。（3）苹果中PEPP基因的序列长度为4845 bp,其中包括7个内含子,8个外显子,c DNA长度为2304 bp。从变叶海棠果实的c DNA库中分离出了MtPEPP的编码区,测序比对匹配度为97%。拟南芥原生质体的亚细胞定位结果显示,MtPEPP定位在线粒体膜上。（4）将MtPEPP连接到具有强35S启动子的p GWB 411载体上,获得了MtPEPP异源表达‘Micro-Tom’番茄的阳性株系,转基因株系13和21的成熟期果实柠檬酸含量均比野生番茄（6.6 mg/g FW）高2.2 mg/g FW,总酸度比野生番茄（10.5%）高2.6%。异源表达MtPEPP的番茄植株的株高要低于野生番茄,果实的种子饱满程度降低。（5）将MtPEPP基因的编码区连接到具有双35S的p MDC83载体上,并通过农杆菌转化法获得了过表达MtPEPP的‘王林’苹果果肉愈伤组织,发现过表达苹果果肉愈伤组织的苹果酸含量显着高于野生型,最高达到2倍以上,总酸度最高达到了10.6%,显着高于野生型（7.5%）的总酸度。
刘腾飞[5]（2019）在《马铃薯StGRIK1的功能研究及低温诱导StBAM1与StBAM9表达的机制解析》文中指出马铃薯（Solanum tuberosum L.）作为直接供人类食用的第三大粮食作物,为全球粮食安全提供了保障。由于马铃薯具有适应性强、产量高和营养丰富均衡的特点,在保障我国粮食的稳步增长方面至关重要。淀粉作为马铃薯叶片的主要光合产物和块茎干物质的主要成分,其代谢过程的调控对马铃薯产量和品质形成都起着关键作用,同时淀粉也是低温糖化过程中还原糖累积的源头。虽然马铃薯淀粉代谢相关的部分酶的功能得到了鉴定,但是这些淀粉代谢基因的表达是否具有协同性以及其转录调控机制还知之甚少。前人研究表明马铃薯Sn RK1在淀粉糖代谢过程中发挥着重要作用,但是其上游激酶在马铃薯中还未被鉴定;同时本实验室前期研究发现受低温诱导的β淀粉酶St BAM1和St BAM9参与到马铃薯块茎低温糖化过程,但它们在块茎中的低温诱导机制也还不明确。在此基础上,本课题对马铃薯Sn RK1上游激酶进行鉴定和功能研究,同时对St BAM1和St BAM9在块茎中的低温诱导表达机制进行了解析。主要结果如下:1.马铃薯Sn RK1上游激酶的鉴定和功能研究通过利用模式植物拟南芥Sn RK1上游激酶GRIK1和GRIK2的序列信息,对马铃薯中St GRIKs进行了鉴定和分析,结果表明马铃薯基因组存在两个GRIKs同源基因,分别命名为St GRIK1和St GRIK2。通过克隆测序分析发现,St GRIK2存在多种可变剪接形式,且均不具有编码活性激酶的潜能;而St GRIK1能编码保守的GRIK蛋白,并具有体外激酶活性,还能直接在体外磷酸化St Sn RK1α,表明St GRIK1可能是马铃薯中Sn RK1上游唯一的激酶。共定位分析结果显示,St GRIK1定位于液泡膜,通过序列分析发现St GRIK1不含跨膜结构域,却在氨基端存在3个潜在的酰基化的半胱氨酸位点。随后对St GRIK1的截短和突变体定位分析发现,St GRIK1氨基端的3个酰基化半胱氨酸位点对于其液泡膜定位是必须的,但是包含这3个酰基化半胱氨酸位点的St GRIK1氨基端并不能定位于液泡膜;而进一步对St GRIK1互作蛋白的筛选与验证发现,St GRIK1能与囊泡运输相关蛋白St VAP1互作于液泡膜附近并呈现聚集状,暗示St VAP1可能协助St GRIK1通过囊泡运输途径转运至液泡膜。抑制St GRIK1的表达导致光照后马铃薯叶片淀粉和还原糖的含量及Sn RK1内源的磷酸化水平均降低,进一步对St GRIK1干涉株系的转录组分析结果表明,多个淀粉代谢基因的表达受到影响,暗示St GRIK1可能通过磷酸化Sn RK1而影响马铃薯叶片淀粉代谢基因的表达,从而调控马铃薯叶片淀粉糖代谢,最终影响马铃薯产量。抑制St GRIK1的表达能增强马铃薯对盐胁迫的敏感性并加速黑暗诱导的叶片衰老过程。前人的研究显示盐胁迫和叶片衰老间存在交互,盐胁迫能刺激许多衰老相关基因的表达从而诱导衰老,并且它们能共同激活ROS途径。通过Bi FC分析表明,St GRIK1-St ABI2-St SOS2在马铃薯液泡膜上形成蛋白质复合体,而SOS2是盐胁迫响应途径中的关键因子,同时ROS相关的CAT2和NDPK2是St GRIK1潜在互作蛋白,在拟南芥中CAT2和NDPK2与SOS2也存在互作,暗示马铃薯中可能存在St GRIK1-St ABI2-St SOS2-St CAT2-St NDPK2复合体介导马铃薯对盐胁迫和衰老的响应。此外,St GRIK1在花芽和花中特异高表达,抑制St GRIK1后马铃薯不能在长日照成花,表明St GRIK1在马铃薯成花和花发育过程中起着关键作用。2.马铃薯β淀粉酶St BAM1和St BAM9的在块茎中的低温诱导机制解析通过对St BAM1和St BAM9的启动子区域的克隆和序列分析及St BAM1和St BAM9的表达模式分析发现,它们的启动子上均含有ABA响应元件（ABRE）,同时其表达也受到ABA的诱导,暗示St BAM1和St BAM9可能受到ABA信号途径中能识别ABRE的AREB/ABF/ABI5类转录因子的直接调控。通过全基因组范围内的序列鉴定和分析发现,马铃薯基因组中有7个AREB/ABF/ABI5亚家族成员。亚细胞定位、酵母转录活性和表达模式分析显示,马铃薯AREB/ABF/ABI5s均为核蛋白,St AREB1、St AREB2和St AREB4同时具有转录活性和ABA诱导性,表明这些基因可能是介导ABA信号途径的核心转录因子。体外ABRE结合活性分析和体内对St BAM1和St BAM9的启动子激活分析结果表明,马铃薯AREB/ABF/ABI5s均能识别并结合ABRE,只有St AREB2、St AREB3、St AREB4和St ABL2能同时激活St BAM1和St BAM9的启动子活性,暗示这些成员可能直接调控St BAM1和St BAM9的表达。对低温贮藏块茎的ABA含量测定和ABA合成过程中St NCED1的表达分析结果显示,低温可能通过诱导St NCED1的表达而促进ABA含量的累积。最后通过对块茎贮藏过程中马铃薯AREB/ABF/ABI5亚家族成员与St BAM1和St BAM9的表达模式分析发现,在块茎低温贮藏过程中St AREB2与St BAM1和St BAM9具有相似的表达模式。由此说明,马铃薯块茎在低温贮藏的过程中,低温可能通过诱导St NCED1的表达而导致ABA的累积,随后激活ABA下游的转录因子St AREB2,St AREB2能识别并结合St BAM1和St BAM9上的ABRE而激活其转录,最终促进淀粉降解和还原糖的累积。
石彩云[6]（2019）在《柑橘柠檬酸积累相关的质子泵基因挖掘与关键基因的功能分析》文中研究指明植物细胞内液胞膜上存在三类与有机酸积累相关的质子泵,即P型H+-ATPase（PHA）、V型H+-ATPase（VHA）和V型H+-PPase（VHP）。这些质子泵可使H+从细胞质中泵入液泡,是控制柑橘果实酸含量的重要因子。本文以柑橘基因组数据为基础,首先挖掘并克隆了三个类型的质子泵基因,分析它们的序列和结构特征,然后以‘暗柳橙’（AL,Citrus sinensis cv.Anliu）和其低酸芽变品种‘红暗柳’（HAL,C.sinensis cv.Honganliu）为材料,系统研究了质子泵基因的表达与果实柠檬酸含量之间的关系,以及这些基因对ABA的响应。同时又系统比较了暗柳橙和红暗柳、不同柑橘果实以及果实和叶片之间有机酸含量变化与柠檬酸代谢所有相关基因或CsPH8基因表达之间的关系,结合转基因验证,明确CsPH8可能是导致柠檬酸差异积累最关键的基因,其低表达是导致红暗柳及柑橘叶片低积累柠檬酸的重要原因。具体的结果如下:1.从柑橘基因组中挖掘并鉴定了与柠檬酸积累相关的质子泵基因。其中有20个基因（V1-A、V1-B、V1-C、V1-D、V1-E1、V1-E2、V1-F1、V1-F2、V1-H1、V1-H2、V1-G、V0-a1、V0-a2、V0-c1、V0-c2、V0-c3、V0-c4、V0-c”、V0-d和V0-e）编码VHA各亚基,有4个基因（VHP1、VHP2、VHP3和VHP4）编码VHP,有8个基因（CsPH1、CsPH2、CsPH3、CsPH4、CsPH5、CsPH6、CsPH7和CsPH8）编码PHA。2.通过分析柠檬酸含量与VHA和VHP基因表达的关系,证实柑橘柠檬酸积累受到VHA和VHP的调控。暗柳橙果实发育过程中柠檬酸含量显着高于红暗柳,而ABA处理可促进果实柠檬酸含量显着增加。系统分析VHA和VHP所有基因在暗柳橙不同组织、暗柳橙和红暗柳果实不同发育时期及ABA处理下的表达情况,结果发现:V1-A、V1-C、V1-E1、V1-H2、V0-a2、V0-c4和V0-d,以及4个VHP基因在暗柳橙中的表达量显着高于红暗柳,并且ABA诱导可使这些基因显着上调表达,说明柑橘柠檬酸积累与这些基因的高表达有关,即柑橘柠檬酸的积累确实受到VHA和VHP基因的调控。3.分析PHA所有基因在暗柳橙不同组织、暗柳橙和红暗柳果实、无酸柚和HB柚（或早香柚）果实中的表达,以及对ABA的响应,发现只有CsPH8在汁胞中的表达量显着高于其它组织,而且在相对高酸品种（暗柳橙、HB柚和早香柚）汁胞中的表达量显着高于低酸品种（红暗柳和无酸柚）;另外,ABA处理能够诱导CsPH8表达量显着增加。研究初步证明CsPH8的低表达可能是红暗柳和无酸柚低积累柠檬酸的重要原因,ABA处理促进柠檬酸积累也与CsPH8表达量显着增加有关。4.系统比较了暗柳橙和红暗柳代谢物质变化和柠檬酸代谢相关基因的表达关系,发现红暗柳果实虽然低积累柠檬酸,但是其柠檬酸合成以及利用相关的酶活性或基因表达都显着高于暗柳橙,而质子泵相关基因、尤其是CsPH8的表达量却显着低于暗柳橙,进一步证实CsPH8的低表达是导致红暗柳汁胞低积累柠檬酸的重要原因。5.柑橘果实中柠檬酸含量显着高于其叶片,系统比较果实汁胞和叶片之间柠檬酸含量和柠檬酸代谢相关基因的表达水平,发现大多数品种果实汁胞中CsPH8表达量显着高于叶片,初步表明CsPH8低表达可能也是叶片中低积累柠檬酸的重要原因。6.分析6个常见柑橘品种整个发育时期柠檬酸含量变化与CsPH8基因的表达关系,以及21个柑橘果实样品中可滴定酸含量与CsPH8表达量的相关性,发现CsPH8的表达量与柠檬酸含量显着正相关;进一步在红暗柳叶片、无酸柚汁胞和草莓果实中瞬时表达,以及在番茄中稳定超表达CsPH8,分析其表达量和柠檬酸含量的变化关系,证实CsPH8的表达变化可以影响果实或叶片中柠檬酸的含量。综合来看,柑橘柠檬酸积累受到质子泵基因的调控,ABA处理诱导柠檬酸含量增加也与质子泵基因的表达水平升高密切相关。通过柠檬酸含量与质子泵基因表达相关分析,并结合转基因等试验,证实CsPH8差异表达是不同柑橘品种柠檬酸差异积累的主要原因,而CsPH8低表达是低酸柑橘品种、尤其是红暗柳以及多数柑橘品种叶片低积累柠檬酸的主要原因。
刘金亮[7]（2018）在《一株高效产絮菌的基因组测序及胞外多糖合成组学研究》文中研究指明微生物絮凝剂（Microbial flocculant,MBF）是由微生物产生并分泌到细胞外的聚合物,一般由多糖、蛋白质、核酸等高分子物质构成。由于具有安全高效的特性,微生物絮凝剂已成为国内外广泛使用的水处理剂,但生产成本较高和絮凝效果不稳定等问题,限制了微生物絮凝剂的应用。本研究通过多种检测技术对高效产絮菌A9的生物学和基因组特性,及其在不同碳源培养条件下的转录组和蛋白质组的表达差异等进行了检测分析,从分子水平研究产絮菌的产絮机理,从转录组及蛋白质组学角度研究产絮菌产絮过程差异表达基因、蛋白质及功能调控,为工业化生产微生物絮凝剂提供调控方法。研究结果对揭示产絮菌合成絮凝剂的机制和调控途径,为进一步利用代谢工程等提高微生物絮凝剂的产量,促进微生物絮凝剂资源的开发和利用等提供数据支持和理论依据。应用多种检测技术对产絮菌A9的生理生化、细胞化学组分和16S rRNA基因序列等进行了检测,研究其生物学特性及分类,并对分离提纯的发酵产物进行紫外和红外分析。基于生理生化、细胞化学组分及16S rRNA基因序列等分析结果,产絮菌A9被鉴定为类芽孢杆菌属内的新种。紫外扫描和红外检测等结果表明,产絮菌A9所产絮凝剂的主要成分为多糖类物质,并且吸附架桥是其产生絮凝作用的主要机理。对产絮菌A9生物学特性和絮凝成分的研究,有助于系统的了解产絮菌A9的表型、遗传型、系统发育及其所产絮凝剂的性质,为后续研究产絮菌A9的基因组及絮凝剂合成途径等奠定基础。采用Illumina测序技术对产絮菌A9的DNA进行paired-end测序,研究产絮菌A9基因组、胞外多糖合成相关的功能基因及其代谢途径,并使用分子生物学技术,进行了产絮菌A9胞外多糖合成相关基因的克隆和异源表达。获得产絮菌A9的基因组序列由92个contigs组成,可以组装到67个scaffolds中。应用Glimmer软件成功预测4932个基因,其中有4284个（86.9%）与NCBI-Nr数据库比对到相似序列,共有1,689个蛋白注释到COG家族。通过blastp基于KEGG数据库的功能注释与代谢路径分析,预测了 165条代谢通路,包含糖酵解途径、三羧酸循环、戊糖磷酸途径等产能代谢途径。根据基因组测序分析结果,解析了产絮菌A9在以葡萄糖为碳源时的胞外多糖合成途径,产絮菌A9胞外多糖包含葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、N-乙酰氨基葡萄糖和甘露糖,结果和此前的研究结论一致。参与胞外多糖合成的相关酶包括磷酸葡萄糖变位酶、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶、UDP-葡萄糖脱氢酶等。产絮菌A9的全基因组扫描测序为了解其基因组信息和代谢通路,研究其所产絮凝剂胞外多糖的合成途径和功能基因等提供数据支持。产絮菌A9胞外多糖合成相关基因的克隆和异源表达,为研究产絮菌胞外多糖合成基因的特性和功能,以及后续利用其胞外多糖合成基因构建高效微生物絮凝剂工程菌等提供借鉴。利用RNA-Seq技术进行菌株A9转录组测序,研究产絮菌A9在不同碳源培养条件下的转录表达差异。基因表达差异（发酵vs普通）分析表明,表达差异显着的基因有70个。通过转录组分析表明:相对于普通培养基,在葡萄糖培养基的培养条件下,很多糖类合成及代谢的基因都上调表达。产絮菌A9在不同碳源培养条件下的转录组测序及差异表达基因分析,为从RNA水平研究产絮菌的产絮机理,及其合成微生物絮凝剂胞外多糖的代谢调控等提供数据支持。通过蛋白质双向电泳和质谱鉴定技术,对产絮菌A9在普通培养基、葡萄糖培养基和甘露糖培养基培养条件下的蛋白质组进行了分离和检测,研究产絮菌A9在不同碳源培养条件下蛋白质组表达差异。胶图分析结果表明:产絮菌A9在不同碳源培养条件下蛋白质表达有较大差异。通过质谱分析,共有个54蛋白被成功鉴定,包括二氢硫辛酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、果糖-1,6-二磷酸酶等。这些差异蛋白的功能主要与能量产生和转化,以及碳水化合物的转运和代谢等有关。产絮菌A9在不同碳源培养条件下差异表达蛋白的鉴定分析,为从蛋白质水平研究产絮菌的产絮机理,全面解析和调控产絮菌代谢途径,具有重要的指导意义。在产絮菌A9转录组和蛋白质组检测分析的基础上,通过培养实验,进行产絮菌A9生产微生物絮凝剂胞外多糖的调控研究。建立起培养条件,差异表达基因及蛋白质和产絮变化之间的关系,对工业上生产微生物絮凝剂提出了菌种复壮、底物水平调控、发酵过程参数优化三个层面的调控策略。
张进忠[8]（2018）在《百合鳞茎离体发育及淀粉合成相关酶研究》文中认为食用类百合种球发育较为缓慢,在种植生产过程中,需经过较长时间将鳞片发育形成的鳞茎种球从基叶苗培育成可商品化种植的茎秆苗,在此过程中鳞茎种球的生长由小变大、淀粉含量逐渐积累,此过程也是淀粉富集的过程。从淀粉合成代谢的角度研究鳞茎籽球的发育生理、鳞茎形成及膨大发育相关的淀粉合成酶基因调控机理有助于了解关键基因的调控功能、调控鳞茎膨大发育相关的内外因素,以期建立高效的鳞茎培育技术体系对百合种植产业鳞茎籽球生产环节具有积极指导意义。在研发兰州百合（Lilium davidii var.unicolor（Hoog）Cotton）组培鳞茎发育技术中,根据百合组培苗易生丛芽苗难长鳞茎的特点,设置四个培养阶段,分别为“丛生芽增殖阶段,小鳞茎诱导发育阶段,鳞茎膨大生长阶段,膨大鳞茎分化发育主茎秆阶段”,各阶段筛选不同培养方案,以期达到技术的最优化。在百合鳞茎发育过程中应用电镜观察淀粉颗粒积累变化及对鳞茎淀粉含量、淀粉合成相关酶AGPase、GBSS与SSS酶活性进行测定。为进一步研究相关酶基因表达情况,克隆了AGP、GBSS与SSS基因序列,在鳞茎发育的四个阶段采用实时荧光定量PCR对AGP、GBSS与SSS基因的表达模式进行分析。为研究淀粉合成限速酶基因AGP在百合鳞茎膨大发育过程中对淀粉合成代谢的调控从而影响鳞茎发育的机制,选择300 bp的AGP基因保守序列为干扰片段,利用Gateway技术构建干扰AGP基因的RNAi载体并遗传转化百合组培苗进行反向下调表达研究,荧光定量PCR检测农杆菌转化植株AGP基因的相对表达量变化,Western blot检测转化植株的AGPase蛋白表达情况。主要结果如下:1.丛生芽增殖阶段使用0.30.5 mg/L BA与0.03 mg/L NAA配比能满足丛生芽稳定的继代与增殖,此阶段决定芽体的增殖系数;在小鳞茎诱导发育阶段,通过增加蔗糖浓度使丛生芽增殖阶段获得的芽体苗下部（叶片底端）变态化发育形成鳞片,并从里向外形成层层鳞片,最终形成小鳞茎;鳞茎膨大生长阶段采用0.15 mg/L BA与0.15mg/L GA3配比及适当增加蔗糖浓度使形成的小鳞茎得到急速膨大生长发育,此阶段是整个培养过程中最关键的一步;膨大鳞茎分化发育主茎秆阶段是继续培养膨大鳞茎让其分化出内层鳞片的同时使其鳞茎盘生长点开始分化形成主茎秆,此阶段完成基叶苗到茎秆苗的转变。在鳞茎不同发育阶段通过电镜观察鳞茎形成发育过程,发现其鳞片基部与内部淀粉颗粒的急剧增加及鳞茎盘生长点主茎秆的分化,表明通过所构建的四阶段培养方案能有效培育出膨大的具有主茎秆分化的鳞茎籽球。2.鳞茎发育四个阶段的淀粉含量逐渐增加,分别为19.96%、32.54%、42.68%、46.52%,达到显着性差异水平;AGPase酶活在前三个阶段显着性增加,第四阶段与第三阶段保持平稳,第四阶段开始分化主茎秆,植株所获得蔗糖碳源除分配转移至鳞茎鳞片用于合成淀粉外,部分消耗用于茎秆分化的形态建成。GBSS酶活与AGPase酶活变化类似,而SSS酶活在第三阶段表现活性最低,还需进一步研究。淀粉含量的变化、淀粉合成限速酶AGPase酶活性变化与电镜观察到淀粉颗粒的积累增加及鳞茎膨大发育的变化相一致。3.将克隆获的得AGP、GBSS与SSS基因序列提交NCBI获登录号（KP751443,KP751445、KP751444）;经生物信息学分析,克隆的AGP序列918 bp,含867 bp的开放阅读框,编码289个氨基酸;其氨基酸序列为具有腺苷转移催化功能的“PLN02241”保守结构域,第8-184位氨基酸属“GlycotranfGTAtype”保守结构域,具有糖基转移催化功能,第208-289位氨基酸属“LbetaH”保守结构域,包含5个转角,具有酰基转移酶活性;整个编码区参与淀粉与糖的代谢。GBSS序列567 bp,编码189个氨基酸,第3-188位氨基酸属于“GlycosyltransferaseGTBtype”结构域,具有糖基转移功能及淀粉合成催化活性。SSS序列1257 bp,编码419个氨基酸,具有与催化α-1,4-糖苷键形成有关的“GT1GlycogensynthaseDULL1like”结构域,在第1,4,244-246,305-306,311,328,333氨基酸位形成“ADP-binding pocket”特征结构位点,在第172,348,353-354,356,388位氨基酸形成“homodimer interface”特征结构位点,有绑定催化底物的功能。对所克隆的三个基因编码蛋白结构特征分析,表明其在百合鳞茎发育生长过程中对淀粉合成代谢具有重要意义。实时荧光定量PCR结果表明随着鳞茎发育进程,三基因均显着上调表达,且在鳞茎鳞片的表达显着性高于在叶片的表达。4.成功构建原核表达载体pET28-AGPase,能诱导表达34 kDa蛋白;制备了多克隆抗体,能与百合AGPase酶蛋白特异性反应。利用Gateway BP反应将干扰序列插入入门载体pDONR221,再进行LR反应将该序列正反向插入干扰载体pJawohl8-RNAi中,构建pDONR221-AGP入门克隆与pJawohl8-RNAi-AGP表达克隆,遗传转化百合愈伤诱导出AGPase蛋白表达量下调的转化植株;表明选择的AGP保守序列能作为干扰片段对百合内源AGP转录的mRNA进行下调;为研究AGP基因在百合鳞茎膨大发育过程中对淀粉合成代谢的影响从而调控鳞茎发育机制提供了信息。
张晓芳[9]（2018）在《矮沙冬青液泡膜氢离子焦磷酸酶基因（AnVP1）的异源表达提高玉米耐旱性》文中认为干旱制约着玉米的生产及发展,严重影响玉米生长发育及籽粒产量。传统育种方法选育耐旱品种周期长、效率低,更由于玉米自身耐旱种质资源狭窄,难以选育成能满足生产需求的耐旱品种。因此,挖掘具有自主知识产权的抗旱抗逆基因是玉米抗逆转基因研究的必须之路。转基因技术可克服物种间的生殖障碍,转化利用其他物种的耐旱基因,是克服干旱威胁最为经济有效的措施。在前期研究中,课题组从残遗超旱生植物矮沙冬青中,克隆了液泡膜氢离子焦磷酸酶基因（AnVP1）,转化酵母和拟南芥突变体验证其对非生物逆境的抗性后,用农杆菌介导法转化玉米自交系,共获得47个T1代转基因株系。本研究对AnVP1基因推导蛋白进行安全性预测后,结合除草剂抗性筛选、特异PCR扩增、高效热不对称交错式PCR（High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR,hiTAIL-PCR）、反转录PCR（Reverse-transcription PCR,RT-PCR）和RNA测序（RNA-sequencing,RNA-seq）、盆栽和田间耐旱性鉴定等方法,对这47个转基因株系进行了繁育和鉴定,主要结果如下:（1）数据库比对结果,AnVP1基因推导蛋白与所有已知毒蛋白、过敏原和抗营养因子均不同源,说明我们克隆的AnVP1基因是安全的,可用于转化玉米等作物。（2）在自交繁育的同时,结合田间抗除草剂筛选和特异PCR鉴定,繁育获得26个T3代株系,其中12个株系在T2代的阳性率即达100%,表明这12个T3代株系已经纯合,可用于后续抗性鉴定（3）用hiTAIL-PCR扩增出A1、A16和A49三个T2代株系T-DNA整合位点右边界的侧翼序列,将这三个株系T-DNA整合位点分别定位于第5、6和6号染色体,并且发现A31、A33和A37三个株系T-DNA的整合携带了部分表达载体骨架。（4）用RT-PCR方法可从12个纯合的T3代株系中均检测到AnVP1基因的表达,表明AnVP1基因不仅整合进玉米基因组,也在玉米中异源表达。（5）在T2和T3代株系反复多次的盆栽试验中,标记为A31、A33和A37的三个株系的幼苗在干旱胁迫15 d后复水,能全部恢复生长,耐旱性显着高于未转基因对照,而其余株系只有部分恢复生长,与未转基因对照差异不明显。（6）RNA-seq分析表明,A31、A33和A37株系分别有285、169和288内源基因较未转基因对照差异表达。其中,上调表达的分别有149、92和115个,下调表达的分别有136、77和173个基因,在3个转基因株系中共同上调和下调表达的分别有6和12个。GO分析表明,在差异表达基因中,分子功能相关基因有326个,涉及催化活性、结合和转录调控等代谢途径,归分为12个种类;细胞组分相关基因有115个,涉及细胞和细胞器成分等,归分为11个类型;生物学过程相关基因有245个,涉及代谢过程、细胞进程、应激反应、生物调节和发育过程等,分为17类。由此说明,T-DNA的整合还可能通过对内源基因表达的影响间接调控胁迫应答、糖代谢及生长发育。（7）田间试验表明,转基因株系A765的单株粒重及其在干旱胁迫条件下的耐旱系数均显着高于未转基因对照和优良自交系郑58,转基因株系A737在非胁迫条件下的单株粒重也显着高于未转基因对照。上述结果表明,矮沙冬青AnVP1基因已整合到玉米基因组中,其异源表达提高了转基因株系的耐旱性。经进一步筛选繁育、表型鉴定和安全性评价后,所获转基因株系有望应用于耐旱玉米品种培育。
于好强[10]（2017）在《矮沙冬青四个抗逆基因的功能研究》文中提出矮沙冬青（Ammopiptanthus nanus）又名新疆沙冬青,与蒙古沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）同属豆科沙冬青属,是第三纪古地中海消失后的残遗物种。沙冬青对干旱、盐碱、贫瘠和极端温度等非生物逆境耐受性极强,是抗逆性极好且极珍贵的遗传资源。目前,关于沙冬青非生物逆境抗性基因的研究主要集中在蒙古沙冬青,鲜有关于矮沙冬青抗逆基因克隆及功能解析的报道。甜菜碱醛脱氢酶（Betaine aldehyde dehydrogenase,BADH）是甜菜碱合成途径的关键酶,而甜菜碱是植物细胞中重要的渗透调节物质。钼辅助因子硫酸化酶（Molybdenum cofactor sulfurase,MCSU）催化钼辅助因子硫酸化,而硫酸化后的钼辅助因子则与脱落酸醛氧化酶一起在脱落酸（Abscisic acid,ABA）合成最后一步反应中催化脱落酸醛氧化生成ABA。磷脂酶D（Phospholipase D,PLD）催化磷脂降解产生磷脂酸,在植物生长发育及逆境应答中起重要作用。液泡膜氢离子焦磷酸酶（Vacuolar H+-pyrophosphatase,H+-PPase或V-PPase）是液泡膜上的氢离子泵之一,水解焦磷酸盐产生势能,促进离子向液泡内转运。这4种酶参与不同生理代谢途径,与植物生长发育及逆境应答紧密相关。目前,已有关于其基因克隆、功能验证及转基因利用的报道,但尚未从抗逆性极强的矮沙冬青中克隆并研究其基因功能。为避免转基因抗逆品种培育方面的专利纠纷,本研究在前期用cDNA末端快速扩增技术从矮沙冬青中克隆得到AnBADH、AnMCSU、AnPLDα和AnVP1基因的基础上,综合运用实时定量PCR、原核表达、亚细胞定位、酵母或拟南芥突变体功能互补或过表达等技术,解析这4个基因的抗逆功能,以期为作物抗非生物逆境的转基因改良提供优异的基因资源。研究结果如下:（1）AnBADH基因cDNA序列全长1868 bp,开放阅读框（Open reading frame,ORF）1512 bp,编码503个氨基酸,分子量54.71 kDa,等电点pH5.39,不稳定系数28.36,总平均亲水指数-0.015,具有一个BADH蛋白典型的磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖型醛脱氢酶超家族保守结构域,不具有跨膜区和信号肽。AnBADH基因在矮沙冬青中的内源表达受高盐、干旱、高温、低温胁迫和ABA诱导。转AnBADH基因的大肠杆菌菌株,在高盐胁迫下的生长速度和高温胁迫下的存活率显着高于未转化对照。在高盐及干旱胁迫条件下,AnBADH基因在拟南芥中的异源表达显着促进根系发育,转基因株系相对含水量、甜菜碱及游离脯氨酸含量显着高于未转基因对照,相对电解质渗出率及丙二醛含量显着低于未转基因对照。（2）AnMCSU基因cDNA序列全长2544 bp,ORF长2289 bp,编码762个氨基酸,分子量84.85 kDa,等电点pH6.02,不稳定系数37.95,总平均亲水指数-0.255,具有MCSU蛋白典型的结构域,不具有跨膜区和信号肽。生物信息学预测和在烟草叶片中的瞬时表达检测表明,AnMCSU蛋白定位于细胞质。AnMCSU基因在矮沙冬青中的内源表达受高温、干旱、高盐及ABA诱导,受低温抑制,在拟南芥中异源表达促进种子发芽和根系发育。在高盐和低温胁迫条件下,转基因株系ABA含量和游离脯氨酸含量显着高于未转基因对照,表现较强的耐盐和抗冻性。（3）AnPLDα基因cDNA序列全长2832 bp,ORF长2427 bp,编码808个氨基酸,分子量91.58 kDa,等电点pH5.47,不稳定系数43.82,总平均亲水指数-0.418,具有PLDα蛋白典型的C2结构域和HKD基序,不具有跨膜区和信号肽。生物信息学预测和在烟草叶片中的瞬时表达检测表明,AnPLDα蛋白定位于细胞质。AnPLDα基因在矮沙冬青中的内源表达受干旱、高盐、低温及ABA诱导,受高温抑制,在拟南芥中的异源表达促进根系发育,在胁迫条件下抵制种子发芽。在高盐胁迫及ABA诱导条件下,转基因株系的丙二醛含量显着低于未转基因对照,表现较强的耐盐性,抗逆相关基因AtABI、AtNCED、AtRD29A、AtRD29B和AtADH的内源表达上调。（4）AnVP1基因cDNA序列全长2684 bp,ORF长2298 bp,编码765个氨基酸,分子量80.13 kDa,等电点pH5.46,不稳定系数23.02,总平均亲水指数0.631,具有5个V-PPase蛋白典型的保守结构域和13个跨膜区。AnVP1基因在矮沙冬青中的内源表达受高盐、干旱及ABA诱导,受高温和低温抑制,在酵母突变体中的异源表达可抑制其对高盐和渗透胁迫的敏感性,拟南芥中的异源表达促进根系发育。在高盐和干旱胁迫条件下,转基因株系Na+/K+离子、相对水和游离辅氨酸含量显着高于未转基因对照,丙二醛含量和相对电解质渗出率显着低于未转基因对照。上述结果表明,AnBADH、AnMCSU、AnPLDα和AnVP1四个基因在矮沙冬青非生物逆境抗性中起重要作用,在模式植物中的异源表达可显着增强其抗逆性,可用于作物抗逆转基因研究。
二、大肠杆菌焦磷酸酶基因的克隆和序列分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、大肠杆菌焦磷酸酶基因的克隆和序列分析（论文提纲范文）
（1）桑树（Morus alba）三个干旱诱导基因的表达规律及MaCDSP32基因的功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 干旱对植物生长的影响 |
| 1.2 植物抗旱性的研究进展 |
| 1.2.1 植物的抗旱性与旱后复水恢复生长的调节机制 |
| 1.2.2 植物的抗旱性评价体系及提高植物抗逆性的需求和措施 |
| 1.3 植物非生物胁迫下的氧化还原调节系统 |
| 1.3.1 非生物胁迫对植物氧化还原系统的影响 |
| 1.3.2 非生物胁迫下植物细胞中ROS的产生和代谢 |
| 1.4 植物硫氧还蛋白家族(Trxs)及其广泛作用 |
| 1.4.1 Trxs功能概况 |
| 1.4.2 叶绿体中的Trxs系统 |
| 1.4.3 叶绿体中一种类硫氧还蛋白-CDSP32 |
| 1.5 植物胞质抗坏血酸过氧化物酶(APX)研究进展 |
| 1.6 植物生长素氨基酸水解酶家族(ILR-like)研究进展 |
| 1.7 参与植物抗逆性几种胁迫应答因子的研究进展 |
| 1.7.1 脯氨酸参与抗逆性的研究进展 |
| 1.7.2 甜菜碱参与抗逆性的研究进展 |
| 1.7.3 可溶性糖类参与抗逆性的研究进展 |
| 1.7.4 脱落酸(ABA)参与抗逆性的研究进展 |
| 1.7.5 超氧化物歧化酶(SOD)参与抗逆性的研究进展 |
| 1.8 桑树抗逆性及资源应用研究进展 |
| 1.8.1 古老的桑树物种及其生存能力 |
| 1.8.2 桑树资源应用发展现状 |
| 1.8.3 桑树抗旱性分子机制研究进展 |
| 1.9 本研究前期工作基础和技术依据 |
| 1.9.1 前期工作基础 |
| 1.9.2 技术流程 |
| 第二章 桑树中MaCDSP32、MaILR1和MaAPX2 基因克隆和序列分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 植物材料 |
| 2.2.2 主要仪器设备 |
| 2.2.3 主要试剂及菌株 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 桑树叶片总RNA提取与鉴定 |
| 2.3.2 桑树叶片cDNA合成 |
| 2.3.3 基因克隆 |
| 2.3.4 序列的生物信息学分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 桑树中三个基因编码区克隆及测序 |
| 2.4.2 核酸和氨基酸序列的生物信息学分析 |
| 2.4.3 编码蛋白的系统发育树分析 |
| 2.4.4 GO(Gene ontology)数据库预测目标基因功能 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 MaCDSP32、MaILR1和MaAPX2 的表达模式分析及多克隆抗体制备 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.2.1 植物材料与胁迫处理 |
| 3.2.2 主要试剂耗材及仪器 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 总RNA提取和反转录cDNA |
| 3.3.2 基因定量引物设计 |
| 3.3.3 实时荧光定量qRT-PCR |
| 3.3.4 叶片含水量测定 |
| 3.3.5 脯氨酸含量测定 |
| 3.3.6 原核表达载体的构建 |
| 3.3.7 多克隆抗体制备 |
| 3.3.8 多克隆抗体效价检测 |
| 3.3.9 数据统计分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 基因在桑树地上部分组织的表达规律 |
| 3.4.2 基因在不同桑树品种中的表达规律 |
| 3.4.3 基因在桑树中的生物钟节律表达规律 |
| 3.4.4 盐胁迫对基因表达水平的影响 |
| 3.4.5 高温胁迫对基因表达水平的影响 |
| 3.4.6 水分胁迫对基因表达水平的影响 |
| 3.4.7 施加外源ABA对基因表达水平的影响 |
| 3.4.8 施加外源乙烯利对基因表达水平的影响 |
| 3.4.9 施加外源水杨酸对基因表达水平的影响 |
| 3.4.10 氨基酸序列的抗原性分析 |
| 3.4.11 基因表达与蛋白纯化 |
| 3.4.12 多克隆抗体效价检测 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 MaCDSP32、MaILR1和MaAPX2 的瞬时表达分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 试验材料 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 植物表达载体构建 |
| 4.3.2 重组质粒转化农杆菌 |
| 4.3.3 基因瞬时转化桑叶的处理方式 |
| 4.3.4 qRT-PCR检测基因表达量 |
| 4.3.5 叶片中H_2O_2和O_2~-的含量测定 |
| 4.3.6 转化烟草的亚细胞定位分析 |
| 4.3.7 数据统计分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 基因瞬时转化浸染后离体桑叶的状态 |
| 4.4.2 基因产物的亚细胞定位 |
| 4.4.3 瞬时表达MaCDSP32 基因对离体桑叶持水能力的影响 |
| 4.4.4 MaCDSP32 瞬时表达离体桑叶的自然失水情况 |
| 4.4.5 NaCl胁迫下离体桑叶气孔开度的变化 |
| 4.4.6 PEG胁迫下离体桑叶气孔开度的变化 |
| 4.4.7 PEG处理下胁迫相关基因表达量的变化 |
| 4.4.8 NaCl处理下胁迫相关基因表达量的变化 |
| 4.4.9 基因产物的亚细胞定位确认 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 桑树MaCDSP32 转化烟草的功能研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 试验材料 |
| 5.2.1 植物材料和生长条件 |
| 5.2.2 主要试剂和耗材 |
| 5.2.3 主要仪器 |
| 5.3 试验方法 |
| 5.3.1 叶盘法转化烟草及转基因烟草鉴定 |
| 5.3.2 MaCDSP32 表达产物亚细胞定位 |
| 5.3.3 转基因烟草非生物胁迫处理 |
| 5.3.4 转基因烟草种子萌发和幼苗生长处理 |
| 5.3.5 丙二醛、脯氨酸、可溶性糖和甜菜碱含量测定 |
| 5.3.6 叶片中ROS的组织定位和含量测定 |
| 5.3.7 SOD、APX、POD和 CAT抗氧化酶活性测定 |
| 5.3.8 光合作用气体交换参数测定 |
| 5.3.9 叶绿色素含量测定 |
| 5.3.10 数据统计分析 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 CDSP32序列在桑树和烟草中的同源性比对 |
| 5.4.2 阳性转基因烟草PCR鉴定 |
| 5.4.3 MaCDSP32 表达产物的亚细胞定位 |
| 5.4.4 MaCDSP32 对转基因烟草抗逆性的影响 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 桑树MaCDSP32 转化拟南芥的功能研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 试验材料 |
| 6.2.1 植物材料和生长条件 |
| 6.2.2 主要试剂和耗材 |
| 6.2.3 主要仪器 |
| 6.3 试验方法 |
| 6.3.1 构建MaCDSP32 过表达拟南芥植株 |
| 6.3.2 突变体拟南芥T-DNA插入鉴定 |
| 6.3.3 转基因拟南芥种子胁迫处理 |
| 6.3.4 转基因拟南芥植株非生物胁迫处理 |
| 6.3.5 生理生化指标测定 |
| 6.3.6 拟南芥叶片气孔开度测量 |
| 6.3.7 数据统计分析 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 MaCDSP32和AtCDSP32 序列同源性分析 |
| 6.4.2 AtCDSP32 突变体拟南芥植株鉴定 |
| 6.4.3 转基因拟南芥株系在非生物胁迫下的抗逆性分析 |
| 6.4.4 干旱胁迫对转基因拟南芥气孔开度的影响 |
| 6.4.5 非生物胁迫对转基因拟南芥抗氧化物酶活性的影响 |
| 6.4.6 非生物胁迫对拟南芥抗氧化物酶编码基因表达量的影响 |
| 6.4.7 渗透胁迫对拟南芥种子萌发及幼苗生长的影响 |
| 6.4.8 MaCDSP32 过表达拟南芥植株的早花现象 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 MaCDSP32 转基因烟草干旱胁迫转录组数据分析 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 试验材料 |
| 7.2.1 植物材料 |
| 7.2.2 胁迫处理方式及取样 |
| 7.3 试验方法 |
| 7.3.1 样品转录组文库构建 |
| 7.3.2 上机测序 |
| 7.3.3 信息分析流程 |
| 7.4 结果与分析 |
| 7.4.1 OE和WT烟草干旱样品转录组数据总体分析 |
| 7.4.2 OE和WT烟草干旱转录组样品差异表达基因分析 |
| 7.4.3 OE和WT烟草干旱转录组差异表达基因维恩图 |
| 7.4.4 OE和WT烟草干旱转录组差异表达基因聚类热图 |
| 7.4.5 OE和WT烟草干旱差异表达基因GO富集分析 |
| 7.4.6 OE和WT烟草复水差异表达基因KEGG通路分析 |
| 7.4.7 半胱氨酸和甲硫氨酸代谢途径差异基因KEGG通路分析 |
| 7.4.8 淀粉和糖代谢途径差异基因KEGG通路分析 |
| 7.4.9 油菜素类固醇代谢途径差异基因KEGG通路分析 |
| 7.4.10 植物激素信号传导代谢途径差异基因KEGG通路分析 |
| 7.4.11 光合元件固碳作用代谢途径差异基因KEGG通路分析 |
| 7.4.12 硫代谢途径差异基因KEGG通路分析 |
| 7.5 干旱和复水相反生理参数涉及差异表达基因GO富集分析 |
| 7.6 小结 |
| 第八章 结论 |
| 8.1 本研究总结 |
| 8.2 本研究创新点 |
| 8.3 有待进一步研究的问题 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）柿原花青素前体转运相关基因DkAHA1的克隆和功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 前言 |
| 1.1 课题的提出 |
| 1.2 文献综述 |
| 1.2.1 原花青素研究进展 |
| 1.2.2 ATPase在植物中的作用 |
| 1.2.3 AHA基因家族 |
| 1.2.4 启动子的结构和分类 |
| 1.3 研究目的和研究内容 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植株材料 |
| 2.1.2 载体质粒 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 RNA提取及cDNA合成 |
| 2.2.2 RACE克隆Dk AHA1 基因全长 |
| 2.2.3 实时荧光定量PCR |
| 2.2.4 柿果肉、叶片原花青素的提取与检测 |
| 2.2.5 DkAHA系统进化分析 |
| 2.2.6 DkAHA1亚细胞定位和超表达载体的构建 |
| 2.2.7 农杆菌介导的烟草瞬时表达 |
| 2.2.8 DkAHA1干涉表达载体的构建 |
| 2.2.9 柿果肉瞬时遗传转化 |
| 2.2.10 DkAHA1基因启动子克隆 |
| 2.2.11 GUS载体构建 |
| 2.2.12 p AHA1-Ab Ai载体构建 |
| 2.2.13 Y1HGold[p AHA1-Ab Ai]诱饵菌株构建 |
| 2.2.14 诱饵菌株AbA浓度筛选 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 DkAHA1的全长克隆 |
| 3.2 系统进化树构建与序列比对 |
| 3.2.1 P3A-ATPase基因系统发育分析 |
| 3.2.2 DkAHA1基因氨基酸序列分析 |
| 3.3 不同原花青素积累量的柿果中DkAHA1基因的时空表达分析 |
| 3.3.1 DkAHA基因在‘鄂柿1号’各器官中的表达 |
| 3.3.2 ‘鄂柿1号’、‘阳丰’和‘磨盘柿’果实发育过程中DkAHA1基因的表达变化 |
| 3.4 DkAHA1的亚细胞定位 |
| 3.5 超表达和干涉表达DkAHA1柿果圆片的分析 |
| 3.5.1 超表达和干涉表达DkAHA1对柿果圆片中基因表达的影响 |
| 3.5.2 超表达和干涉表达DkAHA1原花青素含量的变化 |
| 3.6 DkAHA1启动子克隆及序列分析 |
| 3.6.1 DkAHA1启动子的扩增 |
| 3.6.2 DkAHA1启动子生物信息学分析 |
| 3.7 启动子在烟草中的表达活性 |
| 3.8 启动子转化Y1HGold酵母菌株 |
| 3.8.1 诱饵载体的构建 |
| 3.8.2 酵母感受态的转化 |
| 3.8.3 报告基因AbAr本底表达水平检测 |
| 4 讨论 |
| 5 进一步研究设想 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简历及在学期间的科研活动 |
| 致谢 |
（3）酸性磷酸酶OsACP1在水稻缺磷适应性中的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表(Abbreviation) |
| 1 文献综述 |
| 1.1 磷肥施用现状与存在的问题 |
| 1.2 高等植物应对低磷胁迫的生理生化机制 |
| 1.3 缺磷诱导酸性磷酸酶 |
| 1.4 卤酸脱卤素酶(HAD)超家族概况 |
| 1.5 缺磷诱导的磷脂代谢过程 |
| 1.5.1 细胞内有机磷组成及含量 |
| 1.5.2 缺磷诱导的磷脂代谢过程 |
| 1.5.3 HAD酸性磷酸酶在磷脂代谢过程中的作用 |
| 2 研究目的与研究内容 |
| 2.1 研究意义 |
| 2.2 研究内容 |
| 2.2.1 OsACP1蛋白的亚细胞定位分析 |
| 2.2.2 OsACP1及同源蛋白的酶活性特征分析 |
| 2.2.3 OsACP1时空及组织特异性表达分析 |
| 2.2.4 OsACP1超表达/突变体等材料创制及生理表型分析 |
| 2.2.5 OsACP1超表达/突变体等材料生化分析 |
| 2.3 技术路线 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株 |
| 3.1.2 水稻品种 |
| 3.1.3 载体 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 感受态细胞的制备与转化 |
| 3.2.2 水稻转基因方法 |
| 3.2.3 OsACP1基因的生物信息学分析 |
| 3.2.4 OsACP1基因的克隆与载体的构建 |
| 3.2.5 植物生长条件 |
| 3.2.6 OsACP1基因的表达分析 |
| 3.2.7 GUS染色及显微镜观察 |
| 3.2.8 GUS酶活测定 |
| 3.2.9 重组蛋白的原核表达与纯化 |
| 3.2.10 OsACP1重组蛋白的酶学分析 |
| 3.2.11 原生质体的提取与转化 |
| 3.2.12 植物样品中磷含量测定 |
| 3.2.13 植物脂质提取与测定 |
| 3.2.14 统计方法 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 OsACP1生物信息学分析 |
| 4.1.1 OsACP1基因结构分析 |
| 4.1.2 OsACP1基因的启动子分析 |
| 4.1.3 OsACP1进化树构建 |
| 4.2 OsACP1基因的表达分析 |
| 4.2.1 OsACP1在不同养分缺乏下的表达分析 |
| 4.2.2 OsACP1在缺磷不同时间点的定量分析 |
| 4.2.3 OsACP1基因组织表达分析 |
| 4.3 OsACP1原核表达与蛋白纯化 |
| 4.4 OsACP1酶学特性分析 |
| 4.5 OsACP1的亚细胞定位分析 |
| 4.6 转基因材料的分子鉴定 |
| 4.7 OsACP1转基因材料生理生化表型分析 |
| 4.7.1 OsACP1超表达材料生长表型 |
| 4.7.2 Os ACP1 CRISPR材料的生长表型 |
| 4.7.3 OsACP1转基因水稻磷脂组分分析 |
| 4.7.4 OsACP1转基因水稻农艺性状考察 |
| 5 讨论 |
| 6 研究总结与展望 |
| 6.1 研究总结 |
| 6.2 主要创新点 |
| 6.3 研究不足之处 |
| 6.4 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录 :研究生阶段主要成果 |
| 致谢 |
（4）苹果种质资源有机酸含量评价及酸含量调控候选基因MtPEPP功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 果实中的有机酸代谢 |
| 1.1.1 果实细胞质中有机酸代谢 |
| 1.1.2 果实细胞线粒体中有机酸代谢 |
| 1.2 果实有机酸在液泡中的储存与转运 |
| 1.2.1 有机酸在液泡膜上的转运 |
| 1.2.2 质子泵对酸度的影响 |
| 1.3 焦磷酸酶质子泵研究进展 |
| 1.4 果实有机酸分子调控机制 |
| 1.5 农业技术措施对果实有机酸含量的影响 |
| 1.6 研究的目的及意义 |
| 第二章 苹果种质资源有机酸评价及果实酸度相关基因筛选 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 生物材料 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 苹果果实酸度测定 |
| 2.2.2 苹果种质资源的基因分型 |
| 2.2.3 总RNA的提取与c DNA合成 |
| 2.2.4 PEPP在苹果中表达量测定 |
| 2.2.5 数据分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 有机酸化学标准品的高效液相色谱分析 |
| 2.3.2 苹果种质资源果实有机酸测定 |
| 2.3.3 苹果栽培种和野生种有机酸成分的遗传关系和多样性估算 |
| 2.3.4 苹果属植物有机酸组成的变化 |
| 2.3.5 苹果不同发育阶段苹果酸和柠檬酸含量的动态变化 |
| 2.3.6 转录组样品总有机酸含量 |
| 2.3.7 转录组分析 |
| 2.3.8 转录组数据分析 |
| 2.3.9 栽培苹果有机酸含量和MtPEPP表达量测定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 苹果属植物果实有机酸含量与种类分析 |
| 2.4.2 果实酸度候选基因的筛选 |
| 第三章 变叶海棠果实高酸含量候选调控基因MtPEPP功能鉴定 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 生物材料 |
| 3.1.2 载体和感受态细胞 |
| 3.1.3 主要化学试剂和酶 |
| 3.1.4 药剂配制 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 MtPEPP基因扩增与克隆 |
| 3.2.2 MtPEPP基因的亚细胞定位分析 |
| 3.2.3 MtPEPP在番茄‘Micro-Tom’中的异源表达 |
| 3.2.4 MtPEPP苹果果肉愈伤组织中过量表达 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 MtPEPP基因扩增与克隆 |
| 3.3.2 MtPEPP基因的亚细胞定位分析 |
| 3.3.3 MtPEPP在番茄‘Micro-Tom’中的异源表达 |
| 3.3.4 MtPEPP苹果果肉愈伤组织中过量表达 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.2 MtPEPP的基因克隆与定位 |
| 3.4.3 遗传转化分析 |
| 第四章 结论与创新点 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略表 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（5）马铃薯StGRIK1的功能研究及低温诱导StBAM1与StBAM9表达的机制解析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 马铃薯概述 |
| 1.1.1 马铃薯的起源和驯化 |
| 1.1.2 马铃薯的营养价值和用途 |
| 1.1.3 中国马铃薯产业概况和面临的问题 |
| 1.2 淀粉代谢研究进展 |
| 1.2.1 植物淀粉概述 |
| 1.2.2 植物淀粉合成代谢途径 |
| 1.2.3 植物淀粉降解代谢途径 |
| 1.2.4 淀粉代谢相关酶的调控研究进展 |
| 1.2.5 马铃薯叶片和块茎中可能的淀粉代谢途径 |
| 1.2.6 马铃薯淀粉代谢相关基因的研究进展 |
| 1.2.7 马铃薯块茎淀粉代谢与低温糖化现象 |
| 1.3 本研究的目的和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 植物材料、生长条件及处理 |
| 2.1.2 本研究所使用的菌株和载体 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.2 基础试验方法 |
| 2.2.1 序列比对、进化树分析和结果呈现 |
| 2.2.2 DNA的抽提 |
| 2.2.3 RNA的抽提 |
| 2.2.4 cDNA的制备 |
| 2.2.5 PCR及定量q RT-PCR |
| 2.2.6 质粒提取、琼脂糖胶回收、质粒酶切及载体构建 |
| 2.2.7 农杆菌电击转化 |
| 2.2.8 农杆菌介导的烟草瞬时表达及亚细胞定位分析 |
| 2.2.9 蛋白质表达和纯化 |
| 2.2.10 酵母转化 |
| 2.2.11 数据分析 |
| 2.3 第三章研究内容所涉及的试验方法 |
| 2.3.1 序列检索和分析 |
| 2.3.2 激酶活性测定和Western blot检测SnRK1 的磷酸化水平 |
| 2.3.3 农杆菌介导的马铃薯遗传转化及阳性株系的筛选鉴定 |
| 2.3.4 马铃薯生理生化指标测定 |
| 2.3.5 GST pull-down试验和蛋白质质谱鉴定 |
| 2.3.6 酵母杂交文库筛选 |
| 2.3.7 RNA-seq差异表达基因分析 |
| 2.3.8 双分子荧光互补(BiFC)实验 |
| 2.4 第四章研究内容所涉及的试验方法 |
| 2.4.1 序列检索和分析 |
| 2.4.2 酵母系统的转录活性分析 |
| 2.4.3 凝胶迁移(EMSA,Electrophoretic Mobility Shift Assays) |
| 2.4.4 双荧光素酶试验 |
| 2.4.5 块茎ABA含量的测定 |
| 第三章 马铃薯SnRK1 上游激酶StGRIK1 的功能研究和机制解析 |
| 3.1 前言 |
| 3.1.1 SnRK1 及其上游激酶GRIK的研究进展 |
| 3.1.2 .蛋白质的酰基化修饰与液泡转运过程 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 马铃薯SnRK1 上游激酶GRIKs的鉴定、序列分析和体外激酶活性测定 |
| 3.2.2 StGRIK1 在马铃薯中的功能分析 |
| 3.2.3 StGRIK1 互作蛋白筛选及其对叶片基因表达的影响 |
| 3.2.4 马铃薯StGRIK1 的亚细胞定位及其定位机制探究 |
| 3.2.5 StGRIK1 在马铃薯中发挥功能的机制解析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 马铃薯SnRK1 上游激酶StGRIK1 的鉴定和分析 |
| 3.3.2 StGRIK1 可能受到转录后水平调控 |
| 3.3.3 StGRIK1 的亚细胞定位分析 |
| 3.3.4 StGRIK1 在马铃薯生长发育和淀粉代谢调控中的重要功能 |
| 3.3.5 StGRIK1 在盐胁迫和叶片衰老过程中的功能 |
| 第四章 马铃薯β淀粉酶StBAM1和StBAM9 在块茎中的低温诱导机制探究 |
| 4.1 前言 |
| 4.1.1 ABA信号途径概述 |
| 4.1.2 AREB/ABF/ABI5s亚家族概述 |
| 4.1.3 ABA在调控植物淀粉糖代谢过程中的功能 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 β淀粉酶StBAM1和StBAM9 启动子克隆和应答分析 |
| 4.2.2 马铃薯识别ABRE的AREB/ABF/ABI5转录因子亚家族成员的鉴定和分析 |
| 4.2.3 马铃薯AREB/ABF/ABI5 成员与StBAM1和StBAM9 启动子互作分析 |
| 4.2.4 低温能促进ABA的累积并诱导块茎St AREB2及StBAM1 与StBAM9的表达 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 马铃薯中的AREB/ABF/ABI5 亚家族分析 |
| 4.3.2 ABA通过激活AREB/ABF/ABI5 转录因子促进植物淀粉降解和糖的累积 |
| 4.3.3 低温诱导植物ABA含量的升高并促进植物淀粉降解和糖的累积 |
| 第五章 讨论与展望 |
| 5.1 马铃薯上游SnRK1 激酶StGRIK1 的鉴定及功能机制解析 |
| 5.2 块茎低温贮藏诱导StBAM1和StBAM9 表达的机制 |
| 5.3 展望 |
| 5.3.1 StGRIK1 定位液泡膜的机制以及探究液泡定位对其功能的实现是否至关重要 |
| 5.3.2 StGRIK1 的转录后水平调控机制 |
| 5.3.3 StGRIK1 介导的淀粉代谢酶的协同调控机制 |
| 5.3.4 StAREB2 介导的块茎低温贮藏过程中的淀粉降解作用 |
| 参考文献 |
| 附录A |
| 附录B |
| 附录C |
| 附录D |
| 附录E |
| 附录F 博士期间发表或参与发表的文章 |
| 致谢 |
（6）柑橘柠檬酸积累相关的质子泵基因挖掘与关键基因的功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 1 课题的提出 |
| 2 前人研究进展 |
| 2.1 柑橘柠檬酸代谢研究进展 |
| 2.1.1 柑橘柠檬酸积累的多样性 |
| 2.1.2 柑橘柠檬酸合成相关研究 |
| 2.1.3 柑橘柠檬酸运输相关研究 |
| 2.1.4 柑橘柠檬酸分解相关研究 |
| 2.2 酸积累相关质子泵基因的研究进展 |
| 2.2.1 V型质子泵相关研究 |
| 2.2.2 P型质子泵相关研究 |
| 2.3 脱落酸(ABA)对有机酸积累调控研究 |
| 3 本研究的内容、目的与意义 |
| 第二章 柑橘V型质子泵基因的挖掘、鉴定及功能初步分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 柠檬酸含量测定 |
| 2.2.2 柑橘V型质子泵基因挖掘 |
| 2.2.3 总RNA的提取和c DNA的合成 |
| 2.2.4 质子泵基因的克隆鉴定 |
| 2.2.5 qRT-PCR试验 |
| 2.2.6 基因的生物信息学分析 |
| 2.3 数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 暗柳橙和红暗柳果实发育过程中柠檬酸含量分析 |
| 3.2 V-H~+-ATPase(VHA)基因的挖掘、验证和表达分析 |
| 3.2.1 柑橘VHA基因的挖掘与验证 |
| 3.2.2 VHA基因在暗柳橙中的组织特异性表达分析 |
| 3.2.3 暗柳橙和红暗柳果实发育过程中VHA基因的表达变化 |
| 3.2.4 ABA对柠檬酸含量和VHA基因表达的影响 |
| 3.3 V-H~+-PPase(VHP)基因的挖掘、验证和表达分析 |
| 3.3.1 VHP基因的挖掘与验证 |
| 3.3.2 VHP基因的序列分析 |
| 3.3.3 VHP基因在暗柳橙组织特异性表达分析 |
| 3.3.4 暗柳橙和红暗柳果实发育过程中VHP基因的表达变化 |
| 3.3.5 ABA注射对果实中柠檬酸含量和VHP基因表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 柑橘V型质子泵基因挖掘与鉴定分析 |
| 4.2 V型质子泵在有机酸积累中的作用探讨 |
| 4.3 脱落酸处理下V型质子泵基因的表达与有机酸积累的关系 |
| 第三章 柑橘P型质子泵基因的挖掘、鉴定及功能初步分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 柠檬酸含量的测定 |
| 2.2.2 基因的挖掘与验证 |
| 2.2.3 RNA的提取及c DNA的合成 |
| 2.2.4 质子泵基因的克隆与qRT-PCR分析 |
| 2.2.5 基因的生物信息学分析 |
| 2.3 数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 P-H~+-ATPase(PHA)的挖掘、验证及序列分析 |
| 3.1.1 PHA基因的挖掘与验证 |
| 3.1.2 PHA基因的序列分析 |
| 3.2 PHA基因在暗柳橙中组织特异性表达分析 |
| 3.3 两对柑橘品种果实发育过程中PHA基因的表达 |
| 3.4 ABA注射对果实中柠檬酸含量和PHA基因表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 柑橘P型质子泵基因挖掘与鉴定分析 |
| 4.2 P型质子泵在有机酸积累中的作用探讨 |
| 4.3 脱落酸处理下P型质子泵基因的表达与有机酸积累的关系探讨 |
| 第四章 CsPH8 在红暗柳果实和柑橘叶片低积累柠檬酸中的作用研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 柑橘果实和叶片柠檬酸含量的测定 |
| 2.2.2 代谢物质测定 |
| 2.2.3 基因克隆和验证 |
| 2.2.4 qRT-PCR分析 |
| 2.2.5 酶活性测定 |
| 2.3 数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 红暗柳果实低积累柠檬酸原因分析 |
| 3.1.1 暗柳橙和红暗柳果实中不同代谢物差异分析 |
| 3.1.2 暗柳橙和红暗柳果实中柠檬酸合成相关基因的表达和酶活性分析 |
| 3.1.3 暗柳橙和红暗柳果实中柠檬酸运输相关基因的表达和酶活性分析 |
| 3.1.4 暗柳橙和红暗柳果实中柠檬酸分解相关基因的表达和酶活性分析 |
| 3.2 柑橘果实和叶片柠檬酸的含量及代谢相关基因的表达分析 |
| 3.2.1 不同柑橘品种果实和叶片中柠檬酸含量测定 |
| 3.2.2 不同柑橘品种果实和叶片中柠檬酸合成相关基因的表达分析 |
| 3.2.3 不同柑橘品种果实和叶片中柠檬酸分解相关基因的表达分析 |
| 3.2.4 不同柑橘品种果实和叶片中柠檬酸运输相关基因的表达分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 CsPH8 在红暗柳汁胞低积累柠檬酸性状形成中的重要性 |
| 4.2 CsPH8 在柑橘叶片低积累柠檬酸性状形成中的重要性 |
| 第五章 柑橘有机酸差异积累关键基因CsPH8 的功能验证 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 可滴定酸含量的测定 |
| 2.2.2 qRT-PCR分析 |
| 2.2.3 载体构建 |
| 2.2.4 农杆菌转化 |
| 2.2.5 柑橘叶片的瞬时转化 |
| 2.2.6 番茄的遗传转化及半定量 |
| 2.2.7 柑橘汁胞的瞬时转化 |
| 2.2.8 烟草瞬时表达 |
| 2.2.9 草莓的瞬时转化 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 不同柑橘品种中柠檬酸含量和CsPH8 表达分析 |
| 3.1.1 六个柑橘品种整个发育时期柠檬酸含量变化和CsPH8 基因的表达分析 |
| 3.1.2 多个柑橘品种同一时期可滴定酸含量与CsPH8 基因的表达分析 |
| 3.2 CsPH8 基因的亚细胞定位 |
| 3.3 CsPH8 基因调节柑橘叶片中柠檬酸的积累 |
| 3.4 超表达CsPH8 基因促进番茄叶片中有机酸的积累 |
| 3.5 CsPH8 基因调节柑橘汁胞中柠檬酸的积累 |
| 3.6 瞬时超表达CsPH8 基因促进草莓果实中柠檬酸的积累 |
| 3.7 异源稳定超表达CsPH8 基因促进番茄果实中有机酸的积累 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 Ⅰ试验相关图表 |
| 附录 Ⅱ课题资助项目 |
| 附录 Ⅲ作者简介 |
| 附录 Ⅳ论文发表情况 |
| 致谢 |
（7）一株高效产絮菌的基因组测序及胞外多糖合成组学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 微生物絮凝剂概述 |
| 1.1.1 微生物絮凝剂的种类 |
| 1.1.2 絮凝剂产生菌 |
| 1.1.3 絮凝机理 |
| 1.1.4 影响絮凝剂产生的因素 |
| 1.1.5 影响絮凝效率的因素 |
| 1.1.6 微生物絮凝剂的研究应用现状 |
| 1.2 细菌胞外多糖概述 |
| 1.2.1 细菌胞外多糖的分类 |
| 1.2.2 细菌胞外多糖的结构 |
| 1.2.3 细菌胞外多糖的生理功能 |
| 1.2.4 细菌胞外多糖的应用 |
| 1.2.5 细菌胞外多糖的合成 |
| 1.3 新兴组学研究进展 |
| 1.3.1 全基因组测序 |
| 1.3.2 基因组学 |
| 1.3.3 转录组学 |
| 1.3.4 蛋白质组学 |
| 1.3.5 代谢组学 |
| 1.4 研究目的和意义 |
| 1.5 本研究主要内容 |
| 1.6 创新点 |
| 第2章 试验材料与方法 |
| 2.1 实验菌株及培养条件 |
| 2.2 主要试剂及实验仪器 |
| 2.2.1 主要化学试剂 |
| 2.2.2 主要生化试剂 |
| 2.2.3 引物及测序分析 |
| 2.2.4 试剂盒 |
| 2.2.5 主要仪器设备 |
| 2.3 菌株产絮凝剂的培养条件优化 |
| 2.3.1 培养条件优化实验 |
| 2.3.2 絮凝率测定方法 |
| 2.4 产絮菌A9生物学特性分析方法 |
| 2.4.1 菌株形态及生理生化分析 |
| 2.4.2 菌株细胞化学组分分析 |
| 2.4.3 16S rRNA基因序列分析 |
| 2.4.4 发酵产物的分离鉴定 |
| 2.5 基因组测序方法 |
| 2.5.1 培养方法 |
| 2.5.2 文库构建 |
| 2.5.3 桥式PCR |
| 2.5.4 Illumina测序 |
| 2.5.5 生物信息分析 |
| 2.5.6 质量剪切步骤 |
| 2.6 转录组测序方法 |
| 2.6.1 培养方法 |
| 2.6.2 总RNA提取步骤 |
| 2.6.3 RNA纯度及浓度检测 |
| 2.6.4 实验步骤 |
| 2.6.5 信息分析流程 |
| 2.7 差异表达蛋白分析方法 |
| 2.7.1 菌株培养方法 |
| 2.7.2 蛋白质的提取 |
| 2.7.3 蛋白质的双向电泳 |
| 2.7.4 双向电泳胶图分析和质谱鉴定 |
| 2.8 核酸纯化及克隆 |
| 2.8.1 基因组DNA提取 |
| 2.8.2 PCR产物纯化 |
| 2.8.3 小量质粒提取 |
| 2.8.4 DNA酶切 |
| 2.8.5 载体与目的片段连接 |
| 2.8.6 大肠杆菌热激转化 |
| 第3章 产絮菌A9的生物学特性及基因组测序 |
| 3.1 产絮菌A9生物学特性 |
| 3.1.1 形态学特征 |
| 3.1.2 生理生化特征 |
| 3.1.3 培养条件优化 |
| 3.1.4 细胞化学组分 |
| 3.1.5 (G+C)含量和DNA同源性分析 |
| 3.1.6 16S rRNA基因序列分析 |
| 3.2 絮凝成分及机理分析 |
| 3.2.1 絮凝成分分析 |
| 3.2.2 絮凝机理分析 |
| 3.3 产絮菌A9基因组测序 |
| 3.3.1 基因组测序数据统计 |
| 3.3.2 基因组拼接 |
| 3.3.3 基因注释 |
| 3.4 产絮菌A9胞外多糖合成途径研究 |
| 3.4.1 产絮菌A9胞外多糖合成过程 |
| 3.4.2 胞外多糖合成相关基因的克隆和异源表达 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 产絮菌产絮过程表达差异及生产调控研究 |
| 4.1 不同培养条件下产絮菌A9转录组表达差异分析 |
| 4.1.1 转录组测序数据统计 |
| 4.1.2 与参考基因组比对 |
| 4.1.3 表达量统计及表达差异分析 |
| 4.1.4 基因注释 |
| 4.1.5 产絮菌A9在不同培养条件下差异基因分析 |
| 4.2 不同培养条件下产絮菌A9差异表达蛋白分析 |
| 4.2.1 碳源对菌株产生絮凝剂的影响 |
| 4.2.2 胶图分析结果 |
| 4.2.3 质谱鉴定结果 |
| 4.2.4 差异蛋白质功能分析 |
| 4.3 微生物絮凝剂生产调控研究 |
| 4.3.1 菌种复壮调控方法 |
| 4.3.2 底物水平调控方法 |
| 4.3.3 发酵工艺参数调控方法 |
| 4.3.4 产絮菌胞外多糖合成的代谢工程 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 结论 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论着、获奖情况 |
| 附录 英文缩略词 |
（8）百合鳞茎离体发育及淀粉合成相关酶研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词中英文对照表 |
| 第一章 前言 |
| 1 研究背景 |
| 1.1 百合鳞茎发育研究进展 |
| 1.1.1 组培鳞茎膨大发育研究 |
| 1.1.2 小鳞茎生长发育生理 |
| 1.2 淀粉合成相关酶及基因研究进展 |
| 1.2.1 腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶 |
| 1.2.2 颗粒结合淀粉合酶 |
| 1.2.3 可溶性淀粉合酶 |
| 2 研究目的与意义 |
| 3 主要研究内容 |
| 3.1 开发食用百合组培鳞茎生产技术路线 |
| 3.2 百合鳞茎不同发育阶段淀粉与淀粉合成相关酶的变化特征 |
| 3.3 克隆淀粉合成相关酶基因AGP、SSS、GBSS |
| 3.4 百合鳞茎不同发育阶段淀粉合成相关酶基因表达模式 |
| 3.5 百合AGP基因RNAi载体构建 |
| 3.6 抗体制备 |
| 3.7 农杆菌介导AGP基因RNAi载体遗传转化百合 |
| 第二章 百合组培鳞茎膨大发育技术 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 初代培养 |
| 2.2.2 丛生芽诱导培养 |
| 2.2.3 诱导小鳞茎形成培养 |
| 2.2.4 鳞茎膨大发育培养 |
| 2.2.5 交叉培养阶段实验 |
| 2.2.6 百合鳞茎不同发育阶段电镜观察 |
| 2.2.7 百合鳞茎不同发育阶段淀粉含量测定 |
| 2.2.8 百合鳞茎不同发育阶段淀粉合成相关酶活性测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 初代培养情况 |
| 3.2 丛生芽繁殖培养 |
| 3.3 诱导小鳞茎形成 |
| 3.4 鳞茎膨大生长 |
| 3.5 不同培养途径对鳞茎形成发育的影响 |
| 3.6 鳞茎发育SEM观察 |
| 3.7 不同培养阶段淀粉含量、可溶性糖变化情况 |
| 3.8 百合鳞茎直径、质量、鳞片数与主茎杆形成的相关性 |
| 3.9 百合组培鳞茎发育生长阶段AGPase酶活性变化 |
| 3.10 百合组培鳞茎发育生长阶段GBSS酶活性变化 |
| 3.11 百合组培鳞茎发育生长阶段SSS酶活性变化 |
| 4 讨论与小结 |
| 4.1 百合鳞茎形成发育培养途径 |
| 4.2 植物激素、蔗糖对鳞茎形成发育的影响 |
| 4.3 鳞茎直径、质量、鳞片数与主茎杆形成的相关性 |
| 4.4 鳞茎发育过程中淀粉含量的变化 |
| 4.5 淀粉合成相关酶的活性在鳞茎发育过程中的变化 |
| 4.6 小结 |
| 第三章 百合淀粉合成相关酶基因克隆与表达分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 植物材料 |
| 2.2 试剂仪器 |
| 2.3 简并引物设计与合成 |
| 2.4 提取RNA |
| 2.5 cDNA的制备 |
| 2.6 目的基因扩增和胶回收 |
| 2.7 载体连接 |
| 2.8 转化感受态大肠杆菌 |
| 2.9 菌液PCR鉴定 |
| 2.10 测序与序列分析 |
| 2.11 淀粉含量测定 |
| 2.12 qRT-PCR检测百合鳞茎不同发育阶段AGP、GBSS和SSS基因表达情况 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 RNA抽提结果 |
| 3.2 PCR结果 |
| 3.3 菌液PCR结果 |
| 3.4 测序结果分析 |
| 3.4.1 AGP序列分析 |
| 3.4.2 AGPase氨基酸序列分析 |
| 3.4.3 GBSS序列分析 |
| 3.4.4 GBSS氨基酸序列分析 |
| 3.4.5 SSS序列分析 |
| 3.4.6 SSS氨基酸序列分析 |
| 3.5 百合淀粉合成关键酶AGPase、SSS和GBSS基因序列分析 |
| 3.6 百合鳞茎不同发育阶段淀粉含量 |
| 3.7 淀粉合成酶关键基因在百合鳞茎发育不同阶段的表达 |
| 4 讨论与小结 |
| 第四章 百合AGPase蛋白的原核表达及多克隆抗体制备 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 植物材料 |
| 2.2 菌株和质粒 |
| 2.3 试剂 |
| 2.4 pET28a-AGPase原核表达载体的构建 |
| 2.5 pET28a-AGPase蛋白的诱导表达及SDS-PAGE检测 |
| 2.6 pET28a-AGPase表达蛋白的纯化 |
| 2.7 动物免疫血清的制备 |
| 2.8 免疫血清的鉴定及测定免疫血清的滴度 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 AGP基因保守片段的PCR与原核表达载体pET28a-AGPase的鉴定 |
| 3.2 SDS-PAGE鉴定诱导蛋白表达情况 |
| 3.3 表达蛋白的纯化与Westernblot检测 |
| 3.4 抗血清滴度测定 |
| 4 讨论与结论 |
| 第五章 百合AGP基因RNAi载体构建及遗传转化研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株与质粒载体 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 目的序列的扩增 |
| 2.2.2 构建入门克隆 |
| 2.2.3 构建干扰表达载体 |
| 2.2.4 农杆菌GV3101(pMP90RK)感受态细胞的制备 |
| 2.2.5 干扰载体pJawohl8-RNAi-AGP转化农杆菌 |
| 2.2.6 遗传转化与筛选 |
| 2.2.7 转化植株的荧光定量PCR检测 |
| 2.2.8 Western Blot检测 |
| 2.2.9 统计学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 目的干扰序列克隆 |
| 3.2 AGP基因干扰片段装入到入门载体后菌落PCR结果 |
| 3.3 入门载体pDONR221-AGP与目标载体pJawohl8-RNAi进行LR反应检测 |
| 3.4 干扰表达载体pJawohl8-RNAi-AGP酶切结果 |
| 3.5 构建的干扰表达载体pJawohl8-RNAi-AGP中干扰片段测序结果 |
| 3.6 干扰质粒转化农杆菌PCR鉴定 |
| 3.7 农杆菌介导干扰载体遗传转化百合愈伤组织 |
| 3.8 荧光定量PCR检测AGP基因转录后抑制 |
| 3.9 Western Blot检测 |
| 4 讨论与结论 |
| 第六章 结论与创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（9）矮沙冬青液泡膜氢离子焦磷酸酶基因（AnVP1）的异源表达提高玉米耐旱性（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 干旱对玉米生产的影响 |
| 1.2 转基因耐旱玉米 |
| 1.3 液泡膜氢离子焦磷酸酶基因 |
| 1.3.1 氢离子焦磷酸酶 |
| 1.3.2 氢离子焦磷酸酶的功能 |
| 1.3.3 液泡膜氢离子焦磷基因 |
| 1.3.4 V-H~+-PPase基因在植物中的遗传转化 |
| 1.4 矮沙冬青液泡膜氢离子焦磷酸酶基因 |
| 1.4.1 矮沙冬青 |
| 1.4.2 矮沙冬青的抗逆性 |
| 1.4.3 矮沙冬青抗逆相关基因 |
| 1.4.4 矮沙冬青液泡膜氢离子焦磷酸酶基因 |
| 1.5 外源基因整合位点的精确定位 |
| 1.5.1 TAIL-PCR |
| 1.5.2 高效TAIL-PCR |
| 1.6 T-DNA的整合机理及特征 |
| 1.6.1 T-DNA |
| 1.6.2 T-DNA的整合特征 |
| 1.7 外源基因的安全性评价 |
| 1.8 本研究的目的意义 |
| 1.9 技术路线 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 AnVP1基因安全性的生物信息学预测 |
| 2.1.1 与毒蛋白的同源性比对 |
| 2.1.2 与过敏原的同源性比对 |
| 2.1.3 与抗营养因子的同源性比对 |
| 2.2 转基因株系的筛选繁育 |
| 2.2.1 抗除草剂筛选 |
| 2.2.2 基因组DNA提取 |
| 2.2.3 特异PCR检测 |
| 2.3 T3代株系T-DNA整合位点分析 |
| 2.3.1 hiTAIL-PCR扩增 |
| 2.3.2 连接pMD19-T载体与转化 |
| 2.3.3 T-DNA整合位点侧翼序列分析 |
| 2.4 T3代株系的RT-PCR检测 |
| 2.4.1 总RNA提取 |
| 2.4.2 基因组DNA去除和反转录合成cDNA |
| 2.4.3 RT-PCR检测 |
| 2.5 转基因株系耐旱性鉴定 |
| 2.5.1 T_2代株系的田间鉴定 |
| 2.5.2 T_3代株系的盆栽鉴定 |
| 2.6 转基因株系的RNA测序 |
| 2.6.1 RNA测序 |
| 2.6.2 基因表达差异分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 AnVP1基因的预测安全性 |
| 3.1.1 与已知毒蛋白没有同源性 |
| 3.1.2 与已知过敏原没有同源性 |
| 3.1.3 与已知抗营养因子没有同源性 |
| 3.2 转基因株系世代繁育及阳性检测 |
| 3.2.1 T1代株系筛选繁育 |
| 3.2.2 T2代株系繁育与检测 |
| 3.3 转基因株系T-DNA整合位点 |
| 3.3.1 hiTAIL-PCR扩增的特异片段 |
| 3.3.2 T-DNA整合位点 |
| 3.3.3 T-DNA侧翼序列与表达载体的同源性 |
| 3.4 AnVP1基因的异源表达 |
| 3.5 转基因株系的耐旱性 |
| 3.5.1 T_2代株系的田间耐旱性 |
| 3.5.2 T_3代株系盆栽耐旱性 |
| 3.6 转基因株系内源基因的差异表达 |
| 3.6.1 RNA样品质量 |
| 3.6.2 RNA测序质量 |
| 3.6.3 基因差异表达分析 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）矮沙冬青四个抗逆基因的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 沙冬青 |
| 1.1.1 沙冬青的分布 |
| 1.1.2 矮沙冬青的抗逆性 |
| 1.1.3 沙冬青抗逆基因克隆 |
| 1.2 甜菜碱醛脱氢酶基因研究进展 |
| 1.2.1 甜菜碱 |
| 1.2.2 甜菜碱合成途径 |
| 1.2.3 甜菜碱合成相关基因 |
| 1.3 钼辅助因子硫酸化酶基因研究进展 |
| 1.3.1 脱落酸合成途径 |
| 1.3.2 钼辅助因子硫酸化酶基因克隆 |
| 1.3.3 钼辅助因子硫酸化酶基因在基因工程中的利用 |
| 1.4 磷脂酶D基因研究进展 |
| 1.4.1 磷脂酶 |
| 1.4.2 PLD基因 |
| 1.4.3 PLDα基因对逆境胁迫的响应 |
| 1.5 氢离子焦磷酸酶基因研究进展 |
| 1.5.1 氢离子焦磷酸酶 |
| 1.5.2 氢离子焦磷酸酶的功能 |
| 1.5.3 氢离子焦磷酸酶基因的转基因研究 |
| 1.6 目的意义及技术路线 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 生物信息学分析 |
| 2.2 四个抗逆基因的内源表达检测 |
| 2.2.1 材料处理 |
| 2.2.2 RNA提取及cDNA制备 |
| 2.2.3 qRT-PCR内参基因扩增 |
| 2.2.4 qRT-PCR分析 |
| 2.3 AnMCSU和AnPLDα蛋白的亚细胞定位 |
| 2.3.1 瞬时表达载体构建 |
| 2.3.2 农杆菌介导的渗透法注射烟草 |
| 2.4 AnBADH基因在大肠杆菌中的异源表达 |
| 2.4.1 原核表达载体构建 |
| 2.4.2 目的蛋白诱导表达及SDS-PAGE分析 |
| 2.4.3 重组菌株的耐盐性分析 |
| 2.4.4 重组菌株的耐热性分析 |
| 2.5 AnVP1基因在酵母中的异源表达 |
| 2.5.1 酵母表达载体构建 |
| 2.5.2 酵母感受态制备 |
| 2.5.3 酵母感受态细胞转化 |
| 2.5.4 重组菌株的耐盐性分析 |
| 2.5.5 重组菌株的耐旱性分析 |
| 2.6 四个抗逆基因在拟南芥中的异源表达 |
| 2.6.1 植物表达载体构建 |
| 2.6.2 农杆菌介导法浸染拟南芥 |
| 2.6.3 阳性株系的筛选 |
| 2.6.4 转基因株系的PCR检测 |
| 2.6.5 转基因株系的RT-PCR检测 |
| 2.6.6 转基因株系的抗逆性鉴定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 AnBADH基因的功能 |
| 3.1.1 AnBADH基因及其编码蛋白 |
| 3.1.2 非生物胁迫下的内源表达 |
| 3.1.3 异源表达增强大肠杆菌抗逆性 |
| 3.1.4 异源表达增强拟南芥抗逆性 |
| 3.2 AnMCSU基因的功能 |
| 3.2.1 AnMCSU基因及其编码蛋白 |
| 3.2.2 非生物胁迫下的内源表达 |
| 3.2.3 亚细胞定位 |
| 3.2.4 异源表达增强拟南芥抗逆性 |
| 3.3 AnPLDα基因的功能 |
| 3.3.1 AnPLDα基因及其编码蛋白 |
| 3.3.2 非生物胁迫下的内源表达 |
| 3.3.3 亚细胞定位 |
| 3.3.4 异源表达增强拟南芥抗逆性 |
| 3.4 AnVP1基因的功能 |
| 3.4.1 AnVP1基因及其编码蛋白 |
| 3.4.2 异源表达增强酵母抗逆性 |
| 3.4.3 非生物胁迫下的内源表达 |
| 3.4.4 异源表达增强拟南芥抗逆性 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 附图 |
| 作者简历 |
四、大肠杆菌焦磷酸酶基因的克隆和序列分析（论文参考文献）
- [1]桑树（Morus alba）三个干旱诱导基因的表达规律及MaCDSP32基因的功能分析[D]. 孙红梅. 西北农林科技大学, 2020
- [2]柿原花青素前体转运相关基因DkAHA1的克隆和功能研究[D]. 王守栋. 华中农业大学, 2020
- [3]酸性磷酸酶OsACP1在水稻缺磷适应性中的功能研究[D]. 李靖怡. 华中农业大学, 2020(02)
- [4]苹果种质资源有机酸含量评价及酸含量调控候选基因MtPEPP功能分析[D]. 高萌. 西北农林科技大学, 2020(02)
- [5]马铃薯StGRIK1的功能研究及低温诱导StBAM1与StBAM9表达的机制解析[D]. 刘腾飞. 华中农业大学, 2019(01)
- [6]柑橘柠檬酸积累相关的质子泵基因挖掘与关键基因的功能分析[D]. 石彩云. 华中农业大学, 2019(01)
- [7]一株高效产絮菌的基因组测序及胞外多糖合成组学研究[D]. 刘金亮. 东北大学, 2018
- [8]百合鳞茎离体发育及淀粉合成相关酶研究[D]. 张进忠. 华南农业大学, 2018(08)
- [9]矮沙冬青液泡膜氢离子焦磷酸酶基因（AnVP1）的异源表达提高玉米耐旱性[D]. 张晓芳. 四川农业大学, 2018(02)
- [10]矮沙冬青四个抗逆基因的功能研究[D]. 于好强. 四川农业大学, 2017(03)