一、DnaJ类分子伴侣PBP的基因克隆及亚细胞定位研究（论文文献综述）
李慧[1]（2021）在《热激蛋白在松墨天牛响应高温胁迫中的功能研究》文中提出昆虫作为一种变温动物,高温胁迫对其生长发育及繁殖产生不利影响。此外,全球气候变暖的加剧带来平均气温的升高和高温事件的频发,给昆虫带来了更大的挑战。在长期的进化过程中,昆虫逐步形成了一套基于行为、生理生化及遗传上的应对高温的响应机制。松墨天牛（Monochamus alternatus）是我国南方松林的一种重要蛀干害虫,也是我国重大检疫性森林病害—松材线虫病的主要媒介昆虫,对我国森林资源从经济上和生态上都造成了巨大的损失。松墨天牛主要分布于我国东南部地区,成虫在野外常常面临37.5℃及以上的高温天气。松墨天牛的耐热性及耐热机制直接影响其在气候变暖条件下的种群动态和地理分布,进而间接影响松材线虫病的扩散蔓延。热激蛋白（Heat Shock Protein,HSP）是一类分子伴侣,可在生物体遭遇热胁迫时保护底物蛋白热变性聚集和非正常降解,是昆虫应对高温胁迫的生理生化响应的重要组成部分。为探究松墨天牛在高温胁迫下的响应机制,本论文在明确松墨天牛成虫对高温胁迫的耐受性基础上,以热激蛋白为研究对象,利用基因克隆、荧光定量PCR、蛋白免疫印记和免疫荧光染色等技术,系统探究高温胁迫下HSP在雌雄成虫的虫体、组织和生殖细胞中的响应模式,异源表达后对其体外分子伴侣活性进行测定,最后通过RNA干扰实验验证HSP基因在松墨天牛热胁迫响应中的功能。主要研究结果和结论如下:1.高温胁迫处理条件下测定成虫的存活、取食、繁殖和子代适合度指标,对其耐热性进行评估。设置连续高温胁迫处理,测定松墨天牛雌雄成虫在37.5、40、42.5和45℃条件下的致死中时间。设置每天3 h的周期重复性热胁迫处理,发现37.5℃周期重复性热胁迫对成虫的存活情况、取食量、产卵量与子代适合度等参数未产生显着影响。当胁迫温度提高至40和42.5℃时,雌雄成虫寿命缩短、取食量和产卵量降低及子代适合度下降。但仍有部分个体可继续延续种群,并且成虫出现了热适应性及产卵策略的改变。研究结果可知,松墨天牛成虫的耐热性较强,夏季常见的37.5℃高温天气不会对其种群动态产生影响,随着全球气候变暖加剧,40℃及以上的高温频率增加,仍有部分个体可成功存活及繁殖。2.利用RACE和RT-PCR扩增技术,克隆获得了13条MaltHSP20s基因、2条MaltHSP40s基因和6条MaltHSP70s基因。通过生物信息学预测HSPs的结构特点,发现这些基因的开放阅读框长度、蛋白相对分子质量、结构域、序列标签、二级结构和三维结构均符合所属家族的特征。亚细胞定位预测显示松墨天牛热激蛋白基因广泛分布于胞外、细胞核、细胞质、线粒体与内质网等部位。对来自不同类群昆虫的HSP20、HSP40和HSP70基因分别构建系统发育树,显示松墨天牛的HSP基因均聚类在鞘翅目分支上,且与光肩星天牛（Anoplophora glabripennis）的HSP基因亲缘关系最近,表明松墨天牛热激蛋白基因序列的结构较为保守。3.通过荧光定量PCR检测了21条HSP基因在雌雄成虫在短时高温胁迫下的转录响应,结果表明:HSP基因的相对表达量在35℃的处理下开始上调,随胁迫温度的升高在42.5℃条件下达到峰值;热胁迫下,MaltHSP20-5、MaltHSP20-11、MaltHSP70-2这3条基因在雌雄成虫中的上调倍数最高;辅助分子伴侣MaltHSP40s和保守型Malt HSC70s的上调倍数较低;大多数HSP基因在卵巢和精巢中相对表达量最高,其次是触角、足和翅等组织,热激后HSP基因在头部上调倍数很高。筛选MaltHSP20-5、MaltHSP20-11及MaltHSP70-2为松墨天牛成虫热胁迫响应的关键基因,推测其优先保护生殖相关蛋白质。4.通过体外原核表达纯化成功获得了高浓度的MaltHSP20-5、MaltHSP20-11及MaltHSP70-2蛋白。体外分子伴侣活性验证实验表明MaltHSP20-5和MaltHSP20-11可有效保护苹果酸脱氢酶、柠檬酸合酶在43℃下的热聚集,且与底物摩尔浓度比例为1:1时保护效果较好,MaltHSP20-5的分子伴侣活性显着优于MaltHSP20-11。MaltHSP70-2在25至40℃温度区间内具备较高且稳定的ATP酶活力,过表达MaltHSP70-2的大肠杆菌细胞耐热性显着提高。说明松墨天牛HSP具备较高的分子伴侣活性,可在热胁迫下对松墨天牛体内蛋白质进行保护并提高细胞耐热性,从而帮助机体抵御热胁迫。5.通过蛋白免疫印记实验对松墨天牛热激蛋白在翻译水平上的表达特性进行检测。发现热胁迫后MaltHSP20-5、MaltHSP20-11及MaltHSP70-2蛋白在雌雄成虫及卵巢和精巢叶中大量上调。利用免疫荧光染色对热激蛋白在松墨天牛精巢叶中的分布进行检测,表明MaltHSP20-5和MaltHSP70-2均主要分布于初级精母细胞的细胞质中,并且热胁迫后平均荧光强度显着提高,而在精细胞中分布较少且无显着差异;热激后MaltHSP20-5蛋白在初级精母细胞的细胞核中有分布。从翻译水平上验证了HSP参与松墨天牛的热胁迫响应及其对生殖细胞的保护。6.利用RNA干扰技术探究降低MaltHSP20-5和MaltHSP70-2基因在松墨天牛体内的表达量对成虫耐热性及其他HSP基因表达量的影响,发现注射8μg MaltHSP20-5和MaltHSP70-2基因片段的双链RNA后,3～5d内检测到靶标基因的下调。MaltHSP20-5和MaltHSP70-2基因下调使松墨天牛雌雄成虫在42.5℃下的致死中时间缩短及存活率降低。同时,MaltHSP20-5基因下调后,MaltHSP40-1和MaltHSP70-2的表达量下调;MaltHSP70-2下调后,MaltHSP20-5和MaltHSP40-1的表达量上调。说明热激蛋白各家族之间存在互作关系,进一步验证了热激蛋白基因参与松墨天牛的热胁迫响应。
陈璇[2]（2021）在《褐飞虱热激蛋白不同家族基因及其功能研究》文中认为昆虫属于小型变温动物,温度胁迫能影响昆虫的生存、种群动态和分布。热激蛋白（Heat shock protein,HSP）是受温度胁迫后响应最为显着的一类蛋白。除在应对温度胁迫中至关重要,HSP对维持细胞和蛋白稳态也不可或缺,保障了昆虫在正常环境条件下的基本生长发育。目前,HSP在昆虫的研究主要集中在HSP70和HSP90家族,其它家族涉猎有限,缺乏系统、完整的研究。此外,昆虫中的研究以基因鉴定与温度诱导表达分析为主,HSP的生物学功能及互作关系亟待挖掘。褐飞虱（Nilaparvata lugens（St（?）l））是亚洲“头号”水稻害虫,其发生和生长发育都易受到温度的影响,因此研究褐飞虱热激蛋白具有重要的理论及应用价值。本论文结合基因组、转录组和RNAi等技术,对褐飞虱热激蛋白HSP进行了系统鉴定及深入研究,揭示了HSP与温度胁迫的相关性,以及HSP的生物学功能。所取得的主要结论如下:1.揭示了褐飞虱热激蛋白HSP基因的种类和数量。利用生物信息学分析,本研究共在褐飞虱中鉴定得到62个HSP家族基因,分属于6个家族:s HSP（7个）、DNAJ（31个）、Chaperonin（10个,其中CCT共8个,HSP10、HSP60各1个）、HSP70（9个）、HSP90（3个）及HSP100（2个）。其中HSP100是首次在昆虫中得到报道。通过序列及系统发育分析,发现褐飞虱DNAJ家族呈现出较高的多样性,其它HSP在进化上相对保守。2.分析了褐飞虱HSP基因的时空表达模式及温度诱导特点。q RT-PCR定量结果显示,绝大多数HSP基因在各发育阶段均广泛表达。基于组织表达分析,除少数基因的表达模式呈现高度多样性外,大部分HSP在生殖系统（卵巢和精巢）中具有较高的表达水平,表明HSP可能在生殖中发挥重要功能。温度胁迫诱导表达分析显示,共有20个HSP基因（6个sHSP,3个DNAJ,9个HSP70和2个HSP90,占总数的32.3%）能在不同阶段显着受到高温诱导而上调表达,其中以卵期和成虫期最为明显。然而,本研究未发现明显受低温胁迫影响的HSP。3.揭示了30个HSP在褐飞虱正常生长发育和繁殖中的重要功能。选取褐飞虱若虫及初羽化雌虫,分别对62个HSP基因进行RNA干扰实验,共鉴定出30个对该飞虱正常生命活动不可或缺的HSP基因。其中,Nls HSP21.1在卵的发育中起重要作用;10个Nl DNAJ和7个Nl HSP70分别在若虫生长发育、卵巢发育和雌性生殖中发挥重要功能;8个Nl CCT发挥的功能相似,不仅可影响若虫的生长发育,而且对雌雄虫的生殖都至关重要;Nl Hsp10/Nl Hsp60也均可对若虫发育和雌虫生殖产生影响;HSP90家族中有2个基因对若虫正常发育、雌虫生殖力及维系正常表皮结构不可或缺。4.提供了HSP家族内或家族间相互关联的线索。以RNA干扰介导的功能缺失产生相应表型作为切入点,发现Nl HSC70-3,Nl HSC70-4和Nl HSC70-5沉默后表型极其相似;干扰Nl DNAJA3、Nl DNAJC19以及Nl Hsp10/Nl Hsp60均出现了虫体焦化变黑的类似表型;沉默8个Nl CCT的表型一致。实验结果为这些家族成员之间的潜在互作或调控关系提供了线索。5.明确了Nls HSP20.7和Nl HSP68在胚胎发育阶段应对高温胁迫中不可或缺。正常温度下干扰这2个基因,并无明显影响;干扰后进行37°C高温处理,导致胚胎发育异常,无法成功孵化,表明这2个基因在胚胎发育阶段应对高温胁迫时发挥了极其重要的作用。
韩聪[3]（2020）在《宿主细胞蛋白STAT5、NPM1和DNAJB6在PCV2复制过程中作用及机制研究》文中进行了进一步梳理猪圆环病毒2型（porcine circovirus type,PCV2）引起猪圆环病毒相关疾病（porcine circovirus-associated diseases,PCVDs）,PCV2感染首先侵害机体的免疫系统,引起机体产生免疫抑制从而对多种病原易感,导致感染猪群病死率显着升高,生产性能明显下降,给养猪业造成巨大的经济损失。PCV2基因组包含11个重叠的开放阅读框（ORFs）,其中最重要的是ORF2,ORF2编码的衣壳蛋白Cap是PCV2的唯一结构蛋白,在病毒复制过程中,Cap参与了病毒基因组的入核以及成熟病毒粒子的组装。信号传导及转录激活蛋白5（signal transducer and activator of transcription5,STAT5）是一种多功能的转录因子,具有与DNA结合的特性。核仁磷酸蛋白1（nucleophosmin 1,NPM1）是一种多功能的宿主蛋白,不仅参与多种细胞生理活动,还在多种病毒的复制过程中发挥重要作用。热休克蛋白40 B6（heat shock protein40 B6,DNAJB6）属于热休克蛋白40（Hsp40）家族成员之一,参与细胞中蛋白的折叠、转运、蛋白复合物的组装、错误折叠蛋白的降解以及病毒复制的调控。但是,有关STAT5、NPM1及DNAJB6在PCV2复制过程中作用及机制迄今未见报道。本论文首先通过免疫共沉淀筛选并鉴定了与Cap互作的宿主细胞蛋白STAT5、NPM1及DNAJB6,然后分别研究STAT5、NPM1及DNAJB6在PCV2复制过程中作用及机制,研究结果将为进一步探索PCV2致病机制奠定基础。研究取得以下结果。1.以Cap抗体进行免疫共沉淀,筛选到Cap的关键宿主细胞互作蛋白STAT5、NPM1及DNAJB6。分别设计针对stat5、npm1及dnajb6的引物进行PCR,扩增出猪源stat5、npm1及dnajb6基因,克隆入真核表达载体p CI-neo,酶切和测序鉴定结果显示,p CI-His-STAT5、p CI-Flag-NPM1及p CI-Flag-DNAJB6载体构建成功。与人源及鼠源的序列比较结果显示,猪源STAT5氨基酸序列与鼠源STAT5的同源性最高（96.3%）。猪源NPM1氨基酸序列与人源NPM1的同源性最高（98.2%）。猪源DNAJB6氨基酸序列与人源DNAJB6的同源性最高（90.9%）。1 MOI的PCV2感染PK-15,间接免疫荧光染色后发现,Cap与STAT5和NPM1在细胞核中发生共定位,与DNAJB6在细胞核和细胞质中均发生共定位。PCV2感染后28 d扑杀猪,在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和淋巴结中均能检测到STAT5、NPM1和DNAJB6,与对照组相比,NPM1、STAT5的m RNA水平和蛋白水平在各种组织中均未见明显差异（p>0.05）,而DNAJB6在肺脏、肾脏及淋巴结中的m RNA水平和蛋白水平显着高于对照组（p<0.05）。2.将p EGFP-Cap和p CI-His-STAT5共转染至HEK293T后免疫共沉淀结果显示,Cap与STAT5存在互作。GST-pull down检测发现,Cap与STAT5不能直接结合。用stat5 si RNA处理PK-15后,测定PCV2感染细胞上清中的病毒DNA拷贝数。结果显示,干扰效率最高si RNA#1组的PCV2DNA拷贝数显着低于非特异性si RNA转染组的病毒拷贝数（p<0.05）。PCV2 DNA序列中包含有GAS样基序（5’TTCTCTGAA3’）,该基序是STAT5保守的结合位点,DNA pull down试验证实PCV2 DNA GAS样基序突变的感染性克隆（PCV2-MDS）不能与STAT5结合,而野生型PCV2 DNA能与STAT5结合。用等量的野生型PCV2和PCV2-MDS感染PK-15 12 h、24 h,FISH检测病毒DNA复制显示,与野生型PCV2感染的细胞相比,在PCV2-MDS感染24 h的细胞中靶向病毒基因组DNA复制链（负链）的探针（RFP）和靶向病毒基因组模板链（正链）的探针（CP）阳性细胞数量都显着降低（p<0.05）;荧光定量PCR检测显示,在感染后12 h及24 h,PCV2MDS感染细胞中病毒DNA拷贝数显着低于野生型PCV2感染细胞（p<0.05）。3.干扰npm1的PK-15再用PCV2感染24 h后发现,与对照组相比,转染靶向npm1特异性si RNA#1的细胞中,病毒DNA拷贝数显着下降（p<0.05）。利用CRISPR/Cas9技术构建npm1敲除的PK-15,与野生型细胞相比npm1敲除的PK-15细胞中病毒DNA拷贝数显着下降（p<0.05）。GST-pull down结果显示,STAT5能与NPM1直接互作,NPM1与PCV2 Cap直接互作。构建NPM1及其截短体原核表达载体和Cap截短体真核表达载体,GST-pull down确定NPM1与Cap的结合区域分别为NPM1的151-158 aa及Cap的136-153 aa。将Cap 147位精氨酸及148位组氨酸突变为丙氨酸的PCV2突变毒株（PCV2-Nm A）感染PK-15后发现,与野生型PCV2感染相比,PCV2-Nm A感染的细胞中病毒DNA拷贝数显着下降（p<0.05）。荧光原位杂交结果显示,与野生型PCV2感染相比,PCV2-Nm A细胞中RFP及CP阳性细胞数量均显着降低（p<0.05）。4.以1 MOI PCV2感染PK-15,与对照组相比,DNAJB6 m RNA水平在感染36 h后显着增加（p<0.05）,48 h进一步增加（p<0.01）,DNAJB6的蛋白水平与m RNA水平变化一致。分别用不同剂量PCV2感染PK-15 36 h发现,DNAJB6表达量随PCV2感染剂量的增加而增加。免疫共沉淀显示DNAJB6与Cap互作,GST-pull down明确互作区域为DNAJB6的1-99 aa和Cap的162-234 aa。用等量PCV2分别感染野生型PK-15、dnajb6敲除的PK-15(PKDNAJB6-/-)以及dnajb6未敲除的PK-15(PKDNAJB6+/+)48h发现,与野生型PK-15和PKDNAJB6+/+相比,PKDNAJB6-/-中Cap蛋白和病毒产生水平显着降低（p<0.05）。与野生型PK-15和PKDNAJB6+/+相比,PKDNAJB6-/-中由PCV2感染和Cap蛋白表达诱导的自噬小体数量显着降低（p<0.01）。用等量PCV2感染野生型PK-15、dnajb6过表达PK-15(PKDNAJB6)及转染空载体的PK-15（PKV）发现,与野生型PK-15和PKV相比,PKDNAJB6中Cap蛋白和病毒产生水平显着增加（p<0.05）,并且PKDNAJB6中由PCV2感染和Cap蛋白表达诱导的自噬小体数量显着升高（p<0.05）。构建DNAJB6与Cap互作位点缺失质粒p CI-CapΔ162-234和p CI-DNAJB6ΔJ。分别转染p CI-Cap、p CI-CapΔ162-234和p CI-neo于稳定表达GFP-LC3的PK-15 24 h发现,与转染p CI-Cap的细胞相比,转染p CI-CapΔ162-234的细胞中自噬小体数量显着降低（p<0.01）。在稳定表达GFP-LC3的PKp DNAJB6-/-中先分别转染p CI-DNAJB6、p CI-DNAJB6ΔJ及p CI-neo质粒,再感染等量的PCV2或转染等量的p CI-Cap质粒发现,与转染p CI-DNAJB6的细胞相比,p CI-DNAJB6ΔJ转染细胞中自噬小体数量显着降低（p<0.01）,且病毒DNA拷贝数显着下降（p<0.01）。用自噬抑制剂3-MA或DMSO处理PKp DNAJB6-/-后分别转染p CI-DNAJB6、p CI-DNAJB6ΔJ及p CI-neo后再用等量PCV2感染发现,与DMSO处理相比,3-MA处理转染p CI-DNAJB6的PKp DNAJB6-/-中病毒产生水平显着下降（p<0.01）。3-MA或DMSO处理PKp DNAJB6后用等量PCV2感染发现,与DMSO处理相比,3-MA处理的细胞中病毒产生水平显着降低（p<0.01）。用atg5 si RNA处理PKp DNAJB6后再用等量PCV2感染发现,抑制atg5的表达显着降低PCV2诱导的自噬小体的形成及病毒产生水平。本研究筛选到与PCV2 Cap互作的宿主细胞蛋白STAT5、NPM1和DNAJB6。发现STAT5与Cap间接互作,STAT5还与PCV2 DNA的GAS样基序结合,获得了复制能力低于野生型PCV2的GAS样基序突变毒株。发现NPM1能与Cap和STAT5直接互作,鉴定出NPM1与Cap互作区域,获得了PCV2 Cap 147、148位点突变的毒株,该毒株的复制能力显着低于野生型PCV2。PCV2感染上调DNAJB6的表达,且Cap 162-234 aa与DNAJB6 1-99 aa直接结合,突变DNAJB6/Cap互作位点、自噬抑制剂处理或抑制atg5基因表达都能显着降低PCV2感染诱导的自噬小体和病毒产生水平。本论文研究结果阐明了宿主细胞蛋白STAT5、NPM1和DNAJB6在PCV2复制过程中的作用及机制,为进一步揭示PCV2的致病机制提供理论依据。
李万[4]（2020）在《马铃薯磷转运蛋白家族的鉴定及PHO1亚家族提高转基因马铃薯耐热性的研究》文中研究表明植物的生长发育很容易受到环境因素的影响,其中高温（热）条件是一种很常见的,对植物影响很大的非生物胁迫因素。环境温度过高时,会引起植物的缺水枯萎甚至死亡,也会导致主要农作物减产等一系列不良影响。因此,在现代生物技术的支持下,通过基因工程手段定向改善提高植物的抗逆能力,以及减少高温对植物的生长、发育和产量等造成的损害具有重要的研究价值和实践意义。本文首先通过生物信息学方法分析筛选到了可能对马铃薯耐热性有正向效应的3个磷转运蛋白（PTs）基因,并在拟南芥、烟草和酵母中进行了功能鉴定。然后利用农杆菌介导的马铃薯转化方法,分析了这3个基因分别对马铃薯耐热性的影响。最后通过对一些相关生理指标的检测,以及利用酵母双杂技术和双分子荧光互补（BIFC）技术筛选互作蛋白,初步探索了这3个PTs提高马铃薯耐热能力的生理生化机制和分子机制。主要结果如下:（1）马铃薯蛋白数据库中总共有22个PTs被鉴定出来,并可以分为6个亚家族。通过对其基因/蛋白性质、基因复制事件等分析发现,PHO1亚家族的蛋白序列最长,分子量最大,GO注释显示该家族是必需的膜组分,是唯一的亲水蛋白家族,同时PGSC数据库得到的转录本数据以及定量实验都表明该家族的St PHO1.1,St PHO1.2和St PHO1.3（合称为St PHO1s）对马铃薯的耐热性有影响。（2）构建St PHO1s的过表达p BI121载体和p YES2酵母表达载体,使其分别导入拟南芥和注射烟草,以及转化酵母。接着通过耐热实验,发现随着St PHO1s和p BI121或p YES2重组质粒的转入,拟南芥、烟草和酵母的耐热能力都有了一定的提高,这说明St PHO1s对提高耐热能力确有重要作用。（3）将St PHO1s的过表达重组质粒导入四倍体野生型马铃薯“Desiree”中,成功得到了3个基因的转基因马铃薯植株:St PHO1.1-Desiree、St PHO1.2-Desiree和St PHO1.3-Desiree。耐热实验表明,在营养充足时,转基因植株（尤其是St PHO1.2-Desiree和St PHO1.3-Desiree）在高温胁迫下的表型要优于野生型,表明过表达St PHO1s对提高马铃薯耐热性也有重要作用。（4）相关指标的检测表明,转基因马铃薯的POD、CAT和APX活性要明显高于野生型,可溶性糖含量也明显多于野生型。St PHO1.1-Desiree和St PHO1.3-Desiree中的叶绿素a和b以及类胡萝卜素含量均高于野生型植株,但St PHO1.2-Desiree的三种叶绿体色素含量和野生型相比几乎没有变化,且3个基因的转基因植株的光合速率、脯氨酸含量和相对电导率（REC）都没有明显优势。同时对和抗坏血酸合成、光合作用、抗氧化作用、蔗糖和Pro合成相关的14个基因进行定量分析发现St PHO1.1-Desiree中,PSII、P5CS1、P5CR、DHAR1、Ca2和Glu的表达量,和P5CR、SPS和Glu在St PHO1.3-Desiree中的表达量都有一定的升高,而所有基因在St PHO1.2-Desiree中的都是下调表达,结合生理指标检测说明St PHO1s对马铃薯的影响是多方面。（5）对St PHO1s的亚细胞定位结果表明,三个基因都主要表达在细胞膜上,同时细胞核或细胞质中也有少量表达。使用酵母双杂技术从拟南芥文库质粒中筛选到了多个互作基因/蛋白,并在马铃薯中匹配到了相应基因/蛋白。通过共转酵母“一对一”鉴定,筛选得到了几个重要的互作基因/蛋白,包括和抗氧化有关的谷氧还蛋白（Glu,与St PHO1.2互作）和红素氧还蛋白（Rub,与St PHO1.3互作）,和光合作用有关的蛋白PSII（与St PHO1s都互作）,和钙离子转运有关的蛋白Ca2（与St PHO1s都互作）,以及热激蛋白40家族的成员DNAJ（Hsp,与St PHO1.1互作）。然后,本研究选择和St PHO1s都互作的Ca2和PSII,以及和St PHO1.1互作的Hsp做亚细胞定位和BIFC验证。结果显示,Hsp,Ca2和PSII定位在细胞膜和细胞质中,且St PHO1.1和Hsp（DNAJ）的相互作用,Ca2和PSII与3个基因的相互作用都发生在细胞膜和细胞质上。综上所述,马铃薯基因组中含有22个PTs,分为6个亚家族。其中,PHO1亚家族的St HO1.1,St PHO1.2和St PHO1.3对提高植物耐热性有重要作用。生理指标检测和互作蛋白筛选表明,这三个基因提高植物耐热性可能是通过提高抗氧化酶活性、可溶性糖含量以及与和光合、钙离子转运有关蛋白互作而实现的。另外,热激蛋白是一类对植物抵御高温胁迫十分重要的蛋白家族,而St PHO1.1和Hsp40家族成员DNAJ的互作亦说明了St PHO1.1也可能通过和DNAJ的相互作用,调控一系列其它生理生化反应,从而提高植物耐热能力。
惠亮亮[5]（2020）在《高效PTG/Cas9基因编辑系统在拟南芥中的应用及分子伴侣蛋白CPN60结构与功能的研究》文中研究说明CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat/CRISPR-associated nuclease 9,成簇有规律性间隔的短回文重复序列/CRISPR关联的核酸酶9）基因编辑技术已经被广泛地应用到各个生物中创建突变体。然而,CRISPR/Cas9系统在拟南芥中的基因编辑效率要远远低于其他种类的植物。为水稻开发的多重基因编辑系统PTG（polycistronic tRNA-gRNA,多顺反子tRNA-gRNA）/Cas9不仅能够提高编辑效率（效率可达到100%）,并且可以多靶点同时切割DNA,产生PCR可检测的大片段缺失。PTG/Cas9技术是将多个gRNA与tRNA序列间隔串联在一起形成PTG基因。PTG基因在植物体内被转录后,随着tRNA的成熟与释放,所有gRNA从转录本中释放出来。多个被释放的gRNA引导Cas9蛋白对同一个基因的多个目标位点进行同时切割,进而产生片段缺失的突变基因。该系统中所有组件在拟南芥中都保守存在,因此,本研究猜测此高效PTG/Cas9系统也可以应用于拟南芥中创建突变体。为了验证以上的想法,本文做了如下研究:以PTOX（Plastid terminal oxidase,质体末端氧化酶）为目标基因,将水稻PTG/Cas9基因编辑系统在拟南芥中进行了应用。首先,本人在PTOX基因上选取了 5个特异性的gRNA目标位点,构建了含有此5个位点序列的双元载体,并将其转入拟南芥野生型植株中。实验结果表明,在T1代转基因植株中,有24.4%的植株为片段缺失的PTOX嵌合突变体;然而在这些植株中没有发现纯合的突变植株,这表明T1代植物的基因编辑主要发生在体细胞中。T1代植株自交后,有60%的嵌合突变植株在下一代可产生PTOX纯合突变体、杂合突变体或者双等位基因突变体。实验表明,通过应用PTG/Cas9基因编辑系统,本研究最早可以在T2代获得可遗传的、没有Cas9基因的纯合ptox突变体植株。本研究也将此系统应用到拟南芥的其他基因上成功创建了突变体,并同时建立了一个规范而可靠的、在两到三代创建可遗传的片段缺失突变体的方法。本研究表明,水稻PTG/Cas9系统在拟南芥中也具有高效的基因编辑功能。分子伴侣蛋白是一类可以辅助新生肽链或错误折叠的蛋白进行折叠、组装的蛋白。拟南芥叶绿体分子伴侣蛋白CPN60（Chaperonin 60,伴侣素60）有6种不同的亚基,它们在植物体内以复合体的形式对目标蛋白进行加工,然而复合体的结构及其目标底物并不清楚。本研究以CPN60β1亚基作为切入点,探究了 CPN60复合体的结构及其底物分子。首先,本研究从上述基因编辑实验中获得了一种缺失突变体cpn60β1-trun,它表现出植株矮小且叶片发黄的突变表型。在以往的研究中,CPN60β1基因无效突变体（Null mutant）表现为和野生型相同的绿色表型,这与cpn60β1-trun的突变表型完全不同。通过突变蛋白CPN60β1-trun在野生型植株中的过表达实验,本研究发现突变体cpn60β1-trun中存在的缺失蛋白CPN60β1-trun是导致植株矮小且叶片发黄的原因。其次,酵母双杂交、双分子荧光互补等实验结果表明,CPN60β1-trun可以和正常的CPN60β1一样插入到CPN60复合体中,引起复合体功能失常,进而导致叶绿体结构和功能异常,从而使植物表现出突变表型。进一步通过突变体杂交实验,本研究发现CPN60β1与CPN60β2在功能上具有协同作用,共同控制植物的叶片颜色,却与CPN60β3或CPN60β4不具功能上的协同关系。通过在突变体cpn60β1-trun中分别过表达各个CPN60蛋白,本研究观察到CPN60β3可将突变表型回补（或恢复）为野生型的表型。最后,本研究通过RNA-seq和iTRAQ分析了突变体的整体转录水平和叶绿体中蛋白水平变化。分析结果显示,突变体cpn60β1-trun中参与复制、转录、翻译及蛋白折叠的基因在转录和蛋白水平上大都呈现上调的趋势;参与光合作用的基因在蛋白水平上都呈现下调趋势,而其转录水平因基因所处位置不同而不同,位于核染色体中的,其转录水平下调,位于叶绿体染色体中的,其转录水平上调;另外,结合沉降蛋白的检测结果,本研究预测叶绿体编码的一些光合作用复合体的亚基是CPN60复合体的潜在底物分子。
刘过[6]（2020）在《玉米抗旱生理生化特性及差异表达基因分析》文中提出玉米是世界上重要的粮食作物之一,干旱是影响玉米等谷类作物生长和产量的主要非生物胁迫。许多基因和途径紧密地调节植物的生长、发育和对包括干旱在内的环境压力的反应。尽管近年来在玉米抗旱性研究方面取得了一定的进展,但调控玉米大喇叭口期抗旱性的关键蛋白和基因以及途径等方面的研究仍处于空白状态。本研究的目的在于提高对植物抗旱反应的认识,达到增强作物抗旱性的育种工作需要。研究玉米大喇叭口期的抗旱机制,并寻找与抗旱相关基因及代谢通路,对玉米抗旱育种具有重要意义。本研究以两个抗旱性不同的玉米品种（耐旱农单476和干旱敏感众信978）为材料在小喇叭口期开始,每隔一天进行土壤水分测定,监测处理组田间土壤含水量到达5%-10%,进行共为期12天的水分胁迫到大喇叭口期（V12）,干旱处理期间测定光合速率指标及其相关生理生化指标的变化,结合转录组测序的分析结果探讨玉米在大喇叭口期的抗旱机制,运用实时荧光定量技术验证转录组测序结果准确性,以蛋白组结果分析辅助佐证转录组结果,筛选出与玉米大喇叭口期抗旱相关的关键基因并进行克隆,主要研究结果如下:（1）通过4个玉米材料（两个品种,两种处理）转录组测序分析,从10个样本中获得81.03 GB的Clean Data,总共得到54127万个reads,平均每个样本有4651万个clean reads。分别将10个样本的clean reads 比对到玉米参考基因组B73上。Q30碱基百分率均在96.0%以上,比对率从89.62%到92.91%不等。（2）通过对RNA-seq数据的分析,共鉴定出5805个DEGs,其中21个特异表达于耐旱品种农单476中。其中,参与次生代谢物生物合成、脯氨酸生物合成、转录因子调节、解毒和应激防御的基因在农单476中均有高表达。经qRT-PCR分析,分布在四个不同关键区域的20个基因的实时定量结果与RNA-seq数据中的表达模式一致。（3）生理生化分析结果证实了 RNA-seq数据,农单476比敏感品种众信978在干旱条件下表现出更好的细胞保水能力、更高的可溶性蛋白含量和过氧化物酶活性,以及较低的脂质过氧化程度。（4）通过蛋白组比较分析,从4个实验比较中共鉴定出873个差异丰度蛋白（DAPs）。其中农单476中有49个DAPs,众信978有64个DAPs。农单476的DAPs在内质网蛋白加工和次级代谢生物合成途径中显着富集。抗旱品种农单476在转录和蛋白水平上均表现出了更强的耐旱性。（5）筛选到11个关键DEGs作为候选基因,克隆了农单476应答干旱胁迫的关键基因DNAJ6分子伴侣蛋白,为后续功能验证奠定了基础。本研究利用生理生化和转录组学及蛋白组学分析了玉米大喇叭口期不同抗旱品种的生理生化特征及差异表达基因,挖掘到了一些抗旱相关基因,为玉米抗旱遗传改良分子育种奠定了理论基础。
王保梅[7]（2020）在《转录因子ZmNF-YB16在玉米抗旱机制中的作用》文中提出玉米是重要的粮食兼饲料作物和工业原料,具有重要的经济地位。干旱是影响玉米生长发育和产量的最主要非生物胁迫因子之一,探究玉米干旱胁迫响应中的基因调控网络,挖掘抗旱关键基因对于培育抗旱玉米新品种具有重要意义。NF-Y是真核生物中普遍存在的一类转录因子,由NF-YA、NF-YB和NF-YC三个亚基组成,在植物中参与了植株生长发育及开花周期调控、光合作用、内质网胁迫响应及干旱、高温、盐等非生物胁迫响应。本实验室在前期工作中通过玉米抗旱自交系和干旱敏感自交系的转录组比较发现,ZmNF-YB16在渗透胁迫处理后的抗旱自交系中有较高丰度的表达,而干旱敏感自交系则变化不明显。将该基因转入玉米植株,发现ZmNF-YB16过表达可以显着提高玉米的抗旱性,并提高了玉米的产量。本论文在此基础上开展ZmNF-YB16转录因子在玉米抗旱机制中的作用研究。ZmNF-YB16与ZmNF-YC17、ZmNF-YA1形成异型三聚体调控下游基因的表达构建了滴度为9.5×107 cfu/mL的玉米三叶期植株cDNA酵母文库,以ZmNF-YB16为诱饵筛选互作蛋白。在筛选结果中有一个编码ZmNF-YC家族蛋白的基因 ZmNF-YC17（GRMZM2G311316/Zm00001d024230）,利用 BiFc 和 Pull-down 验证了 ZmNF-YB16和ZmNF-YC17存在直接的相互作用。互作区段分析表明二者互作是依赖于ZmNF-YB16的Histone like保守结构域。采用酵母三杂交技术,确定了 ZmNF-YB16-ZmNF-YC17 异型二聚体可以与 ZmNF-YA1 或 ZmNF-YA7 形成异型三聚体,进化树分析也表明ZmNF-YA1和ZmNF-Y7的最长转录本序列之间相似性最高。亚细胞定位得出,正常条件下ZmNF-YB16和ZmNF-YC17的荧光信号主要分布在胞质中,少量存在于核中;渗透胁迫处理后,两者信号由胞质转移向核中,且存在共定位模式。ZmNF-YA1和ZmNF-YA7无论在正常还是渗透胁迫条件下,其信号存在于核中。这些结果表明ZmNF-YB16-YC17-YA1或ZmNF-YB16-YC17-YA7异型三聚体是在细胞核中形成的。利用RNA sequencing技术,对ZmNF-YA1过表达、zmnf-ya1突变体及其相应的野生型材料进行了干旱胁迫条件下的基因表达分析,发现2个与碳代谢相关的GO、5个与胁迫响应相关的GO、12个与核糖体组装相关的GO在ZmNF-YA1 OE及zmnf-ya1 mutant材料中的富集程度与其相应的对照材料之间存在明显差异。结合转录组测序数据、顺式作用元件分析、chip-qPCR和酵母单杂交验证结果,初步确定了 7个ZmNF-YB16-YC17-YA1 异型三聚体调控的靶基因,即GRMZM2G042895（ZmbH国LH1116）、AC205413.4FG001（ZmPOD64）、GRMZM2G058310（ZmAMY）、GRMZM2G023081（ZmCNR9）、GRMZM2G102760（ZmLOX5）、GRMZM2G051135（ZmMBF1c）和GRMZM2G089106（ZmLSD1）,其中ZmLOX5基因的富集程度最为明显。利用EMSA技术确定了异型三聚体对靶基因的调控是通过NF-YA亚基结合启动子区域的CCAAT顺式作用元件实现的。ZmNF-YB16复合体中存在其他结合蛋白利用ZmmNF-YB1 6-GFP融合基因转化的原生质体进行Co-IP实验筛选到3个蛋白,分别为homeodomain转录因子（GRMZM2G153263）、丝氨酸/苏氨酸磷酸酶（GRMZM2G180691）和60S核糖体蛋白（GRMZM5G868433）。酵母双杂交检测表明ZmNF-YB16不能与GRMZM2G153263蛋白互作,且与ZmNF-YB16的磷酸化状态无关;ZmNF-YB16的磷酸化状态变化能改变其与ZmNF-YC17的互作关系,当第4、8、17、18位氨基酸突变后不再与ZmNF-YC17形成二聚体。ZmNF-YC17与GRMZM2G153263蛋白之间存在互作,且异聚体的形成发生在核中,推测GRMZM2G153263 蛋白与 ZmNF-YB16-YC17-YA1 异聚体形成复合体。ZmNF-YC17和GRMZM2G153263的器官表达模式极其相似,在雄穗中的表达水平最高,其次是V5时期的根和叶片,两基因均受到渗透胁迫的诱导,这种相似的表达模式可能与异聚体的形成与功能有重要的关系。干旱胁迫对玉米不同器官转录组的影响玉米V9雌穗、5DAP叶片和籽粒三个器官的正常发育对于产量形成有重要的意义。V9时期的干旱胁迫通过影响雌穗顶端小穗的正常发育及小穗原基的正常分化,导致行粒数和穗行数的减少,造成了产量的大幅度下降。5DAP时期的干旱胁迫严重影响了叶片的光合作用,抑制了果穗籽粒及传递细胞的正常生长发育,影响了干物质在籽粒中的传递和积累,最终导致了产量的下降。从转录组水平探究干旱胁迫对不同器官的影响,发现3个器官中共同的差异表达基因为292个,聚类分析表明这三个器官在响应干旱胁迫时,差异表达基因的表达水平变化并未表现出明显的一致性,器官差异明显。由于在干旱胁迫中,不同器官的生长发育状态不同,遭受的胁迫程度也不同,基因表达必然表现出器官特异性。这些共同差异表达基因中存在诸多与胁迫响应相关的基因,包括热胁迫、氧化胁迫、多个与乙烯响应相关的基因和bZIP、WRKY家族转录因子等。与热胁迫响应相关的多为热激蛋白基因,与氧化胁迫相关基因中4个编码硫氧还原蛋白。基因表达分析显示,与胁迫响应相关的差异表达基因除个别外均表现出上调表达的趋势。干旱胁迫影响玉米V9雌穗的光合作用-天线蛋白,光合作用、内质网胁迫影响和激素信号响应信号通路基因的表达,光合作用信号通路差异表达基因在野生型雌穗中多呈现上调表达的趋势。内质网胁迫响应通路的差异表达基因多为热激蛋白基因,有HSP4、HSP20、HSP18、HSP70等。V9雌穗细胞分裂和分化旺盛,干旱胁迫引起的差异表达基因显着富集于多条激素信号通路中,包括ABA、生长素、细胞分裂素、乙烯和赤霉素的信号通路,提示干旱胁迫对雌穗细胞的代谢和命运产生重要影响。干旱胁迫对穗位叶的功能影响明显,在野生型中差异表达基因显着富集于光合作用、代谢过程、次级代谢过程、光合作用-天线蛋白和碳代谢过程中。光合作用通路中的差异表达基因大部分为光系统Ⅰ和光系统Ⅱ亚基蛋白基因,且胁迫后表达下调,即干旱胁迫严重抑制了植株的光合作用,减少生长发育需要的能量供给。碳代谢的差异表达基因集中在TCA循环及关联步骤中,干旱胁迫引起柠檬酸合成受抑制,ATP产生减慢,细胞能量供给和合成中间物减少,导致植株生长发育延缓。幼嫩籽粒的生长发育对干旱胁迫敏感,差异表达基因显着富集于mRNA监控、光合作用-天线蛋白、氧化磷酸化、TCA循环和2-氧代羧酸代谢中。mRNA监控通路中多个丝/苏氨酸蛋白磷酸酶PP1和PP2A亚基编码基因的表达因干旱胁迫而变化,显着影响细胞蛋白的磷酸化状态及活性,引起细胞代谢变化。籽粒中能量代谢相关基因表达水平下降会影响细胞能量供给水平,导致籽粒生长发育变差。ZmNF-YB16表达水平变化对玉米基因表达的影响ZmNF-YB16过表达株系在经历干旱胁迫处理中3个器官共同的差异表达基因为502个,显着富集胁迫响应、代谢过程中。基因表达分析发现,胁迫响应相关基因在3个器官中表现出相似的表达变化,而核小体组装和碳代谢相关的基因在雌穗和籽粒中的表达趋势基本一致,与叶片器官中的表达变化差异明显。干旱胁迫条件下,ZmNF-YB16基因过表达显着影响了 V9雌穗的核糖体组装、光合作用、氧化磷酸化、TCA循环、碳代谢和核黄素代谢信号通路基因的表达。随着ZmNF-YB16表达水平的提高,玉米中多条信号通路共同调控作用,雌穗在蛋白质合成速率上做出快速反应,同时维持了较高的能量转化效率使植株表现出优于野生型的特性。ZmNF-YB16过表达植株叶片干旱胁迫后的差异表达基因富集于碳代谢、2-氧代羧酸代谢、N-聚糖合成、糖胺聚糖降解和类黄酮合成。与野生型不同的是过表达植株的差异表达基因在光合作用通路中并未富集,提示在干旱处理条件下ZmNF-YB16基因的过表达有利于叶片光合作用的维持。叶片碳代谢相关的差异表达基因有122个,其中有38个和30个在雌穗和籽粒中也分别表现差异表达,表明碳代谢通路在干旱处理植株的叶片中变化最大,而在迅速发育且受到严格保护的器官中变化较小。干旱胁迫条件下,ZmNF-YB16表达水平的变化影响了叶片光合作用系统、内质网蛋白质的加工、谷胱甘肽代谢等通路基因的表达。ZmNF-YB16过表达维持了植株在胁迫条件的较高光合作用效率和较强抗氧化能力,稳定了蛋白质加工能力,提高了植株的抗逆性。ZmNF-YB16过表达植株幼嫩籽粒中干旱胁迫响应基因富集于代谢过程、次级代谢过程、蔗糖和淀粉代谢、氨基糖和核苷糖代谢、苯丙烷合成通路中。干旱胁迫下,ZmNF-YB16过表达影响了蔗糖和淀粉代谢、类黄酮类的代谢、谷胱甘肽代谢等通路基因的表达。差异表达基因分析发现,干旱胁迫下ZmNF-YB16过表达影响了蔗糖和淀粉代谢,有利于籽粒维持较高的蔗糖浓度而降低单糖水平。ZmNF-YB16过表达对玉米初始转录本合成的影响利用4 sU短时间标记技术,对野生型和ZmNF-YB16基因过表达株系在不同条件下的初始转录本进行研究。首先确定了 4 sU标记玉米幼苗的适宜浓度2mM,在正常或热处理条件下标记时间2 h,而渗透胁迫条件下标记时间6 h。以野生型为参照,过表达ZmNF-YB16基因株系的差异表达初始转录本因处理条件不同而有差异,正常生长、热胁迫和渗透胁迫条件下初始转录差异表达基因个数分别为3184个、3196个、2800个。三种条件下,ZmNF-YB16过表达明显影响了氧化还原、氧化胁迫响应和化学刺激胁迫响应中的相关基因的转录。三种条件下共同的差异表达初始转录本基因中,许多编码细胞色素P450、氧化酶类、过氧化物酶类蛋白。对这些基因进行注释,得出ZmNF-YB16基因通过提高抗氧化胁迫能力在玉米抗逆机制中扮演着重要角色。正常和热胁迫条件下,差异表达初始转录本富集GO有较多重叠,包括胁迫响应、程序性细胞死亡、自噬等过程,暗示ZmNF-YB16表达水平的变化影响了细胞抗逆信号转导过程。渗透胁迫条件下,ZmNF-YB16基因过表达显着影响了参与DNA复制、核小体组装、染色质聚合和解聚、染色体组装等过程的基因转录,如组蛋白编码基因。在过表达株系中包括组蛋白H1、H2A、H2B、H3和H4等蛋白的编码基因呈现下调表达,这些变化导致核小体组装减少,染色体活跃状态增加。差异表达的初始转录本分析结果表明,ZmNF-YB16对基因表达的影响是复杂的,多靶点的,在不同环境条件下可能通过与不同蛋白互作行使不同的调控作用。综上所述,本工作揭示了 ZmNF-YB16可以与ZmNF-YC17、ZmNF-YA1形成异型三聚体,异三聚体通过ZmNF-YA1亚基因结合于胁迫响应和生长发育相关基因启动子区域的CCAAT顺式作用元件上,调控了多个与抗逆和生长相关基因的表达,提高了植株的抗旱性。通过3个不同器官的转录组比较分析,ZmNF-YB16过表达明显影响植株的生长发育和抗旱性,具有功能的复杂性和多样性,ZmNF-YB16在不同器官中显示出不同的调节作用。
张子昕[8]（2019）在《菊花CmTPL1-2调控开花的分子机制研究》文中进行了进一步梳理菊花（Chrysanthemum morifolium）是我国十大传统名花和世界四大切花之一,具有极高的观赏和经济价值,在花卉生产和园林产业应用中占至关重要的地位。为实现其周年供应,需要进行光温调控,但生产成本高昂。前人研究发现独脚金内酯（SL）合成及信号路径关键基因突变会影响花期,但具体开花调控机制并不清楚。本研究以传统菊花‘神马’为材料,通过转基因手段对菊花SL信号路径关键基因TOPLESS1-2（CmTPL1-2）的功能进行研究,利用转录组测序筛选其下游开花路径基因;通过酵母双杂交系统筛选CmTPL1-2的互作蛋白,对筛选得到的蛋白进行体内体外互作验证,从而揭示菊花CmTPL1-2在转录和转录后水平调控菊花开花的分子机制。该研究有望在SL信号调控菊花开花的分子机制方面取得突破,为菊花开花的分子育种提供优异基因。主要内容和结论如下:1.外源独脚金内酯（SL）人工合成类似物GR24喷施处理拟南芥和菊花‘神马’,SL信号路径基因TPL/TPR表达下调,植株开花时间提前,说明SL可以抑制TPL/TPR的表达,同时也说明TPL/TPR参与了 SL调控开花的过程。在此基础上克隆了菊花‘神马’CmTPL1-2。组织定量发现CmTPL1-2基因在茎尖中的表达量最高,在根和茎中表达量很低。为进一步阐释菊花CmTPL1-2的功能,利用定点突变技术使CmTPL1-2的176位天冬氨酸（N）突变成组氨酸（H）即为mut-CmTPL1-2（N176H）。通过洋葱表皮亚细胞定位和转录活性验证实验表明CmTPL1-2和mut-CmTPL1-2均定位在细胞核且具有转录抑制性。2.将CmTPL1-2、mut-CmTPL1-2转化拟南芥,发现CmTPL1-2超表达株系开花推迟,而mut-CmTPL1-2超表达株系则开花提前。通过对关键开花基因FT、TSF、FUL和AP1进行定量验证发现其相对表达量在CmTPL1-2超表达株系中下调,而在mut-CmTPL1-2超表达株系中上调。将CmTPL1-2和mut-CmTPL1-2过量表达菊花‘神马’,开花表型与拟南芥表现一致。通过蛋白互作的研究发现,mut-CmTPL1-2与未突变的野生型CmTPL1-2能够发生强的相互作用,而两个野生型CmTPL1-2之间存在的互作关系极其微弱。说明突变蛋白可能通过影响CmTPL/TPR家族蛋白,导致其功能丧失,造成植株开花提前。通过对CmTPL1-2转基因菊花进行转录组测序,发现光周期路径相关基因除 TOC1/PRR1 之外,包括 CO、COLs、CCA1、LHY、PRR7、AP2/TOEs均下调表达,赤霉素（GA）路径相关基因GRAS/DELLAs、GA2ox和温敏路径基因SVP均显着上调,相应的下游关键开花调控基因FT、AGL20、AGL42、AP1/FUI和FUL/CDM41等表达下调。据此推测CmTPL1-2在转录水平通过光周期、赤霉素和温敏路径调控菊花开花。3.为进一步明确菊花CmTPL1-2参与花期调控的分子机制,构建了菊花‘神马’花芽分化前的酵母文库,以CmTPL1-2为诱饵蛋白筛选其互作蛋白,发现开花相关基因调控蛋白CmJ3和CmSVP与其互作。在酵母中共转验证发现,CmTPL1-2可与CmSVP互作,CmTPL1-2和CmSVP均与CmJ3的C1端互作,与全长并不互作。以洋葱BiFC和烟草FLuCI蛋白互作验证手段证实了 CmTPL1-2、CmSVP和CmJ3之间存在两两互作关系。在拟南芥中分别超表达CmSVP和CmJ3发现,CmSVP转基因株系开花推迟,CmJ3转基因株系开花提前,这为进一步研究CmTPL1-2在翻译水平调控菊花开花奠定了坚实基础。
朱小品[9]（2019）在《水稻胚乳中造粉体发育关键基因FLO11的图位克隆和功能分析》文中指出淀粉是禾谷类作物胚乳的主要成分,占籽粒干重的60-80%,因此淀粉的合成是否正常对作物产量和品质都具有极其重要的影响。淀粉的形成是由多种淀粉合成和代谢途径的关键酶以及调控因子共同参与的复杂过程,最终以淀粉颗粒的形式贮藏于造粉体中。胚乳中淀粉的合成、代谢及造粉体发育缺陷通常导致胚乳发育缺陷,呈现出成熟胚乳粉质、皱缩等表型。通过对胚乳发育缺陷突变体的研究,目前对淀粉合成、代谢途径的关键酶的具体功能已经有了比较清晰的认识。但是淀粉形成的分子机制以及造粉体发育的分子机制还不是很清楚。水稻胚乳占据了籽粒的大部分体积,又是淀粉贮藏的主要场所,因此水稻的胚乳是研究淀粉代谢及造粉体发育的最佳材料。鉴定新的胚乳发育异常的突变体,是挖掘淀粉合成、代谢调控网络以及造粉体发育过程关键基因的有效途径,对全面阐述淀粉合成代谢及造粉体发育的分子机制具有重要的意义。本研究鉴定了一个粉质胚乳突变体flo11,对其表型进行了细致的分析,对其产生粉质表型的分子机制进行了分析及讨论。主要研究结果如下:1.通过辐照诱变籼稻品种N22,筛选到一份粉质胚乳突变体。与野生型相比,突变体植株在整个营养生长期都没有显着差异。但是,突变体籽粒的灌浆速率降低,成熟种子的千粒重显着下降,胚乳表现粉质不透明表型。因此将该突变体命名为flo11（floury endosperm 11）。对成熟种子横截面观察,发现突变体胚乳中心和外围表现明显粉质。进一步扫描电镜观察,发现flo11胚乳的中心和外围淀粉颗粒变球形,排列比较疏松。对突变体和野生型成熟种子中淀粉含量,支链淀粉的结构及理化性质进行了测定,与野生型比,突变体中这些物质的含量均没有显着差异。2.发育早期胚乳的半薄切片和透射电镜观察结果显示,野生型胚乳中,造粉体结构清晰,多个淀粉颗粒相互挤压形成多边形,包裹在造粉体的被膜内,淀粉颗粒之间排列紧密,大小均一。而突变体胚乳的粉质表型区域,存在较多的单粒淀粉颗粒,同时还存在两类结构异常的造粉体,一类表现为淀粉颗粒变小,多个小的淀粉颗粒聚集在一起形成类似于复合淀粉颗粒的结构,造粉体的外被膜变得凹凸不平;另一类几乎看不到造粉体的内部结构,淀粉颗粒染色异常。除了这些异常的造粉体,突变体中还存在大量的发育正常的造粉体。透射电镜观察结果表明,野生型的花后七天的胚乳中淀粉颗粒已经比较充实,而突变体中淀粉颗粒之间还存在较大的空隙,说明突变体的造粉体发育较野生型缓慢。综上细胞学观察结果说明,突变体的胚乳中造粉体发育异常。3.突变体flo11与粳稻品种日本晴配制杂交组合。利用F2分离群体,将flo11突变基因定位在第12染色体短臂,分子标记P37和P18之间360 kb区间。通过NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）和 RiceXPro（http://ricexpro.dna.affrc.go.jp/）网站对该定位区间分析,预测该区间有23个基因。测序发现LOCOs12g14070的第二个外显子第83个碱基（一个T碱基）缺失,导致了蛋白翻译229个氨基酸后终止。转基因互补结果证实LOCOs12g14070即为目标基因。该基因编码了一个热激蛋白70家族的蛋白（Heat shock protein70,Hsp70）。4.荧光定量PCR结果表明,FLO11在根、茎、叶、叶鞘、穗各组织和发育不同时期的胚乳中都有表达,在胚乳发育的中期表达水平最高。Western Blot检测了胚乳不同发育时期FLO11蛋白积累水平,与定量结果一致。GUS组织染色结果也与定量结果一致。这些结果表明,FLO11在发育的胚乳中具有高表达。5.蛋白序列比对分析显示,FLO11与其他各物种中质体定位的Hsp70高度同源。亚细胞定位结果证明FLO11是一个定位在水稻质体的蛋白。FLO11在水稻中还有一个已经被报道的同源蛋白OsHsp70cp-1,因此,我们将FLO11命名为OsHsp70cp-2。OsHsp70cp-2-GFP在转基因植株胚乳中定位于造粉体中,推测OsHsp70cp-2可能在造粉体的发育过程中发挥重要作用。6.BiFC和CoIP实验表明OsHsp70cp-2与质体内膜转运子Tic110和Tic40在一个复合体中,说明OsHsp70cp-2可能参与了造粉体中的蛋白转运过程。
王佳[10]（2019）在《巴西橡胶树DnaJ蛋白对胶乳转化酶HbNIN2酶学调控的研究》文中认为天然橡胶是一种重要的工业原料和战略资源,被广泛应用于交通运输、医药卫生及日常生活等多个方面。巴西橡胶树是天然橡胶的唯一来源,在其乳管组织中以蔗糖为原料合成橡胶。橡胶树乳管中的蔗糖代谢是影响胶乳再生和橡胶产量的关键因素。前期研究中,本实验室鉴定了一个决定乳管蔗糖代谢的关键转化酶HbNIN2,并以HbNIN2为诱饵,利用酵母双杂交技术筛选到多个候选互作蛋白,其中有三个候选互作蛋白属于DnaJ蛋白家族成员。DnaJ蛋白是一类重要的分子伴侣蛋白,可维持植物细胞中新生肽的正确折叠和蛋白构象的稳定,在植物的生长发育和多种胁迫应答过程中发挥重要的生理功能。为进一步了解与HbNIN2互作的DnaJ蛋白的功能,特别是它们是否参与HbNIN2的酶学特性调控,本文克隆了这三个橡胶树DnaJ基因的全长cDNA,并分析了它们在橡胶树中的组织表达模式、割胶和乙烯利刺激的应答,并利用原核表达的重组蛋白探究了 HbDnaJs蛋白对HbNIN2的酶活调控作用,主要结果如下:1.利用RT-PCR方法,从橡胶树中克隆了三个DnaJ基因的全长cDNA序列,分别命名为 HbDnaJ1、HbDnaJ2和HbDnaJ3。2.利用酵母双杂交点对点技术验证三个HbDnaJ蛋白与HbNIN2的互作关系,进一步证明三个HbDnaJ蛋白均与HbNIN2发生明显互作。3.通过QPCR分析了三个HbDnaJ基因的表达特性。在正常割胶的橡胶树中,HbDnaJ1和HbDnaJ2基因主要在种子中表达,而HbDnaJ3基因无明显的组织表达特异性;在未开割树中,割胶和乙烯利刺激均对三个HbDnaJ基因表达的影响不明显,仅HbDnaJ2基因在割胶处理下表达下调。4.利用大肠杆菌表达体系表达了三个HbDnaJ基因,并通过优化诱导表达条件,实现了它们重组蛋白的高效表达。5.利用体外重组蛋白的共孵育方法研究了 HbDnaJs蛋白对HbNIN2转化酶活性的影响,发现三种DnaJ蛋白均能显着增加HbNIN2的酶活,提高HbNIN2酶活的热稳定性,减轻重金属离子胁迫对HbNIN2酶活的抑制作用。本文首次发现DnaJ蛋白对中碱性转化酶活性具有明显的调控功能,结果有助于深入了解橡胶树胶乳转化酶活性调控的机制,并拓宽了植物中碱性转化酶活性调控研究的领域,具有一定的理论意义与应用前景。
二、DnaJ类分子伴侣PBP的基因克隆及亚细胞定位研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、DnaJ类分子伴侣PBP的基因克隆及亚细胞定位研究（论文提纲范文）
（1）热激蛋白在松墨天牛响应高温胁迫中的功能研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 高温胁迫对昆虫的影响 |
| 1.1.1 高温胁迫对存活的影响 |
| 1.1.2 高温胁迫对生长发育的影响 |
| 1.1.3 高温胁迫对繁殖的影响 |
| 1.1.4 高温胁迫对昆虫生理生化的影响 |
| 1.2 昆虫耐热性研究进展 |
| 1.2.1 昆虫耐热性评价方法 |
| 1.2.2 昆虫耐热性机制 |
| 1.2.3 昆虫耐热性的研究意义 |
| 1.3 热激蛋白研究进展 |
| 1.3.1 热激蛋白家族的分类与结构特性 |
| 1.3.2 热激蛋白家族的互作关系研究进展 |
| 1.3.3 昆虫高温胁迫响应与热激蛋白 |
| 1.3.4 昆虫热激蛋白研究的局限性 |
| 1.4 松墨天牛研究进展 |
| 1.4.1 松墨天牛与松材线虫病 |
| 1.4.2 温度对松墨天牛的影响 |
| 1.5 研究意义和研究内容 |
| 1.5.1 研究目的和意义 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 第二章 高温胁迫下松墨天牛成虫的存活及繁殖特性 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 仪器与设备 |
| 2.1.2 供试昆虫 |
| 2.1.3 连续性高温胁迫 |
| 2.1.4 周期重复性高温胁迫 |
| 2.1.5 数据分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 连续高温胁迫下成虫的致死中时间 |
| 2.2.2 周期重复性高温胁迫下成虫的存活情况 |
| 2.2.3 周期重复性高温胁迫下成虫的取食量 |
| 2.2.4 周期重复性高温胁迫下成虫的产卵量 |
| 2.2.5 周期重复性高温胁迫后松墨天牛的子代适合度 |
| 2.3 结论与讨论 |
| 第三章 松墨天牛热激蛋白基因的克隆及进化分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 主要试剂及仪器设备 |
| 3.1.2 供试昆虫 |
| 3.1.3 松墨天牛成虫RNA制备 |
| 3.1.4 松墨天牛成虫DNA提取 |
| 3.1.5 松墨天牛成虫cDNA合成 |
| 3.1.6 松墨天牛热激蛋白基因cDNA序列克隆 |
| 3.1.7 松墨天牛热激蛋白基因组DNA序列克隆 |
| 3.1.8 松墨天牛热激蛋白序列基本特征分析 |
| 3.1.9 松墨天牛热激蛋白系统进化树构建与保守Motif分析 |
| 3.1.10 松墨天牛HSP蛋白结构预测 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 松墨天牛热激蛋白序列基本特征分析 |
| 3.2.2 松墨天牛热激蛋白序列进化分析 |
| 3.2.3 松墨天牛HSP蛋白结构分析 |
| 3.3 结论与讨论 |
| 第四章 松墨天牛热激蛋白对高温胁迫的转录响应 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 所用试剂及设备 |
| 4.1.2 供试昆虫 |
| 4.1.3 高温胁迫处理 |
| 4.1.4 RNA提取 |
| 4.1.5 cDNA合成 |
| 4.1.6 实时荧光定量PCR |
| 4.1.7 数据分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 松墨天牛HSP20对高温胁迫的转录响应 |
| 4.2.2 松墨天牛HSP40对高温胁迫的转录响应 |
| 4.2.3 松墨天牛HSP70对高温胁迫的转录响应 |
| 4.3 结论与讨论 |
| 第五章 松墨天牛HSP20和HSP70基因的原核表达及分子伴侣活性验证 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 所用试剂及仪器 |
| 5.1.2 原核表达载体构建 |
| 5.1.3 松墨天牛热激蛋白诱导表达 |
| 5.1.4 松墨天牛热激蛋白纯化及透析浓缩 |
| 5.1.5 热激蛋白分子伴侣活性验证 |
| 5.1.6 数据分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 MaltHSP20和MaltHSP70的原核表达及纯化 |
| 5.2.2 MaltHSP20s分子伴侣活性验证 |
| 5.2.3 MaltHSP70-2分子伴侣活性验证 |
| 5.3 结论与讨论 |
| 第六章 松墨天牛HSP20和HSP70基因的蛋白印迹及免疫荧光定位分析 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 所用仪器及设备 |
| 6.1.2 MaltHSP20-5、MaltHSP20-11和MaltHSP70-2多抗血清制备及效价测定 |
| 6.1.3 试虫饲养 |
| 6.1.4 实验样品准备 |
| 6.1.5 MaltHSP20-5、MaltHSP20-11和MaltHSP70-2的Western blot检测 |
| 6.1.6 石蜡组织切片及HE染色 |
| 6.1.7 MaltHSP20-5和MaltHSP70-2免疫荧光染色 |
| 6.1.8 数据分析 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 MaltHSP20-5、MaltHSP20-11和MaltHSP70-2的WB分析 |
| 6.2.2 松墨天牛精巢管叶的HE染色分析 |
| 6.2.3 MaltHSP20-5和MaltHSP70-2在松墨天牛精巢叶中的IF分析 |
| 6.3 结论与讨论 |
| 第七章 基于RNA干扰对MaltHSP20-5和MaltHSP70-2基因的功能验证 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 主要试剂及仪器设备 |
| 7.1.2 供试昆虫 |
| 7.1.3 RNA的制备及cDNA的合成 |
| 7.1.4 双链RNA合成 |
| 7.1.5 松墨天牛的RNA干扰处理 |
| 7.1.6 MaltHSP20-5和MaltHSP70-2的干扰效应检测 |
| 7.1.7 松墨天牛成虫耐热性测定 |
| 7.1.8 数据分析 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 双链RNA的合成 |
| 7.2.2 MaltHSP20-5和MaltHSP70-2的RNA干扰效应 |
| 7.2.3 松墨天牛HSP基因的互作关系 |
| 7.2.4 干扰MaltHSP20-5和MaltHSP70-2基因对成虫耐热性的影响 |
| 7.3 结论与讨论 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| 不足与展望 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（2）褐飞虱热激蛋白不同家族基因及其功能研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 昆虫对温度胁迫的响应 |
| 1.1.1 温度胁迫对昆虫的影响 |
| 1.1.2 昆虫应对温度胁迫的机制 |
| 1.2 热激蛋白概述 |
| 1.2.1 sHSP |
| 1.2.2 DNAJ/HSP70 |
| 1.2.3 Chaperonin |
| 1.2.4 HSP90 |
| 1.2.5 HSP100 |
| 1.3 褐飞虱热激蛋白相关研究 |
| 1.4 研究的内容与意义 |
| 第二章 主要实验仪器、材料及方法 |
| 2.1 供试昆虫 |
| 2.2 温度胁迫处理 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 2.4 主要实验试剂 |
| 2.4.1 常用试剂 |
| 2.4.2 常用试剂盒 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.5.1 Trizol法提取总RNA |
| 2.5.2 总RNA反转录 |
| 2.5.3 实时荧光定量PCR(q RT-PCR) |
| 2.5.4 DNA琼脂糖凝胶纯化回收 |
| 2.5.5 T载体连接 |
| 2.5.6 热激法转化 |
| 2.5.7 挑斑摇菌 |
| 2.5.8 双链RNA合成 |
| 2.5.9 褐飞虱显微注射 |
| 第三章 褐飞虱s HSP家族基因鉴定及功能分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 褐飞虱种群及饲养 |
| 3.2.2 褐飞虱s HSP基因鉴定及序列分析 |
| 3.2.3 sHSP基因时空表达模式分析 |
| 3.2.4 RNA干扰实验 |
| 3.2.5 正常生长条件下褐飞虱雌虫生殖力测定 |
| 3.2.6 高温胁迫下褐飞虱雌虫生殖力测定 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 褐飞虱sHSP基因鉴定及系统发育分析 |
| 3.3.2 时空表达模式分析 |
| 3.3.3 表型观察 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 褐飞虱HSP70/DNAJ家族基因鉴定及功能分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 褐飞虱种群及饲养 |
| 4.2.2 基因鉴定与序列分析 |
| 4.2.3 时空表达模式分析 |
| 4.2.4 正常生长条件下RNA干扰实验 |
| 4.2.5 RNAi后高温胁迫处理 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 褐飞虱HSP70和DNAJ家族基因鉴定 |
| 4.3.2 系统发育分析 |
| 4.3.3 褐飞虱HSP70和DNAJ基因组织表达模式分析 |
| 4.3.4 褐飞虱HSP70和DNAJ基因发育表达模式分析及对温度胁迫的响应 |
| 4.3.5 大规模RNAi鉴定得到几个褐飞虱必需的HSP |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 HSP70 对褐飞虱生长发育及耐热性的重要性 |
| 4.4.2 DNAJ对褐飞虱生长发育的重要性 |
| 第五章 褐飞虱Chaperonin家族基因鉴定及功能分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 褐飞虱种群及饲养 |
| 5.2.2 基因鉴定与系统进化分析 |
| 5.2.3 时空表达模式 |
| 5.2.4 RNA干扰 |
| 5.2.5 RNAi对雌虫生殖的影响 |
| 5.2.6 RNAi对雄虫生殖的影响 |
| 5.2.7 扫描电镜观察(SEM) |
| 5.2.8 透射电镜观察(TEM) |
| 5.2.9 原核表达及多克隆抗体制备 |
| 5.2.10 蛋白质免疫印迹(Western blot) |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 褐飞虱Chaperonin基因鉴定和系统发育分析 |
| 5.3.2 时空表达模式分析 |
| 5.3.3 八个NlCCT基因沉默对若虫的影响 |
| 5.3.4 NlCCT基因沉默对雌雄虫生殖力的影响 |
| 5.3.5 沉默Hsp10/Hsp60 对褐飞虱的影响 |
| 5.3.6 多克隆抗体验证 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 NlCCTs在褐飞虱中的重要功能 |
| 5.4.2 NlHsp10/NlHsp60 在褐飞虱中的重要功能 |
| 第六章 褐飞虱HSP90 家族基因鉴定及功能分析 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 褐飞虱种群及饲养 |
| 6.2.2 HSP90 基因鉴定与系统进化分析 |
| 6.2.3 时空表达模式 |
| 6.2.4 RNA干扰 |
| 6.2.5 褐飞虱生殖力测定 |
| 6.2.6 透射电镜观察 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 褐飞虱HSP90 基因鉴定与序列分析 |
| 6.3.2 系统发育分析 |
| 6.3.3 时空表达模式分析 |
| 6.3.4 RNAi及生存分析 |
| 6.3.5 褐飞虱Hsp90 对卵巢发育和生殖力的影响 |
| 6.3.6 透射电镜观察 |
| 6.4 讨论 |
| 第七章 褐飞虱HSP100 家族基因鉴定及功能分析 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 材料与方法 |
| 7.2.1 褐飞虱种群及饲养 |
| 7.2.2 基因鉴定与系统进化分析 |
| 7.2.3 时空表达模式 |
| 7.2.4 RNA干扰 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.3.1 褐飞虱HSP100 基因结构和系统发育分析 |
| 7.3.2 HSP100 基因的时空表达模式分析 |
| 7.3.3 表型观察 |
| 7.4 讨论 |
| 第八章 总结与展望 |
| 8.1 全文总结 |
| 8.2 本研究创新点 |
| 8.3 未来研究方向 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（3）宿主细胞蛋白STAT5、NPM1和DNAJB6在PCV2复制过程中作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 文献综述 |
| 第一章 动物病毒与宿主细胞蛋白互作研究进展 |
| 1.1 宿主细胞蛋白在动物病毒复制过程中作用及机制 |
| 1.1.1 NPM蛋白家族 |
| 1.1.2 Hsp家族成员 |
| 1.1.3 组蛋白分子伴侣 |
| 1.1.4 MCM家族成员 |
| 1.1.5 STAT家族成员 |
| 1.1.6 TRIM家族成员 |
| 1.1.7 波形蛋白 |
| 1.2 PCV2与宿主细胞蛋白互作研究进展 |
| 1.2.1 PCV2与宿主细胞蛋白互作在病毒吸附和入胞过程中作用与机制 |
| 1.2.2 PCV2与宿主细胞蛋白互作在病毒入核和复制过程中作用与机制 |
| 1.2.3 PCV2与宿主细胞蛋白互作在病毒出核及出胞过程中作用与机制 |
| 1.3 本研究的目的意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 PCV2 Cap宿主细胞互作蛋白筛选与鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞、病毒及菌株 |
| 2.1.2 载体及主要试剂 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 PCV2 Cap宿主细胞互作蛋白的筛选 |
| 2.2.2 stat5克隆及真核表达载体的构建 |
| 2.2.3 npm1克隆及真核表达载体的构建 |
| 2.2.4 dnajb6克隆及真核表达载体的构建 |
| 2.2.5 不同种属来源的STAT5、NPM1及DNAJB6 序列比对 |
| 2.2.6 激光共聚焦检测STAT5、NPM1及DNAJB6 亚细胞定位 |
| 2.2.7 试验动物及分组设计 |
| 2.2.8 STAT5、NPM1、DNAJB6的m RNA水平检测 |
| 2.2.9 组织STAT5、NPM1、DNAJB6 表达情况检测 |
| 2.2.10 数据分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 PCV2 Cap宿主互作蛋白的筛选与鉴定 |
| 2.3.2 stat5克隆及真核表达载体的构建与鉴定 |
| 2.3.3 npm1克隆及真核表达载体的构建与鉴定 |
| 2.3.4 dnajb6克隆及真核表达载体的构建与鉴定 |
| 2.3.5 STAT5序列比对分析 |
| 2.3.6 NPM1序列比对分析 |
| 2.3.7 DNAJB6序列比对分析 |
| 2.3.8 STAT5在PCV2 感染细胞中的亚细胞定位 |
| 2.3.9 NPM1在PCV2 感染细胞中的亚细胞定位 |
| 2.3.10 DNAJB6在PCV2 感染细胞中的亚细胞定位 |
| 2.3.11 STAT5在PCV2 感染猪组织中的表达量变化 |
| 2.3.12 NPM1在PCV2 感染猪组织中的表达变化 |
| 2.3.13 DNAJB6在PCV2 感染猪组织中的表达变化 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 宿主细胞蛋白STAT5在PCV2 复制过程中作用及机制 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞、病毒及菌种 |
| 3.1.2 载体、主要试剂 |
| 3.1.3 仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 stat5原核表达载体的构建 |
| 3.2.2 免疫共沉淀检测Cap和 STAT5 的互作 |
| 3.2.3 GST-pull down检测Cap和 STAT5 的互作 |
| 3.2.4 干扰stat5 表达对PCV2 复制的影响 |
| 3.2.5 DNA pull-down检测STAT5与PCV2 DNA互作区域 |
| 3.2.6 PCV2 DNA结合活性缺失的PCV2 突变毒株构建与鉴定 |
| 3.2.7 荧光原位杂交(FISH)检测突变毒株的复制情况 |
| 3.2.8 荧光定量PCR检测突变毒株的DNA拷贝数 |
| 3.2.9 数据分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 STAT5原核表达载体的鉴定 |
| 3.3.2 免疫共沉淀检测Cap与 STAT5 互作 |
| 3.3.3 GST-pull down鉴定Cap和 STAT5 互作 |
| 3.3.4 干扰stat5 表达显着抑制 PCV2 的复制 |
| 3.3.5 PCV2突变毒株的构建与鉴定 |
| 3.3.6 DNA pull down验证PCV2 DNA与 STAT5 互作区域 |
| 3.3.7 突变毒株PCV2-MDS在细胞内的复制情况 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 宿主细胞蛋白NPM1在PCV2 复制过程中作用及机制 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞、病毒及菌株 |
| 4.1.2 载体和主要试剂 |
| 4.1.3 仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 干扰npm1 表达对PCV2 复制影响 |
| 4.2.2 干扰npm1 表达对PCV2 Cap表达影响 |
| 4.2.3 利用CRISPR/Cas9 系统敲除PK-15中npm1 |
| 4.2.4 NPM1及截短体原核表达载体的构建 |
| 4.2.5 Cap及截短体真核表达载体的构建 |
| 4.2.6 GST-pull down检测Cap及其截短体与NPM1 的互作 |
| 4.2.7 NPM1 结合活性缺失的PCV2 突变毒株的构建与鉴定 |
| 4.2.8 荧光定量PCR检测PCV2 突变毒株的复制水平 |
| 4.2.9 荧光原位杂交(FISH)检测突变毒株的复制情况 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 干扰npm1对Cap表达和PCV2 DNA复制影响 |
| 4.3.2 npm1敲除的 PK-15 建立与鉴定 |
| 4.3.3 GST-pull down 检测 Cap、NPM1 以及 STAT5 之间的互作 |
| 4.3.4 NPM1及截短体原核表达载体的构建与鉴定 |
| 4.3.5 Cap及截短体真核表达载体的构建与鉴定 |
| 4.3.6 GST-pull down确定NPM1与Cap互作区域 |
| 4.3.7 NPM1 结合活性缺失的PCV2 突变毒株构建与鉴定 |
| 4.3.8 PCV2 突变毒株PCV2-Nm A复制水平 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 宿主细胞蛋白DNAJB6在PCV2 复制过程中作用及机制 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 细胞、病毒及菌株 |
| 5.1.2 载体和主要试剂 |
| 5.1.3 仪器设备 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 荧光定量PCR检测PCV2 拷贝数 |
| 5.2.2 western blotting检测DNAJB6和Cap的表达 |
| 5.2.3 间接免疫荧光检测Cap及 DNAJB6 的定位情况 |
| 5.2.4 免疫共沉淀检测Cap与 DNAJB6 的互作 |
| 5.2.5 DNAJB6及截短体原核表达载体的构建 |
| 5.2.6 Cap截短体真核表达载体的构建 |
| 5.2.7 DNAJB6突变体真核表达载体的构建 |
| 5.2.8 DNAJB6及截短体原核表达及纯化鉴定 |
| 5.2.9 GST-pull down检测Cap及 DNAJB6 的互作 |
| 5.2.10 激光共聚焦检测PCV2及PCV2 Cap诱导的自噬小体 |
| 5.2.11 相对荧光定量PCR检测DNAJB6的m RNA水平 |
| 5.2.12 利用si RNA干扰atg5 的表达 |
| 5.2.13 抑制试验 |
| 5.2.14 数据分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 PCV2 感染上调PK-15中DNAJB6 的表达 |
| 5.3.2 DNAJB6与PCV2 Cap共定位 |
| 5.3.3 DNAJB6与PCV2 Cap的互作 |
| 5.3.4 DNAJB6全长及截短体原核表达载体的构建与鉴定 |
| 5.3.5 Cap截短体真核表达载体的构建与鉴定 |
| 5.3.6 鉴定DNAJB6与Cap的互作区域 |
| 5.3.7 dnajb6敲除的 PK-15 细胞鉴定 |
| 5.3.8 dnajb6敲除抑制自噬小体的形成和病毒复制 |
| 5.3.9 DNAJB6过表达促进自噬体的形成和病毒复制 |
| 5.3.10 DNAJB6与Cap的互作促进自噬体的形成 |
| 5.3.11 DNAJB6与Cap的互作通过增强自噬促进PCV2 复制 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（4）马铃薯磷转运蛋白家族的鉴定及PHO1亚家族提高转基因马铃薯耐热性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 马铃薯概述 |
| 1.2 植物对高温胁迫(热胁迫)的响应 |
| 1.2.1 热胁迫对细胞膜的影响 |
| 1.2.2 热胁迫对光合作用的影响 |
| 1.2.3 热胁迫对活性氧代谢的影响 |
| 1.2.4 热胁迫对渗透调节物质的影响 |
| 1.2.5 热胁迫对热激蛋白的影响 |
| 1.2.6 提高植物耐热性的研究概况 |
| 1.3 磷元素的获取,转运和功能 |
| 1.3.1 磷的吸收及在植物中的作用 |
| 1.3.2 磷转运蛋白家族的分类与功能 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 1.5 本研究的内容与依据 |
| 1.6 技术路线 |
| 第二章 马铃薯磷转运蛋白家族成员的鉴定分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 植物材料和主要相关试剂 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 马铃薯磷转运蛋白的筛选 |
| 2.1.4 马铃薯磷转运蛋白的基因/蛋白序列分析 |
| 2.1.5 马铃薯磷转运蛋白的染色体定位、进化树和基因复制事件 |
| 2.1.6 马铃薯磷转运蛋白的表达模式 |
| 2.1.7 马铃薯磷转运蛋白PHO1家族的定量分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 马铃薯中磷转运蛋白的鉴定、分类及序列分析 |
| 2.2.2 基序、结构域、外显子和亚细胞定位预测 |
| 2.2.3 染色体定位和基因复制事件分析 |
| 2.2.4 基因注释和进化树分析 |
| 2.2.5 马铃薯中磷转运蛋白的表达模式分析 |
| 2.2.6 高温下PHO1家族的转录水平分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 异源表达StPHO1s对热胁迫的响应 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 植物材料、载体和主要相关试剂 |
| 3.1.2 主要仪器设备 |
| 3.1.3 主要培养基和缓冲液配制 |
| 3.1.4 载体构建及鉴定 |
| 3.1.5 拟南芥种植、转化与耐热性鉴定 |
| 3.1.6 烟草种植与瞬时表达 |
| 3.1.7 酵母耐热实验 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 目的片段的扩增与连接转化 |
| 3.2.2 转基因拟南芥耐热性鉴定 |
| 3.2.3 烟草瞬时表达分析 |
| 3.2.4 转化酵母的耐热实验 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 马铃薯转化及转基因植株的筛选与分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 植物材料和主要试剂 |
| 4.1.2 主要仪器设备 |
| 4.1.3 培养基和相关溶液配制 |
| 4.1.4 农杆菌介导的马铃薯转化 |
| 4.1.5 转基因植株鉴定 |
| 4.1.6 转基因马铃薯耐热性鉴定 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 马铃薯转化 |
| 4.2.2 转基因马铃薯鉴定 |
| 4.2.3 耐热性实验 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 过表达StPHO1s对“Desiree”耐热相关指标的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.0 植物材料和主要试剂 |
| 5.1.1 主要仪器设备 |
| 5.1.2 主要相关溶液的配制 |
| 5.1.3 脯氨酸含量检测 |
| 5.1.4 叶绿体色素含量检测 |
| 5.1.5 光合速率检测 |
| 5.1.6 相对电导率检测 |
| 5.1.7 相关基因表达量检测 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 酶活性测定 |
| 5.2.2 光合速率和叶绿体色素含量测定 |
| 5.2.3 脯氨酸和可溶性糖含量测定 |
| 5.2.4 MDA和相对电导率测定 |
| 5.2.5 相关基因的表达模式 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 StPHO1s互作蛋白的筛选与验证 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 植物材料、载体菌株和主要试剂 |
| 6.1.2 主要仪器设备 |
| 6.1.3 培养基和相关溶液配制 |
| 6.1.4 载体构建 |
| 6.1.5 亚细胞定位 |
| 6.1.6 酵母双杂实验 |
| 6.1.7 双分子荧光互补(BIFC) |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 StPHO1s的亚细胞定位 |
| 6.2.2 酵母双杂筛选互作蛋白 |
| 6.2.3 互作蛋白的亚细胞定位 |
| 6.2.4 BIFC实验 |
| 6.3 讨论 |
| 第七章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 马铃薯中HD-ZIP家族在高温胁迫下的表达模式 |
| 附录2 马铃薯中Hsp90家族在高温胁迫下的表达模式 |
| 附录3 45种植物的磷转运蛋白名称 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）高效PTG/Cas9基因编辑系统在拟南芥中的应用及分子伴侣蛋白CPN60结构与功能的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语对照表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 论文章节的划分 |
| 1.2 基因编辑技术的概述 |
| 1.2.1 锌指核酸酶技术(ZFN) |
| 1.2.2 转录激活样效应因子核酸酶技术(TALEN) |
| 1.2.3 核酸内切酶CRISPR/Cas9技术 |
| 1.2.4 CRISPR/Cas9系统在拟南芥中的应用 |
| 1.2.5 小结及展望 |
| 1.3 分子伴侣蛋白的综述 |
| 1.3.1 HSP100家族 |
| 1.3.2 HSP90家族 |
| 1.3.3 HSP70家族 |
| 1.3.4 伴侣素家族(Chaperonin) |
| 1.3.5 sHSP家族 |
| 1.3.6 小结及展望 |
| 1.4 论文选题背景及意义 |
| 第二章 实验材料及方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株与载体 |
| 2.1.3 实验试剂、软件与仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 拟南芥培养条件 |
| 2.2.2 拟南芥基因组DNA的提取 |
| 2.2.3 PCR鉴定T-DNA插入突变体 |
| 2.2.4 拟南芥总RNA的提取及cDNA的获得 |
| 2.2.5 反转录RCR (RT-PCR),实时定量RCR (qRT-PCR) |
| 2.2.6 载体构建 |
| 2.2.7 碱裂解法提取质粒 |
| 2.2.8 大肠杆菌DH5α感受态的制备 |
| 2.2.9 农杆菌GV3101感受态的制备 |
| 2.2.10 双元载体转化农杆菌GV3101 |
| 2.2.11 农杆菌介导的拟南芥转染和筛选 |
| 2.2.12 叶绿体超显微结构 |
| 2.2.13 叶绿体光合参数的测定 |
| 2.2.14 拟南芥总蛋白粗提 |
| 2.2.15 聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白免疫印迹(Western blot)检测 |
| 2.2.16 银染 |
| 2.2.17 酵母双杂交(Yeast two-hybrid) |
| 2.2.18 烟草双分子荧光互补实验(BiFC) |
| 2.2.19 拟南芥突变体的图位克隆 |
| 2.2.20 完整叶绿体的提取 |
| 2.2.21 蓝色活性胶电泳(BN-PAGE) |
| 2.2.22 RNA-seq |
| 2.2.23 iTRAQ蛋白测序 |
| 2.2.24 沉降蛋白的分离 |
| 2.2.25 对RNA-seq及iTRAQ数据的GO分析 |
| 第三章 PTG/Cas9基因编辑体系在拟南芥中的应用 |
| 3.1 结果与分析 |
| 3.1.1 PTOX-PTG/Cas9系统的载体构建 |
| 3.1.2 拟南芥T1代PTOX基因编辑效率 |
| 3.1.3 在拟南芥T2代筛选ptox纯合突变体 |
| 3.1.4 筛选无Cas9基因的ptox纯合突变体 |
| 3.1.5 使用PTG/Cas9系统突变FKBP17-2基因 |
| 3.1.6 PTG/Cas9系统在拟南芥中定点突变基因的方案 |
| 3.2 小结 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 水稻PTG/Cas9系统在拟南芥中产生片段缺失突变体的效率 |
| 3.3.2 T1代体细胞高效率突变对于产生纯合突变体至关重要 |
| 3.3.3 PTG/Cas9系统在拟南芥中的优化 |
| 第四章 拟南芥分子伴侣蛋白CPN60结构与功能的研究 |
| 4.1 结果与分析 |
| 4.1.1 黄色矮小突变体是由于CPN60β1基因的突变所致 |
| 4.1.2 缺失蛋白CPN60β1-trun导致植株表现突变表型 |
| 4.1.3 蛋白CPN60β1-trun仍具整合并插入CPN60复合体的功能 |
| 4.1.4 CPN60β1与CPN60β2共同维持植株叶片颜色 |
| 4.1.5 过表达CPN60β3可以恢复cpn60β1-trun的突变表型 |
| 4.1.6 突变体cpn60β1-trun含结构与功能缺陷的叶绿体 |
| 4.1.7 突变体cpn60β1-trun的转录组分析 |
| 4.1.8 突变体cpn60β1-trun的叶绿体蛋白组分析 |
| 4.1.9 推测叶绿体编码的一些复合体些亚基为CPN60复合体的底物 |
| 4.2 小结 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 CPN60复合体的结构 |
| 4.3.2 突变体cpn60β1-trun中的叶绿体UPR途径 |
| 4.3.3 预测CPN60复合体的底物 |
| 结论与创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（6）玉米抗旱生理生化特性及差异表达基因分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 植物应答干旱胁迫的研究基础 |
| 1.1.1 植物形态学变化 |
| 1.1.2 光合速率和气孔对干旱的响应 |
| 1.1.3 植物渗透调节 |
| 1.1.4 植物抗氧化系统 |
| 1.2 作物应答干旱胁迫的研究进展 |
| 1.3 转录组学研究进展 |
| 1.4 研究背景、内容、目的和意义 |
| 1.4.1 研究背景 |
| 1.4.2 研究内容与方法 |
| 1.4.3 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 实验设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 实验设计与干旱处理方法 |
| 2.2.2 表型和生理生化指标测定方法 |
| 2.2.3 转录组学分析方法 |
| 2.2.4 iTRAQ的定量蛋白质组检测与分析方法 |
| 2.2.5 基因克隆 |
| 2.2.6 数据统计分析 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 植株表型、光合速率指标及生理生化结果分析 |
| 3.1.1 植株表型和生理生化指标结果分析 |
| 3.1.2 光合速率 |
| 3.2 大喇叭口期抗旱转录组分析结果 |
| 3.2.1 RNA-seq分析结果 |
| 3.2.2 转录组应答分析 |
| 3.2.3 基因差异表达分析 |
| 3.2.4 DEGs注释和功能分类 |
| 3.2.5 DEGs编码转录因子 |
| 3.2.6 DEGs的KEGG代谢通路富集分析 |
| 3.2.7 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证RNA-seq |
| 3.3 大喇叭口期抗旱蛋白组结果分析 |
| 3.3.1 iTRAQ数据鉴定及质控分析结果 |
| 3.3.2 蛋白功能注释 |
| 3.3.3 蛋白质定量及差异表达 |
| 3.3.4 NDD_NDC比较组中得到差异蛋白功能富集分析 |
| 3.3.5 NDD_ZXD比较组中得到差异蛋白功能富集分析 |
| 3.4 DNAJ分子伴侣蛋白基因克隆结果 |
| 3.4.1 引物设计 |
| 3.4.2 琼脂糖凝胶电泳结果 |
| 3.4.3 送测序结果 |
| 3.4.4 比对结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 玉米杂交品种在生理水平上的干旱胁迫差异响应 |
| 4.2 转录组结果讨论 |
| 4.2.1 干旱条件下的次生代谢物生物合成及碳水化合物代谢相关酶 |
| 4.2.2 玉米氨基酸(脯氨酸)生物合成与干旱胁迫响应 |
| 4.2.3 转录因子相关基因在调控干旱胁迫反应中起关键作用 |
| 4.2.4 水通道蛋白和谷胱甘肽S-转移酶在干旱胁迫中起重要作用 |
| 4.2.5 干旱条件下氮代谢酶和光合相关基因表达下调 |
| 4.2.6 对刺激的反应和催化活性相关的DEGs |
| 4.2.7 干旱胁迫条件下代谢途径显着丰富 |
| 4.3 转录组与蛋白组结果联合分析 |
| 4.3.1 农单476在干旱胁迫下的差异基因与差异蛋白 |
| 4.3.2 农单476在干旱条件下两组之间的KEGG通路响应异同 |
| 4.3.3 干旱胁迫下两个品种的DEGs与DAPs参与的KEGG通路响应异同 |
| 4.4 分子伴侣蛋白DNAJ |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附表一 |
| 附表二 |
| 附表三 |
| 在读期间发表和投稿的论文 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
| 附件 |
| 论文录用通知 |
（7）转录因子ZmNF-YB16在玉米抗旱机制中的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 转录因子在植物干旱胁迫应答中发挥着重要作用 |
| 1.2 植物NF-Y转录因子的研究进展 |
| 1.2.1 NF-Y复合体在植物中的复杂性 |
| 1.2.2 植物NF-Y转录因子结构特点 |
| 1.2.3 NF-Y参与了植物的生长发育及开花周期的调控 |
| 1.2.4 NF-Y参与植物光合作用系统的调控 |
| 1.2.5 NF-Y在内质网胁迫响应中发挥重要作用 |
| 1.2.6 NF-Y在植物胁迫响应中发挥重要作用 |
| 1.3 植物的抗旱性研究进展 |
| 1.3.1 抗旱性与植物根系形态变化 |
| 1.3.2 抗旱性与光合作用的维持 |
| 1.3.3 抗旱性与渗透保护物质的积累 |
| 1.3.4 抗氧化防御系统在植物抗旱中的作用 |
| 1.3.5 植物抗旱性与激素信号的调节 |
| 1.4 干旱胁迫对玉米产量的影响因发育阶段而不同 |
| 1.5 本工作的目的和意义 |
| 第二章 ZmNF-YB16基因过表达提高玉米抗旱性的分子机制研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 试剂、溶液和培养基配制 |
| 2.1.3 酵母文库构建方法 |
| 2.1.4 酵母文库筛选方法 |
| 2.1.5 酵母感受态制备及转化 |
| 2.1.6 转录因子的自激活活性验证 |
| 2.1.7 转录因子转录激活能力实验 |
| 2.1.8 酵母双杂交互作验证 |
| 2.1.9 酵母三杂交互作验证 |
| 2.1.10 蛋白质直接互作的体外验证实验(Pull-down) |
| 2.1.11 双分子荧光互作实验(BiFc) |
| 2.1.12 原生质体的游离和转化 |
| 2.1.13 利用原生质体转化的免疫共沉淀(Co-IP)实验 |
| 2.1.14 基因的克隆和重组 |
| 2.1.15 利用基因枪轰击转化玉米愈伤组织 |
| 2.1.16 染色质免疫共沉淀 |
| 2.1.17 凝胶阻滞实验 |
| 2.1.18 酵母单杂交 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 酵母文库构建 |
| 2.2.2 ZmNF-YB16转录因子的转录激活活性分析 |
| 2.2.3 以ZmNF-YB16为诱饵蛋白的文库筛选 |
| 2.2.4 ZmNF-YB16与其互作蛋白的互作验证 |
| 2.2.5 ZmNF-YA-YB-YC酵母三杂交互作分析 |
| 2.2.6 利用Co-IP寻找ZmNF-YB16复合体的成员蛋白 |
| 2.2.7 Co-IP复合体成员互作鉴定 |
| 2.2.8 ZmNF-YA-YB-YC复合体成员表达模式分析 |
| 2.2.9 ZmNF-YA1调控的下游靶标基因分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 ZmNF-YB16与其他NF-Y家族基因形成异源三聚体 |
| 2.3.2 NF-Y异三聚体通过NF-YA亚基调控靶基因的表达 |
| 2.3.3 ZmNF-Ys复合体的多样性和复杂性 |
| 2.3.4 ZmNF-YB16-YC17-YA1复合体的形成依赖于蛋白质入核 |
| 第三章 ZmNF-YB16基因过表达对玉米基因表达的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料及培养条件 |
| 3.1.2 溶液配制 |
| 3.1.3 胁迫处理方法 |
| 3.1.4 玉米籽粒的石蜡切片 |
| 3.1.5 幼嫩雌穗的扫描电镜观察 |
| 3.1.6 生理指标测定 |
| 3.1.7 RNA的大量提取 |
| 3.1.8 基于4-thiouridine标记的初始转录分析 |
| 3.1.9 数字表达谱测序流程 |
| 3.1.10 数字表达谱测序数据分析方法 |
| 3.1.11 差异表达基因分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 不同时期的干旱胁迫对器官发育和产量的影响 |
| 3.2.2 用于转录组测序样品的质量检测和测序质量的评估 |
| 3.2.3 干旱胁迫和ZmNF- YB16基因过表达对NF-Y家族基因表达的影响 |
| 3.2.4 干旱胁迫对不同器官转录组的影响 |
| 3.2.4.1 干旱胁迫对野生型V9期雌穗基因表达的影响 |
| 3.2.4.2 干旱胁迫对野生型5DAP时期叶片基因表达的影响 |
| 3.2.4.3 干旱胁迫对野生型5DAP时籽粒基因表达的影响 |
| 3.2.4.4 干旱胁迫对ZmNF-YB16过表达系不同器官基因表达的影响 |
| 3.2.5 ZmNF-YB16基因表达水平变化对植株基因表达的影响 |
| 3.2.5.1 ZmNF-YB16过表达对三个器官基因表达的共有影响 |
| 3.2.5.2 ZmNF-YB16过表达对雌穗基因表达的影响 |
| 3.2.5.3 ZmNF-YB16过表达对叶片基因表达的影响 |
| 3.2.5.4 ZmNF-YB16过表达对籽粒基因表达的影响 |
| 3.2.6 不同胁迫对ZmNF-YB16基因过表达材料初始转录的影响 |
| 3.2.6.1 ZmNF-YB16过表达影响的初始转录本基因在染色体上的分布 |
| 3.2.6.2 ZmNF-YB16表达水平变化影响的初始转录基因功能分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 不同时期干旱胁迫严重影响产量 |
| 3.3.2 ZmNF-YB16过表达对源库器官基因表达影响的异同性 |
| 3.3.3 ZmNF-YB16过表达通过提高植株光合作用、抗氧化胁迫能力提高抗旱性 |
| 3.3.4 不同胁迫条件下ZmNF-YB16基因功能的多样性 |
| 第四章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（8）菊花CmTPL1-2调控开花的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 植物开花研究进展 |
| 1.1 植物开花路径的分子调控机制研究 |
| 2 植物TPL/TPR转录因子研究进展 |
| 2.1 TPL/TPR转录因子结构特征和作用模式 |
| 2.2 TPL/TPR转录因子参与植物信号通路 |
| 2.3 TPL/TPR转录因子参与植物开花调控的研究 |
| 2.4 TPL/TPR (N176H)主导的显性负突变 |
| 3 本研究的目的和意义 |
| 第二章 菊花CmTPL1-2基因的克隆与表达模式分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 植物材料、载体与菌株 |
| 1.2 拟南芥SL突变体开花表型观察及TPL/TPR基因的定量表达分析 |
| 1.3 GR24处理拟南芥和菊花‘神马’及TPL/TPR基因的定量分析 |
| 1.4 CmTPL1-2的基因克隆及序列分析 |
| 1.5 CmTPL1-2系统进化树构建 |
| 1.6 CmTPL1-2基因的表达模式分析 |
| 1.7 RNA原位杂交 |
| 1.8 CmTPL1-2和CmCO在菊花‘神马’48小时节律定量分析 |
| 1.9 CmTPL1-2的定点突变 |
| 1.10 CmTPL1-2和mut-CmTPL1-2的亚细胞定位 |
| 1.11 CmTPL1-2和mut-CmTPL1-2的转录激活活性分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 拟南芥SL突变体开花表型观察及TPL/TPR基因的定量表达分析 |
| 2.2 GR24处理拟南芥和菊花‘神马’的表型观察及TPL/TPR基因的定量表达分析 |
| 2.3 CmTPL1-2的基因克隆及序列分析 |
| 2.4 CmTPL1-2基因的系统进化分析 |
| 2.5 CmTPL1-2基因的表达模式分析 |
| 2.6 CmTPL1-2的RNA原位杂交 |
| 2.7 CmTPL1-2和CmCO在菊花‘神马’叶片中的节律表达变化 |
| 2.8 CmTPL1-2的定点突变 |
| 2.9 CmTPL1-2和mut-CmTPL1-2的亚细胞定位及转录激活活性分析 |
| 3 讨论 |
| 第三章 菊花CmTPL1-2的转基因功能验证 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 植物材料、载体与菌株 |
| 1.2 CmTPL1-2和mut-CmTPL1-2基因遗传转化拟南芥 |
| 1.3 CmTPL1-2和mut-CmTPL1-2转基因拟南芥株系关键开花基因的定量分析 |
| 1.4 CmTPL1-2和mut-CmTPL1-2基因遗传转化菊花‘神马’ |
| 1.5 CmTPL1-2和mut-CmTPL1-2及其自身互作关系分析 |
| 1.6 CmTPL1-2转基因株系转录组测序 |
| 1.7 CmTPL1-2关键开花调控相关基因的定量验证 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 CmTPL1-2和mut-CmTPL1-2转基因拟南芥鉴定及表型观察 |
| 2.2 CmTPL1-2和mut-CmTPL1-2转基因拟南芥关键开花基因的定量分析 |
| 2.3 CmTPL1-2和mut-CmTPL1-2转基因菊花‘神马’的鉴定及表型观察 |
| 2.4 CmTPL1-2和mut-CmTPL1-2及其自身互作关系分析 |
| 2.5 CmTPL1-2转基因菊花的转录组分析 |
| 3 讨论 |
| 第四章 菊花CmTPL1-2互作蛋白的筛选及验证 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 植物材料、载体与菌株 |
| 1.2 菊花花芽分化前期茎尖酵母文库的构建 |
| 1.3 酵母文库筛选互作蛋白 |
| 1.4 互作蛋白基因的克隆、载体构建和序列分析 |
| 1.5 互作蛋白的转录激活活性及亚细胞定位 |
| 1.6 蛋白间相互作用关系验证 |
| 1.7 CmSVP和CmJ3转基因拟南芥的鉴定及表型观察 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 菊花花芽分化前期茎尖酵母文库的构建 |
| 2.2 酵母文库筛选获得互作蛋白 |
| 2.3 互作蛋白的序列分析 |
| 2.4 互作蛋白的转录激活活性及亚细胞定位 |
| 2.5 蛋白间相互作用关系验证 |
| 2.6 CmSVP和CmJ3转基因拟南芥的鉴定及表型观察 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表论文及参与的科研项目 |
| 致谢 |
（9）水稻胚乳中造粉体发育关键基因FLO11的图位克隆和功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 水稻胚乳发育研究进展 |
| 1.1 水稻胚乳的生长发育过程 |
| 1.2 水稻胚乳发育缺陷突变体研究进展 |
| 2 造粉体发育的研究进展 |
| 2.1 质体的起源 |
| 2.2 质体的类型 |
| 2.3 造粉体的发育特征 |
| 3 质体的蛋白转运系统 |
| 3.1 Toc/Tic复合体协助蛋白转运的过程 |
| 3.2 Toc转运复合体 |
| 3.3 Tic转运复合体 |
| 3.4 叶绿体基质中的分子伴侣 |
| 3.5 蛋白转运系统的保守性 |
| 4 Heat Shock Protein 70(Hsp70)的研究进展 |
| 4.1 Hsp70的蛋白结构 |
| 4.2 Hsp70的分类 |
| 4.3 Hsp70的功能 |
| 4.4 水稻Hsp70家族成员 |
| 4.5 质体中Hsp70的功能研究 |
| 5 本研究目的和意义 |
| 第二章 水稻粉质突变体flo11的表型鉴定和基因图位克隆 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料种植 |
| 1.2 籽粒中各物质含量和淀粉的理化性质测定 |
| 1.3 发育胚乳的电镜观察 |
| 1.4 基因图位克隆 |
| 1.6 转基因互补载体构建及农杆菌转化 |
| 1.7 转基因阳性植株的鉴定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 水稻flo11突变体的表型鉴定 |
| 2.2 突变体flo11胚乳细胞中造粉体发育异常 |
| 2.3 野生型和突变体米粉的淀粉理化性质测定 |
| 2.4 FLO11的图位克隆 |
| 3 讨论 |
| 3.1 FLO11编码一个新的参与水稻胚乳发育的蛋白 |
| 3.2 FLO11可能通过影响造粉体的发育导致胚乳粉质 |
| 第三章 FLO11的功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 蛋白氨基酸序列比对和进化树分析 |
| 1.2 RNA提取方法和反转录 |
| 1.3 荧光定量 |
| 1.4 SDS-PAGE及Western blot检测 |
| 1.5 水稻原生质体分离及亚细胞定位 |
| 1.6 烟草表皮细胞BiFC分析 |
| 1.7 烟草瞬时系统进行Co-IP实验 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 FLO11的同源性分析 |
| 2.2 OsHsp70cp-2的亚细胞定位 |
| 2.3 OsHsp70cp-2的表达模式分析 |
| 2.4 OsHsp70cp-2与OsHsp70cp-1部分功能冗余 |
| 3 讨论 |
| 3.1 OsHsp70cp-2与OsHsp70cp-1具有部分的功能冗余 |
| 3.2 OsHsp70cp-2可能通过影响造粉体有效的蛋白转运导致造粉体发育异常 |
| 第四章 全文总结和创新点 |
| 1 全文总结 |
| 1.1 突变体flo11的表型是由OsHsp70cp-2的突变导致 |
| 1.2 OsHsp70cp-2是一个质体定位的蛋白 |
| 1.3 OsHsp70cp-2在发育的胚乳中具有高的表达 |
| 1.4 OsHsp70cp-1与OsHsp70cp-2具有一定的功能冗余 |
| 1.5 OsHsp70cp-2与Tic复合体的组分Tic110和Tic40结合 |
| 2 本文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间发表论文 |
| 致谢 |
（10）巴西橡胶树DnaJ蛋白对胶乳转化酶HbNIN2酶学调控的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstrat |
| 1 前言 |
| 1.1 天然橡胶的经济价值与生产现状 |
| 1.2 巴西橡胶树天然橡胶的合成 |
| 1.2.1 天然橡胶的合成部位 |
| 1.2.2 天然橡胶的生物合成途径 |
| 1.2.3 蔗糖代谢在天然橡胶生物合成中的作用 |
| 1.3 植物中碱性转化酶研究进展 |
| 1.4 DnaJ蛋白的研究进展 |
| 1.4.1 DnaJ蛋白的结构与分类 |
| 1.4.2 DnaJ蛋白的作用机制 |
| 1.4.3 DnaJ蛋白在植物抗逆中的功能研究 |
| 1.6 本研究的目的与意义 |
| 1.7 本研究的技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 用于RNA提取的植物材料来源 |
| 2.1.2 质粒及菌种 |
| 2.1.3 实验相关的酶及化学试剂 |
| 2.2 方法与步骤 |
| 2.2.1 橡胶树DnaJs基因克隆 |
| 2.2.2 HbDnaJs蛋白与HbNIN2蛋白互作再验证 |
| 2.2.3 HbDnaJs与HbNIN2基因表达模式分析 |
| 2.2.4 HbDnaJs与HbNIN2基因的原核表达 |
| 2.2.5 HbDnaJs蛋白对HbNIN2蛋白活性的影响 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 橡胶树不同组织RNA的提取及检测 |
| 3.1.1 橡胶树胶乳RNA提取检测 |
| 3.1.2 橡胶树其他组织RNA提取检测 |
| 3.2 HbDnaJs基因全长cDNA的克隆和序列分析 |
| 3.2.1 HbDnaJs基因cDNA全长序列的获得 |
| 3.2.2 HbDnaJs基因及其编码蛋白的生物信息学分析 |
| 3.3 HbDnaJs蛋白与HbNIN2蛋白酵母双杂交点对点分析 |
| 3.3.1 pGADT7-HbDnaJs猎物载体的构建 |
| 3.3.2 酵母双杂交点对点作图 |
| 3.4 HbDnaJs基因的表达分析 |
| 3.4.1 荧光定量引物的筛选 |
| 3.4.2 HbDnaJs基因在橡胶树不同组织中表达模式分析 |
| 3.4.3 乙烯利(ET)刺激对HbDnaJs基因表达的影响 |
| 3.4.4 割胶对HbDnaJs基因表达的影响 |
| 3.5 HbDnaJ与HbNIN2基因的原核表达及互作调控分析 |
| 3.5.1 pET32a-HbDnaJs与pMALc5E-HbNIN2载体构建 |
| 3.5.2 HbDnaJs蛋白的优化表达分析 |
| 3.5.3 HbDnaJs与HbNIN2蛋白共孵育的转化酶活性测定 |
| 3.5.4 HbDnaJs蛋白对HbNIN2蛋白稳定性的影响 |
| 3.5.5 HbDnaJs蛋白对HbNIN2蛋白热稳定性的影响 |
| 3.5.6 HbDnaJs对HbNIN2在金属离子胁迫下酶活的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 HbDnaJs基因的初步鉴定及分类 |
| 4.2 HbDnaJs与HbNIN2基因的表达分析比较 |
| 4.3 HbDnaJs对HbNIN2酶活性的调控作用 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 略缩词表 |
| 附录 |
| 致谢 |
四、DnaJ类分子伴侣PBP的基因克隆及亚细胞定位研究（论文参考文献）
- [1]热激蛋白在松墨天牛响应高温胁迫中的功能研究[D]. 李慧. 南京林业大学, 2021(02)
- [2]褐飞虱热激蛋白不同家族基因及其功能研究[D]. 陈璇. 浙江大学, 2021(01)
- [3]宿主细胞蛋白STAT5、NPM1和DNAJB6在PCV2复制过程中作用及机制研究[D]. 韩聪. 西北农林科技大学, 2020
- [4]马铃薯磷转运蛋白家族的鉴定及PHO1亚家族提高转基因马铃薯耐热性的研究[D]. 李万. 西北农林科技大学, 2020
- [5]高效PTG/Cas9基因编辑系统在拟南芥中的应用及分子伴侣蛋白CPN60结构与功能的研究[D]. 惠亮亮. 西北大学, 2020
- [6]玉米抗旱生理生化特性及差异表达基因分析[D]. 刘过. 河北农业大学, 2020(01)
- [7]转录因子ZmNF-YB16在玉米抗旱机制中的作用[D]. 王保梅. 山东大学, 2020(08)
- [8]菊花CmTPL1-2调控开花的分子机制研究[D]. 张子昕. 南京农业大学, 2019(08)
- [9]水稻胚乳中造粉体发育关键基因FLO11的图位克隆和功能分析[D]. 朱小品. 南京农业大学, 2019(08)
- [10]巴西橡胶树DnaJ蛋白对胶乳转化酶HbNIN2酶学调控的研究[D]. 王佳. 海南大学, 2019(06)