一、大肠癌及癌旁粘膜p21~(ras)表达及意义（论文文献综述）
吴景景[1]（2021）在《口腔鳞状细胞癌LncRNA HCG11的表达及作用机制研究》文中提出口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma,OSCC）是全世界范围内最常见的口腔癌,目前采用以手术为主结合放射治疗、化学治疗等疗法进行治疗,虽然已取得一些成绩,但是OSCC晚期患者的预后仍不太理想,倘若能够早期发现,则能大大改善患者的远期预后,因此深入研究OSCC发病的分子机制、寻找新的高效的生物标记物是目前急需解决的问题。近年来,研究显示长链非编码RNA（long non-coding RNA,LncRNA）在肿瘤的发生、发展以及转移过程中起重要作用。LncRNA长度一般超过200个核苷酸,不编码蛋白,可以作为一种竞争性内源性RNA（ce RNA）吸附miRNA,从而参与靶基因的表达调控。研究已发现,长链非编码RNA HLA复合体11（LncRNA HCG11）影响并参与多种肿瘤细胞的增殖、浸润和转移等生物学行为,其在口腔中的表达水平及作用机制尚不明确,需要进一步研究。本研究以人口腔鳞状细胞癌组织、口腔鳞癌细胞株以及通过构建裸鼠皮下移植瘤为研究对象,分别应用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、蛋白印迹实验（Western Blot）、MTT、流式细胞术、免疫荧光技术、双荧光素酶实验、免疫组织化学、裸鼠皮下移植瘤等实验方法,首先分析了口腔鳞状细胞癌癌组织及癌旁正常组织中LncRNA HCG11和蛋白酪氨酸磷酸酶受体S（PTPRS）的表达差异,然后通过体外实验研究抑制或过表达LncRNA HCG11对三种口腔鳞癌细胞株（TSCCA、CAL-27和Fa Du）增殖的影响,并且应用双荧光素酶实验研究了LncRNA HCG11影响口腔鳞癌细胞株增殖能力的潜在机制,并探讨LncRNA HCG11/miR-455-5p分子轴是否能够通过靶向调控PTPRS参与OSCC的发展,最后成功转染稳定抑制LncRNA HCG11的TSCCA细胞株,构建裸鼠皮下移植瘤,观察其在体内对移植瘤生长的影响。通过探讨LncRNA HCG11在口腔鳞状细胞癌增殖中的作用,有助于揭示OSCC的发病机制,同时也为寻找OSCC新的生物标记物奠定基础。第一部分口腔鳞状细胞癌LncRNA HCG11和PTPRS的表达水平研究目的:口腔鳞状细胞癌是口腔恶性肿瘤,其侵袭性强,预后差,生存率低。研究表明LncRNA HCG11和PTPRS在肿瘤的发展和调控中起重要作用。本研究收集口腔鳞状细胞癌患者的癌组织和癌旁正常组织,分别检测LncRNA HCG11和PTPRS的表达水平,分析它们与口腔鳞状细胞癌的关系。方法:1.使用qRT-PCR方法检测癌组织和癌旁正常组织中LncRNA HCG11和PTPRS mRNA的表达水平。2.通过Western Blot检测癌组织和癌旁正常组织中PTPRS蛋白的表达水平。结果:1.qRT-PCR检测癌组织及癌旁正常组织LncRNA HCG11的表达水平癌旁正常组织和癌组织LncRNA HCG11的表达水平分别为0.034±0.008和0.019±0.005。经统计分析,与癌旁组织相比,癌组织中LncRNA HCG11的表达水平显着降低,差异具有统计学意义（P<0.01）。2.qRT-PCR检测癌组织及癌旁正常组织PTPRS mRNA的表达水平PTPRS mRNA在口腔癌旁正常组织及癌组织中的表达水平分别为0.100±0.008和0.022±0.002,PTPRS mRNA在癌组织中的表达水平显着下调,有统计学意义（P<0.01）。3.Western Blot检测癌组织及癌旁正常组织PTPRS蛋白的表达PTPRS蛋白在癌旁正常组织和癌组织中的相对表达水平分别为0.974±0.096和0.631±0.153,PTPRS蛋白在癌组织中表达明显降低,差异具有显着性（P<0.01）。小结:1.LncRNA HCG11在癌组织中表达显着低于癌旁正常组织。2.PTPRS mRNA及蛋白在癌组织中表达显着低于癌旁正常组织。3.LncRNA HCG11和PTPRS有可能成为新的生物标记物去诊断口腔鳞状细胞癌。第二部分LncRNA HCG11/miR-455-5P分子轴调控PTPRS对口腔鳞癌细胞株增殖的机制研究目的:体外实验通过建立多个共转染系统探讨LncRNA HCG11对OSCC细胞的调控作用,验证miR-455-5p与LncRNA HCG11和PTPRS的靶向结合关系。探讨LncRNA HCG11/miR-455-5p/PTPRS分子轴对于口腔鳞癌细胞增殖的影响以及作用机制。方法:1.qRT-PCR检测TSCCA细胞、CAL-27细胞和Fa Du细胞3种口腔鳞癌细胞株中LncRNA HCG11的表达水平。选择表达量高的两株细胞进行抑制LncRNA HCG11的表达实验,选择表达量低的细胞进行过表达LncRNA HCG11实验。2.抑制或过表达LncRNA HCG11后,通过MTT、qRT-PCR、Western Blot、流式细胞术、免疫荧光检测观察LncRNA HCG11对口腔鳞癌细胞株增殖的影响。3.在TSCCA、CAL-27两株细胞中抑制LncRNA HCG11的表达,qRT-PCR检测miR-455-5p的表达水平;RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）实验检测TSCCA细胞中LncRNA HCG11和miR-455-5p的富集情况;双荧光素酶实验验证两者的结合关系。4.分析LncRNA HCG11是否通过miR-455-5p影响口腔鳞癌细胞的增殖。在TSCCA和CAL-27两株细胞中,对miR-455-5p进行功能挽救实验,观察miR-455-5p抑制剂对LncRNA HCG11干扰介导的细胞增殖的逆转情况。5.分析miR-455-5p对口腔鳞癌细胞株增殖的影响及其对PTPRS的调控作用。qRT-PCR检测TSCCA、CAL-27和Fa Du 3株口腔鳞癌细胞中miR-455-5p的表达水平。在口腔鳞癌细胞株中转染miR-455-5p inhibitor或miR-455-5p mimics后,通过MTT、qRT-PCR、Western Blot技术观察miR-455-5p对口腔鳞癌细胞株增殖、PTPRS mRNA及蛋白表达水平的影响。双荧光素酶实验验证两者的靶向结合关系。6.分析miR-455-5p是否通过PTPRS下游信号通路即表皮生长因子受体/磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B（EGFR/PI3K/AKT）影响口腔鳞癌细胞株的增殖。对PTPRS进行功能挽救实验,观察抑制PTPRS对miR-455-5p抑制剂介导的细胞增殖能力的逆转情况,并观察对PTPRS及下游信号通路中相关蛋白的水平变化影响。7.分析LncRNA HCG11/miR-455-5p分子轴对于PTPRS下游信号通路EGFR/PI3K/AKT的影响。在TSCCA和CAL-27两株细胞中共转染HCG11si RNA和miR-455-5p inhibitor,qRT-PCR检测转染后细胞中PTPRS mRNA的表达水平;Western Blot检测细胞中PTPRS及及下游信号通路中相关蛋白的水平变化。结果:1.LncRNA HCG11在三种细胞株中的表达水平LncRNA HCG11在TSCCA表达水平最高（1.30±0.13）,其次是CAL-27细胞（1.00±0.00）,在Fa Du细胞中的表达水平最低,相对表达水平为0.74±0.08。因此选择TSCCA、CAL-27两种细胞株进行抑制HCG11表达实验,选择Fa Du细胞进行过表达HCG11实验。2.LncRNA HCG11参与调控OSCC细胞株的增殖成功构建能有效抑制HCG11表达的TSCCA、CAL-27细胞株以及有效高表达HCG113000-5000的Fa Du细胞,抑制细胞株中LncRNA HCG11的表达,显着增强细胞增的殖能力;过表达LncRNA HCG11,显着降低细胞的增殖能力（P<0.05）。3.调控HCG11对于miR-455-5p表达水平的影响以及它们的靶向结合验证抑制TSCCA和CAL-27的LncRNA HCG11表达后,miR-455-5p的表达水平显着升高（P<0.01）,RIP实验表明LncRNA HCG11和miR-455-5p处于高度富集状态;双荧光素酶实验表明两者存在靶向结合关系。4.LncRNA HCG11通过miR-455-5p影响OSCC的增殖miR-455-5p的表达水平受LncRNA HCG11的负向调控,miR-455-5p抑制剂可以部分逆转LncRNA HCG11抑制引起的细胞活力增强、Ki67增加、cyclin D1和E2F1水平升高、p21水平下降这些情况。5.miR-455-5p对口腔鳞癌细胞增殖的影响及其对PTPRS的调控作用研究miR-455-5p inhibitor能够明显提高Fa Du和CAL-27细胞中PTPRS mRNA及蛋白的表达水平,且显着降低细胞活力;在TSCCA细胞中转染miR-455-5p mimics可以明显降低PTPRS mRNA及蛋白的表达水平,且显着增强细胞活力。双荧光素酶实验表明两者存在靶向结合关系。6.miR-455-5p通过PTPRS下游信号通路即表皮生长因子受体/磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B（EGFR/PI3K/AKT）影响OSCC细胞增殖抑制miR-455-5p的表达可以显着增加Fa Du和CAL-27细胞株PTPRS的表达水平、降低细胞增殖能力、降低p-EGFR和p-Akt表达水平,但同时抑制PTPRS后可以部分逆转miR-455-5p抑制引起的上述细胞活动。7.HCG11/miR-455-5p轴对PTPRS及其下游信号通路的调控作用LncRNA HCG11 si RNA转染后,TSCCA、CAL-27细胞株PTPRS表达水平显着降低,然而在抑制HCG11的同时抑制miR-455-5p的表达又可明显提高PTPRS的表达水平（P<0.05）。EGFR/PI3K/AKT通路相关蛋白的表达结果显示,与NC si RNA转染的细胞组相比,抑制HCG11表达组细胞中p-EGFR和p-Akt的表达水平更高,EGFR和Akt无明显变化;而同时抑制miR-455-5p和HCG11的表达水平时,p-EGFR和p-Akt的表达水平又显着降低（P<0.05）。小结:1.LncRNA HCG11参与调控OSCC细胞株的增殖,抑制LncRNA HCG11的表达显着增强细胞的增殖能力;过表达LncRNA HCG11显着降低细胞的增殖能力。2.LncRNA HCG11和miR-455-5p存在结合关系,miR-455-5p表达受LncRNA HCG11的负向调控。3.PTPRS和miR-455-5p存在靶向结合关系,PTPRS的表达受miR-455-5p的负向调控。4.PTPRS的表达受LncRNA HCG11的正向调控,LncRNA HCG11在口腔鳞状细胞癌中低表达,可作为抑癌基因,抑癌机制可能为:LncRNA HCG11吸附miR-455-5p,使下游靶基因PTPRS的表达增加,阻断下游信号通路EGFR/PI3K/AKT的激活,发挥抑癌作用。第三部分LncRNA HCG11对口腔鳞状细胞癌裸鼠移植瘤影响的研究目的:通过体内实验进一步验证LncRNA HCG11对于口腔鳞癌细胞株裸鼠荷瘤的影响。方法:1.通过脂质体2000将携带有HCG11 sh RNA或NC-sh RNA序列的p RNAH1.1载体转染到TSCCA细胞中。经过筛选获得抑制HCG11表达的稳转细胞株。2.将转染好HCG11 sh RNA（或NC sh RNA）的TSCCA细胞（1×107）注射到裸鼠右侧腋窝皮下,实验分为TSCCA组、NC sh RNA组、HCG11sh RNA 3组。当肿瘤开始形成时,每4天测量一次肿瘤大小。27天时处死小鼠,收集肿瘤并对肿瘤组织称重。3.qRT-PCR检测各组肿瘤组织中LncRNA HCG11、miR-455-5p和PTPRS mRNA的表达水平。4.Western Blot检测各组肿瘤组织中cyclin D1、E2F1、p21、PTPRS、p-EGFR、EGFR、p-AKT和AKT蛋白的表达水平。5.免疫组织化学检测各组肿瘤组织中Ki67蛋白的表达情况。结果:1.抑制HCG11表达后促进裸鼠肿瘤生长与NC sh RNA组相比,抑制HCG11表达组的裸鼠肿瘤生长更快、肿瘤重量也更大（P<0.01）。2.HCG11、PTPRS和miR-455-5p在裸鼠移植瘤中的表达情况与NC sh RNA组相比,抑制HCG11表达组中LncRNA HCG11和PTPRS的表达水平都明显降低,而miR-455-5p在抑制HCG11表达组的肿瘤组织中表现出较高的表达（P<0.01）。3.增殖相关蛋白以及信号通路相关蛋白在裸鼠移植瘤中的表达情况Western Blot结果显示,与对照组相比,抑制HCG11表达组肿瘤组织中p21明显减少,cyclin D1和E2F1表达增加。同时抑制HCG11表达组肿瘤组织中PTPRS水平降低,p-EGFR和p-Akt的表达反而增强。4.Ki67蛋白在裸鼠移植瘤中的表达情况免疫组化结果表明,在抑制HCG11表达组的肿瘤组织中Ki67阳性表达率显着增加。小结:1.成功构建能够稳定抑制LncRNA HCG11的TSCCA细胞株,并成功构建裸鼠皮下移植瘤模型。2.抑制LncRNA HCG11后可使裸鼠皮下移植瘤生长加快,重量加重。3.抑制LncRNA HCG11后,移植瘤中Ki67阳性表达显着增加,提示口腔鳞癌细胞增殖活性增强。4.抑制LncRNA HCG11后,移植瘤中HCG11和PTPRS表达水平降低,而miR-455-5p表现出较高的表达,其下游信号通路中p-EGFR和p-Akt的表达反而增强。说明LncRNA HCG11/miR-455-5p分子轴靶向调控PTPRS影响口腔鳞癌的进展。结论:1.LncRNA HCG11及PTPRS在癌组织中表达显着低于癌旁正常组织。2.LncRNA HCG11参与调控OSCC细胞株的增殖,抑制LncRNA HCG11的表达显着增强细胞的增殖能力;过表达LncRNA HCG11显着降低细胞的增殖能力。3.miR-455-5p分别与LncRNA HCG11和PTPRS存在靶向结合关系,miR-455-5p表达受LncRNA HCG11的负向调控,PTPRS的表达受miR-455-5p的负向调控。4.LncRNA HCG11在口腔鳞状细胞癌中低表达,可作为抑癌基因,抑癌机制可能为:LncRNA HCG11吸附miR-455-5p,使下游靶基因PTPRS的表达增加,阻断下游信号通路EGFR/PI3K/AKT的激活,发挥抑癌作用。5.抑制LncRNA HCG11后能显着加快人口腔鳞癌细胞株裸鼠皮下移植瘤的生长。
郝书弘[2]（2020）在《结直肠癌患者KRAS、NRAS、BRAF基因突变与关键基因表达的相关性及circGLG1/miR-622/KRAS轴的分子作用机制》文中指出背景:结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一。在我国CRC的发病率呈逐渐上升趋势。结直肠癌的病因和发病机制十分复杂,涉及基因组、转录组、蛋白质组学及表观遗传学等多种因素的异常改变。利用现代分子生物学技术,对结直肠癌分子发病机制的更深入研究,对本病的早期诊断及个体化治疗至关重要。作为表皮生长因子受体（epidermal growth fatctor receptor,EGFR）信号通路的关键分子,KRAS、NRAS和BRAF基因突变已被证实在结直肠癌的发生、发展过程中起到重要作用,且对结直肠癌患者的靶向治疗具有重要的指导价值。然而,目前研究大多集中在KRAS、NRAS和BRAF的突变频率及其预后价值上,但对于这些基因突变与患者临床病理学特征及其他基因表达的关系仍缺乏了解。因此,分析上述基因突变和结直肠癌患者临床病理学参数及其他基因表达的内在联系对于更加精准的指导个体化治疗具有重要意义。环状RNA（circular RNA,circRNA）是新发现的一类共价闭合环状非编码RNA。CircRNA以其闭合成环,高度稳定,特异性强,易于检测等特点,逐渐成为恶性肿瘤领域的研究热点,且有望成为肿瘤诊断和评估预后最有潜力的分子标记物。KRAS基因作为结直肠癌中最关键的驱动基因,除了基因突变外KRAS基因是否通过其它方式参与结直肠癌的发生发展,在结直肠癌中,KRAS基因的表达水平如何,其表达还受到哪些非编码RNA,尤其是circRNA的分子调控,目前尚无相关报道。目的:本研究拟通过扩增阻碍突变系统PCR（amplification-refractory mutation system polymerase chain reaction,ARMS-PCR）的方法检测结直肠癌组织中KRAS、NRAS和BRAF的常见突变位点,同时,采用免疫组化的方法检测8个结直肠癌关键基因在蛋白水平的表达情况。通过多种统计学方法,探讨KRAS、NRAS和BRAF基因突变与结直肠癌患者临床病理学特征及关键基因表达的内在联系,旨在为更精准的指导结直肠癌的靶向治疗提供依据。此外,本研究在KRAS、NRAS、BRAF突变的基础之上,选取重要靶点,以KRAS表达调控为切入点,利用生物信息分析的方法筛选出结直肠癌发病过程中的关键circRNA/miRNA/KRAS调控轴,并在分子水平、蛋白水平、细胞功能水平对其进行验证。旨在转录后调控层面进一步完善KRAS基因在结直肠癌中的作用及机制,为结直肠癌患者的诊断、治疗提供新的生物标志物和分子靶点。方法:1.收集我院手术切除CRC组织216例。通过ARMS-PCR方法检测216例CRC组织中KRAS、NRAS和BRAF的常见突变位点。通过χ2检验、Mann-Whitney秩和检验、独立样本t检验等统计学方法分析上述基因突变与患者性别、年龄、肿瘤部位、TNM分期、浸润深度、有无淋巴结转移、病理类型、分化程度等临床指标的相关性。2.采用免疫组化的方法检测了P53、EGFR、CDX2、PMS2、MLH1、MSH6、MSH2和Ki67等8个CRC关键基因在蛋白水平的表达情况。通过χ2检验、Mann-Whitney秩和检验、多重对应分析探讨了上述基因表达与KRAS、NRAS和BRAF突变的相关性。3.收集我院手术切除的CRC组织及癌旁组织40对。通过实时定量聚合酶链反应（quantitative real-time-polymerase chain reaction,qRT-PCR）方法检测40对肿瘤组织及癌旁组织KRAS表达水平。利用生物信息分析的方法筛选出结直肠癌增殖及侵袭相关的circRNA分子及KRAS基因潜在的上游调控miRNA分子,建立可能的circRNA/miRNA/KRAS调控轴。在40对CRC临床样本中检测上述调控轴中circRNA（circGLG1）及miRNA（miR-622）的表达水平,利用Pearson线性相关法分析其表达与KRAS表达的相关性。4.检测3株结肠癌细胞系（HCT8、HCT116、DLD1）和正常人肠上皮细胞系（NCM460）中circGLG1的表达水平。根据circGLG1序列设计siRNA及其对照,利用Lipofectamine 2000进行细胞转染。在DLD1细胞系中敲低circGLG1后:1)采用CCK-8、克隆形成实验检测细胞增殖活性;2)采用Transwell、划痕愈合实验检测细胞侵袭及迁移能力;3)检测miR-622表达变化,在mRNA水平和蛋白水平检测KRAS表达变化。在成功敲低circGLG1的基础上共转染miR-622 inhibitor,观察细胞增殖、侵袭、迁移能力及KRAS表达变化是否可以回复。5.根据circGLG1及KRAS序列与miR-622互补配对的区域,设计合成野生型及突变型双荧光素酶报告载体质粒,通过双荧光素酶报告实验进一步验证circGLG1与miR-622,miR-622与KRAS的靶向结合作用。结果:1.CRC患者中KRAS基因突变率为39.8%,其突变位点按概率高低依次为G12D（16.2%）、G12V（8.8%）、G13D（8.3%）、G12S（1.9%）、G12C（1.9%）、G12A（1.4%）、G12R（0.9%）、双位点突变（G12D+G12S）（0.5%）。NRAS的突变率为2.7%,其突变位点为G12D、G13D、Q61R各0.9%。BRAF V600E的突变率为1.4%。KRAS突变与性别有关,女性突变率高于男性（53.3%vs 32.6%,P=0.003）。NRAS、BRAF突变与性别无关。KRAS、NRAS、BRAF突变与患者年龄、TNM分期、浸润深度、有无淋巴结转移、组织病理类型、腺癌分化程度等均无显着相关性。2.免疫组化与KRAS、NRAS、BRAF基因突变结果分析显示,EGFR表达与NRAS突变有关,EGFR阳性表达者突变率高于弱阳性表达者及阴性表达者（5.3%vs 1.4%vs 0%,P=0.047）。PMS2、MLH1、MSH2表达与BRAF突变有关,PMS2阴性表达者BRAF突变率高于弱阳性表达者及阳性表达者（16.7%vs 0%vs 1%,P=0.010）。MLH1阴性表达者BRAF突变率高于弱阳性表达者及阳性表达者（16.7%vs 7.7%vs 0.5%,P=0.001）。MSH2阴性表达者BRAF突变率高于弱阳性表达者及阳性表达者（33.3%vs 0%vs 1.0%,P=0.005）。3.在40对CRC组织及癌旁组织中检测KRAS表达,结果显示,与癌旁组织相比,KRAS在CRC组织中的表达水平显着升高（P<0.001）。通过生物信息学分析的方法建立假设:circGLG1可能通过circGLG1/miR-622/KRAS轴调节结直肠癌增殖及侵袭。为了进一步验证上述假设,我们通过临床样本PCR发现,与癌旁组织相比,circGLG1在CRC组织中的表达明显上调（P<0.01）且与KRAS表达水平呈正相关（R2=0.586,P<0.001）。同时miR-622在CRC组织中的表达明显下调（P<0.01）且与KRAS表达水平呈负相关（R2=-0.339,P<0.05）。4.CircGLG1在肠癌细胞中的表达高于正常肠上皮细胞,其中DLD1细胞中circGLG1表达量最高（P<0.001）。成功设计了2条circGLG1 siRNA。在DLD1细胞系中敲低circGLG1后:1)CCK-8、克隆形成实验证实DLD1细胞增殖受到抑制;2)Transwell、划痕愈合实验证实DLD1细胞侵袭及迁移受到抑制;3)miR-622表达升高,KRAS在mRNA水平和蛋白水平表达均降低。在成功敲低circGLG1的基础上通过共转染miR-622 inhibitor下调DLD1细胞中miR-622表达后,circGLG1不能发挥其对细胞增殖、侵袭的调节作用。且miR-622 inhibitor可回复circGLG1对KRAS表达的调控作用。5.双荧光素酶报告实验结果显示,同时加入野生型重组质粒pEZX-MT06-Wt-circGLG1或pEZX-MT06-Wt-KRAS和miR-622 mimic后,DLD1细胞的荧光素酶活性显着减低,而突变型重组质粒与miR-622 mimic共转染时,荧光素酶活性无明显差异,这充分证明了miR-622与circGLG1和KRAS之间的可结合性。综上,本研究全面检测了216例结直肠癌患者中KRAS、NRAS、BRAF的突变分布并分析了其与患者临床病理参数及关键基因表达的相关性,首次发现EGFR表达与NRAS突变有关,证实了PMS2、MLH1、MSH2等错配修复基因表达缺失与BRAF突变有关。此外,我们证实了KRAS基因在结直肠癌及癌旁组织种存在差异表达,其非编码RNA调节机制之一为circGLG1可以通过circGLG1/miR-622/KRAS轴促进结直肠癌细胞的增殖及侵袭。我们的研究为进一步阐明结直肠癌分子机制提供了理论和实验依据,同时为结直肠癌的诊断及治疗提供了新的生物标志物及关键分子靶点。
周俊[3]（2020）在《超保守RNA uc.454抑制肺癌细胞侵袭转移的机制研究》文中认为目的本文通过研究超保守uc.454在肺癌组织及肺癌细胞株中的表达及与临床病理意义以及uc.454的表达对肺癌细胞侵袭迁移的影响,并探讨uc.454对下游靶分子K-RAS调控机制以及其抑制肺癌细胞侵袭迁移的信号通路的研究,旨在为非小细胞肺癌的临床治疗提供实验基础。方法1、应用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法检测非小细胞肺癌细胞系中uc.454的表达,qRT-PCR方法和RNA原位分子杂交方法检测130例NSCLC术后组织标本和90例癌旁正常肺组织中uc.454的表达水平,分析uc.454的表达水平与临床病理参数及预后之间的病理关系。2、建立uc.454过表达/沉默稳定表达的肺癌稳定细胞株,然后在细胞水平上通过划痕实验和Transwell实验来观察uc.454对肺癌细胞侵袭迁移能力的影响。3、通过生物信息学分析K-RAS是uc.454靶基因之一,并证实K-RAS的转录后区域具有uc.454的结合位点。应用uc.454过表达/沉默稳定表达的肺癌细胞株（A549、NCI-H520）,通过qRT-PCR和Western Blotting实验检测K-RAS的m RNA和蛋白表达水平的变化,从而了解uc.454能否能直接或间接抑制K-RAS的表达。建立K-RAS转录后区域的野生型和突变型质粒,应用双荧光素酶报告系统,检测uc.454是否通过结合K-RAS的3’UTR抑制K-RAS的蛋白表达。在rescue实验反复验证中,首先使用敲低K-RAS的表达的肺癌细胞,观察对P65/MMP9的信号通路的影响,其次使用uc.454过表达和K-RAS过表达的肺癌细胞株,观察uc.454对P65/MMP9的信号通路的影响。4、查阅文献了解K-RAS调控肺癌细胞侵袭转移的信号通路。应用Western Blotting实验检测uc.454过表达/沉默后的K-RAS相关信号通路关键分子P65蛋白和MMP9蛋白的表达变化,在蛋白质水平上验证uc.454是否对K-RAS、P65、MMP9有抑制作用。通过qRT-PCR实验检测uc.454过表达/沉默后能否影响K-RAS、P65、MMP9的表达变化,从而在RNA水平上验证uc.454对K-RAS、P65、MMP9能否有抑制作用。5.在体内实验中,将uc.454过表达的肺癌细胞,过继输入给裸鼠荷瘤（皮下注射,尾静脉注射）,观察对荷瘤裸鼠的肿瘤大小（体积）、重量及肺部的转移情况;同时进行移植瘤HE染色和免疫组化实验在蛋白质水平上验证uc.454能否对K-RAS、P65、MMP9有抑制作用。结果1、qRT-PCR结果显示:非小细胞肺癌细胞系中uc.454的表达明显下调;非小细胞肺癌组织中uc.454的表达明显低于癌旁正常组织,差异均具有显着统计学意义（P<0.01）。uc.454 RNA水平与NSLCL患者吸烟情况、年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤病理分级均无关（P值分别>0.05）,与肿瘤TNM分期、淋巴结转移、浸润深度均有关（P值分别<0.05）。2、划痕实验结果表明过表达uc.454后,肺癌细胞划痕间伤口愈合距离百分比明显低于对照组;而抑制uc.454后,细胞划痕间伤口愈合距离百分比明显高于对照组,差异均具有统计学意义（P<0.05）。Transwell实验证明过表达uc.454转染组穿膜迁移的细胞数量明显低于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。反之,敲低uc.454转染组穿膜迁移的细胞数量明显高于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。3、通过生物信息学分析uc.454基因序列中含有K-RAS 3’非翻译区（3’Untranslated region,3’UTR）的结合位点。双荧光素酶报告基因分析确认在K-RAS 3’UTR野生型转染组,uc.454高表达可明显抑制相应的荧光活性,而在突变组uc.454未有这种抑制作用。因此uc.454与K-RAS是直接结合,并具有特异性。本研究结合生物信息学分析证实uc.454和K-RAS有直接关联,双荧光素酶报告基因分析确认在非小细胞肺癌中,K-RAS是uc.454直接调控的靶点之一。在rescue实验反复验证中,当敲除uc.454和K-RAS以及过表达uc.454和K-RAS后下游基因P65、MMP9的表达无明显变化。当过表达uc.454后,K-RAS及下游基因P65、MMP9的表达明显下调,当敲低uc.454表达后K-RAS及下游基因后P65、MMP9的表达明显上调。4、在裸鼠的体内实验中,uc.454过表达组肺部转移瘤的数目明显少于对照组。皮下荷瘤实验中,uc.454过表达组肿瘤生长的体积和重量变化不大,HE光镜下显示肿瘤生长稀疏,坏死明显,病理性核分裂像较少。qRT-PCR法显示uc.454过表达后K-RAS、P65、MMP9表达下降,而uc.454敲低表达后K-RAS、P65、MMP9表达升高,证实在RNA水平上uc.454对K-RAS、P65、MMP9的抑制作用。免疫组化实验检测uc.454过表达后,K-RAS蛋白、P65蛋白、MMP9蛋白的表达下调,表明在蛋白质水平上uc.454对K-RAS、P65、MMP9有抑制性调控作用。结论1、uc.454在肺癌组织和肺癌细胞系中低表达,与肿瘤TNM分期、淋巴结转移、浸润深度有关,uc.454显着低表达组的预后明显差于相对高表达组;2、uc.454能抑制肺癌细胞的迁移、侵袭能力;3、在肺癌细胞中uc.454直接结合K-RAS 3’UTR,抑制K-RAS的表达;4、uc.454下调K-RAS表达,抑制P65/MMP9信号通路,从而抑制肺癌细胞的侵袭转移。
钱飞[4]（2018）在《HMGB1-RAGE炎症信号通路促进直肠癌进展机制研究》文中研究指明目的:近年来,越来越多的证据显示,HMGB-1、RAGE不仅与炎症性疾病有关,也和多种肿瘤的发病关系密切。多项研究表明,它们在许多肿瘤组织中的表达明显升高,可以增强肿瘤的侵袭力,而且可能和包括K-RAS通路在内的多条肿瘤信号通路有关,但是它们在直肠癌中的作用及具体机制尚未明确。故本研究将在直肠癌细胞和直肠癌组织中,对HMGB-1、RAGE的表达变化以及HMGB-1、RAGE在肿瘤进展过程中发挥的作用和机制进行研究,为寻找直肠癌的治疗靶点提供科学依据。方法:1.体外培养HCT116和SW480直肠癌细胞,先后添加HMGB-1及RAS抑制剂反式法尼基硫代水杨酸（FTS）,然后分别应用CCK-8法检测直肠癌细胞的增殖情况。2.体外培养HCT116直肠癌细胞,观察组添加HMGB-1进行处理,提取细胞蛋白,以K-RAS抗体进行免疫共沉淀,然后免疫共沉淀洗脱,最后加入RAGE、K-RAS抗体,并分别以二抗标志,行Western blot蛋白定量检测,分析RAGE蛋白和K-RAS蛋白的表达情况、相互作用及变化。3.体外培养HCT116直肠癌细胞,观察组添加HMGB-1进行处理,然后加入RAGE、K-RAS抗体,并分别以二抗标志,再行免疫荧光双标检测分析RAGE蛋白和K-RAS蛋白的表达情况、相互作用及变化。4.体外培养HCT116和SW480直肠癌细胞并分成6组,A组:HCT116细胞;B组:HCT116 细胞+HMGB1（100ng/ml）处理组;C 组:HCT116 细胞+HMGB1（100ng/ml）+RAS抑制剂处理组;D组:SW480细胞;E组:SW480细胞+HMGB1（100ng/ml）处理组;F 组:SW480 细胞+HMGB1（100ng/ml）+RAS 抑制剂处理组;应用RT-PCR方法检测各组细胞中目的基因YAP1的表达情况。5.在 HCT116 细胞、HCT116+HMGB1 处理组细胞,HCT116+HMGB1+RAS 抑制剂处理组细胞中,应用Western blot方法,检测目的蛋白YAP1的表达水平。6.选取南通大学附属医院手术切除的直肠癌及癌旁新鲜标本共8对,所有患者术前均未接受化疗、放疗且无其它炎性、肿瘤性疾病。应用Western blot免疫印迹法检测其中RAGE蛋白和YAP1蛋白的表达情况。7.选取南通大学附属医院手术切除后制成石蜡切片的直肠癌标本共66例,所有患者术前均未接受化疗、放疗且无其它炎性、肿瘤性疾病。应用免疫组化法检测其中RAGE蛋白和YAP1蛋白的表达情况,免疫组化结果以双盲法进行评判,检测结果让2位高年资的病理医师分别进行研读。并用统计学方法分析检测结果和临床病理指标之间的关系。8.选取直肠癌组织,提取组织蛋白,以K-RAS抗体进行免疫共沉淀,然后免疫共沉淀洗脱,最后加入RAGE、K-RAS抗体,并分别以二抗标志,行Western blot蛋白定量检测,分析RAGE蛋白和K-RAS蛋白的表达情况及相互作用。结果:1.HMGB1可显着增强HCT116和SW480直肠癌细胞的增殖,而RAS抑制剂FTS联合治疗后可减弱HMGB1介导的直肠癌细胞增殖。2.用K-RAS抗体在分组后的直肠癌细胞中分别进行免疫共沉淀检测,实验结果显示:A组（HCT116细胞组）和B组（HCT116细胞+HMGB1组）中RAGE蛋白与K-RAS蛋白存在相互关联、相互作用,并且B组中作用相比于A组中作用更明显。3.免疫荧光双标检测结果显示:A组（HCT116细胞组）和B组（HCT116细胞+HMGB1组）中RAGE蛋白与K-RAS蛋白部分共定位,相比于A组,加入HMGB1处理后的B组,K-RAS蛋白和RAGE蛋白的表达均显着增加。4.在HCT166细胞和SW480细胞中,RT-PCR检测结果显示:加入HMGB1处理后,目的基因YAP1的表达水平均显着增加,当在此基础上加入RAS抑制剂FTS后,目的基因表达水平显着降低,但是仍高于各自的对照细胞组。5.在HCT166细胞中,Western blot检测结果显示:加入HMGB1处理后,目的蛋白YAP1的表达水平显着增加,当在此基础上加入RAS抑制剂FTS后,目的蛋白的表达水平显着降低,但是仍高于原来的对照细胞组。6.直肠癌组织和癌旁组织的Western blot检测结果显示:RAGE和YAP1两种蛋白在癌组织中的表达均高于在各自样本癌旁组织中的表达。7.免疫组化显示直肠癌标本中的RAGE蛋白和YAP1蛋白均为高表达。RAGE的高表达与晚期组织学分级、淋巴结转移和TNM分期有关（P≤0.007）,YAP1的高表达亦与晚期组织学分级、淋巴结转移和TNM分期有关（P≤0.035）。8.在直肠癌组织中用K-RAS的抗体进行免疫共沉淀检测,实验结果显示:直肠癌组织中RAGE蛋白与K-RAS蛋白均为高表达,且两种蛋白之间存在相互关联、相互作用。结论:1.HMGB1-RAGE信号可以促进直肠癌细胞的增殖,在直肠癌的进展过程中,RAGE、K-RAS存在相互作用,添加RAS抑制剂可减弱HMGB1-RAGE信号介导的直肠癌细胞增殖。2.直肠癌细胞中,HMGB1可以增强YAP1的表达,当在此基础上加入RAS抑制剂后,YAP1的表达水平显着降低;RAGE、YAP1在直肠癌组织中高表达,且均与肿瘤的侵袭力有关。3.由于慢性炎症上调HMGB1-RAGE的表达,促进RAGE的活化并募集K-RAS,激活RAS下游的YAP1蛋白,进而促进直肠癌的进展。
刘甜[5]（2017）在《PARP6和Survivin在大肠癌中的表达及意义》文中研究说明背景和目的:Survivin是细胞凋亡抑制基因IAP家族中的一员,在多种肿瘤细胞中显示高表达与肿瘤的发生发展密切相关。我们前期在大肠癌细胞中用MALDI/TOF/MS分析法筛选出与Survivin相结合的新蛋白多聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶-6（PARP6）。目前关于PARP6在肿瘤中的机能和作用以及与Survivin的关系并不明确。本研究首先探讨PARP6在人大肠癌组织中的表达情况,研究PARP6与大肠癌临床病理特征之间的关系。并且同时分析PARP6与Survivin在大肠癌中表达的相关性。其次探讨PARP6在大肠癌中表达的意义,以探究PARP6在大肠癌发生发展、侵袭、转移中的作用,为大肠癌的诊断、预后判断提供依据,为其治疗提供新的分子治疗靶点。方法:收集大肠癌组织238例及癌旁正常大肠组织20例,大肠癌冰冻组织4例,癌旁正常大肠冰冻组织4例。采用免疫组织化学方法在蛋白水平上检测PARP6和Survivin两者在大肠癌及正常大肠粘膜组织中的表达。采用Western blot方法在蛋白水平上检测PARP6和Survivin在大肠癌细胞株、大肠癌冰冻组织及癌旁正常大肠冰冻组织中的表达情况。利用脂质体法使质粒PARP6和ΔC PARP6转染大肠癌细胞SW480,对转染后的SW480细胞进行Western blot法和MTT法检测,探究PARP6与周期相关蛋白p21、p27及凋亡相关基因Bcl-2、Bcl-XL之间的关系,同时检测PARP6对大肠癌细胞存活率的影响。利用统计学方法对以上的实验结果进行分析,PARP6和Survivin的表达水平在不同组间使用t检验,并用χ2检验分析PARP6和Survivin的表达与组织学分化、TNM分期（Tumor node metastasis）、肿瘤侵袭及分期等之间的相关性分析。用Kaplan-Meier生存曲线分析PARP6和Survivin的表达与肿瘤患者术后总生存率之间的关系,并用对数秩检验进行校验等。结果:（1）免疫组织化学方法检测的238例大肠癌患者的癌组织和20例正常大肠组织中,PARP6蛋白在大肠癌组织中低表达,在正常大肠粘膜组织中高表达;Survivin在大肠癌组织中高表达,在正常大肠粘膜组织中低表达。（2）Western blot法检测的大肠癌细胞株中,PARP6在SW620、DLD-1、SW48、HT-29和SW837细胞株中高表达,在SW480和HCT116大肠癌细胞株中低表达,而Survivin在细胞株中均呈现高表达;此外,PARP6在大肠癌冰冻组织中呈低表达,在正常大肠冰冻组织中呈高表达,而Survivin的表达情况与PARP6恰相反。（3）PARP6表达水平的降低与大肠癌患者的组织学分化、TNM分期、肿瘤侵袭及分期密切相关（P<0.001）,与患者的年龄、性别、肿瘤的大小（直径≥5 cm或<5 cm）及脉管浸润等无关（P>0.05）。Survivin的表达水平升高与大肠癌患者的组织学分化、TNM分期、肿瘤侵袭及分期有关（P<0.001）,与患者年龄、性别、肿瘤的大小（直径≥5 cm或<5 cm）及脉管浸润等无关（P>0.05）。此外,PARP6和Survivin、Ki-67在大肠癌中的表达水平呈负相关,差别有统计学意义（P<0.01）。（4）PARP6低表达与患者的预后密切相关（P<0.01）;Survivin的过表达与患者的预后密切相关（P<0.01）。（5）PARP6降低了大肠癌细胞的存活率,使细胞周期抑制蛋白p21、p27的表达升高,凋亡抑制基因Bcl-2、Bcl-XL的表达降低。结论:（1）在大肠癌组织中PARP6低表达,Survivin过表达。（2）PARP6低表达与大肠癌患者的组织学分化、TNM分期、肿瘤侵袭及分期之间有密切的联系。（3）PARP6的低表达预示着大肠癌患者的预后不佳。（4）PARP6低表达对大肠癌的发生、发展及预后等过程中有重要的作用。（5）PARP6与Survivin在大肠癌中的表达有相关性,推测PARP6可能调控Survivin的表达。
黄桂丽[6]（2017）在《视黄酸受体α在结肠癌发生发展中的作用及机理》文中提出结肠癌在世界范围内的发病率和死亡率均位列第三位。由于其发病隐匿,早期诊断困难,大多数结肠癌患者确诊时已处于晚期。因此,急需寻求结肠癌诊断和治疗的分子靶点。研究表明,视黄酸受体α（RARαt）在白血病、乳腺癌、肺癌等多种癌症的发生发展中发挥了重要的作用,而RARα参与结肠癌发生发展的作用和分子机制尚不清楚。本论文以结肠癌为研究对象,阐明RARα在结肠癌发生发展中的作用及其分子机制,为寻找新的药物靶点和安全高效的治疗方法提供科学依据。本论文研究发现,RARα在结肠癌组织中的表达明显高于癌旁相对正常组织,在结肠癌细胞株中的表达明显高于正常结肠上皮细胞,且RARα在胞浆胞核中均有表达。RARα的表达与结肠癌患者肿瘤的分化程度、组织类型、T分级和临床分级密切相关。RARα表达下调抑制了结肠癌细胞的存活、增殖和集落形成,以及结肠癌细胞的裸鼠皮下成瘤,而RARα过表达促进了结肠癌细胞的存活、增殖和集落形成。此外,RARα表达下调促进了结肠癌细胞的迁移和侵袭能力以及对5-氟尿嘧啶、奥沙利铂和长春新碱的药物敏感性。进一步研究表明,RARα表达下调阻滞细胞周期于G1期,抑制细胞周期蛋白CyclinD1的表达,促进细胞周期抑制蛋白p21的表达。分子机制研究发现,RARα促进结肠癌的发展至少通过两个方面,一是,RARα作为转录抑制蛋白结合于p21启动子上的RARE上,抑制p21的转录;另一方面,RARα通过直接与GSK3β相结合激活GSK3β/β-catenin信号通路,促进靶基因CyclinD1的表达。总结以上研究,本论文从临床样本、细胞水平和动物模型三个方面研究表明RARα促进结肠癌生长与成瘤、迁移与侵袭以及耐药性的产生。RARα通过抑制p21的转录和激活GSK3β/β-catenin信号通路,从而促进结肠癌的发生发展。RARα可能作为结肠癌治疗潜在的分子靶点。
茆家定[7]（2013）在《MAPK信号转导通路在胃泌素调节大肠癌生长中的作用及其分子机制研究》文中进行了进一步梳理胃泌素（Gastrin，GAS）最早于1905年由John在胃窦黏膜提取物中发现，并认为其与胃酸分泌有关，直到1964年才由Gregory和Tracy分离鉴定并阐述其化学结构，确认其为胃肠激素。胃泌素是一种重要的胃肠激素，主要由消化道的G细胞分泌，G细胞是典型的开放型细胞，以胃窦部最多。作为一种营养性胃肠肽，不仅能刺激正常胃肠道黏膜组织的生长，而且还能刺激胰腺癌、胆囊癌、大肠癌及胃癌等肿瘤细胞的生长。近来众多研究认为胃泌素是一种自分泌生长因子，它可以通过自分泌、旁分泌、神经内分泌等方式发挥作用。胃泌素与其受体结合后可通过细胞内信号传导途径调节肿瘤细胞的生长，即肿瘤细胞产生的胃泌素与其自身的受体结合后，发挥其生物学效应。近年来研究已证实部分大肠癌的发生与胃泌素表达异常有关，这一类大肠癌有学者把它们称为激素依赖性肿瘤，其促进大肠癌细胞增殖的机制可能是通过自主性地产生和分泌胃泌素并作用于自身细胞膜上的受体，从而发挥生物学效应，但其作用能被胃泌素受体拮抗剂所抑制，但胃泌素调节大肠癌细胞增殖的分子机制仍不清楚。近年来，通过应用基因芯片技术对大肠癌相关基因检测，筛选出大量差异表达基因,在显着差异表达的基因中,许多与细胞内外网络信号转导通路的激活与抑制密切相关，直接参与细胞的物质代谢、增殖、分化和凋亡的调节。有关丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信息转导通路的研究近来倍受关注，MAPK是细胞内一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，广泛存在于大多数哺乳动物细胞质和细胞核中，能够将细胞外刺激信号传导至细胞内及细胞核内，并引起细胞生物学反应,调节细胞的增殖、分化、发育和凋亡。丝裂原活化蛋白激酶主要分为细胞外信号调节激酶（extracellular-signal regulated protein kinase， ERK）、 c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）/应激活化蛋白激酶（stress-activated protein kinase，SAPK）、ERK5/BMK1和p38等MAPK亚族，这些亚族组成多条信号转导通路。目前研究已发现哺乳动物类细胞存在三条并行的丝裂原活化蛋白激酶信号通路，分别为为ERK信号通路、p38信号转导通路和JNK/SAPK信号转导通路。其中，JNK/SAPK和p38两条信号转导通路主要与细胞的凋亡和应激有关，而ERK信号通路在MAPK细胞信号转导网络中处于枢纽地位，它主要与细胞的增殖和分化密切相关。众多的研究提示MAPK信号转导通路参与了大肠癌细胞生长的调控。近来研究发现，胃泌素可通过激活p38MAPK信号转导通路诱导大肠癌细胞尿激酶型纤溶酶原激活物（u-PA）表达，进而增强肿瘤细胞的侵袭力和转移过程。可见，丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路在胃泌素调节大肠癌生长中起着重要作用，但其机制仍不清楚。因此我们设想首先运用ELISA法对79例大肠癌手术切除标本检测，筛选出胃泌素表达阳性及阴性的大肠癌组织标本，并对其阳性表达率、组织病理类型、分化程度及临床Duke’s分期进行分析，明确胃泌素对大肠癌生物学特性的影响。其次，分别选择5对胃泌素表达阳性的大肠癌组织及癌旁正常粘膜组织，以及5对胃泌素表达阴性的大肠癌组织及癌旁正常粘膜组织，利用基因芯片技术分别对其差异基因表达谱进行分析，将阳性组与阴性组分析结果进行比较，筛选出表达明显差异的基因，并选择明显表达差异的基因进行real-time PCR验证，同时将明显表达差异基因导入R package中，筛选出与MAPK信号转导通路相关的差异基因。最后，通过大肠癌细胞株HT-29的培养，应用Western blot、RT-PCR等技术分别对各组已筛选出MAPK信号转导通路明显相关的差异基因及其蛋白表达情况进行检测，并分析胃泌素在其受体拮抗剂丙谷胺阻断其前后对其表达变化影响，从分子信号传导水平探索大肠癌组织中胃泌素调节MAPK信号转导通路的分子机制；明确“GAS-MAPK-靶基因”信号转导通路在胃泌素调节大肠癌生长中的详细分子基础，为有效地干预其信号转导通路环节提供新的线索，为基因靶向治疗提供新目标，并为大肠癌的内分泌治疗提供更充分的理论依据。研究分三个部分：第一部分：大肠癌组织中胃泌素表达检测及生物学行为分析目的：探讨大肠癌组织中胃泌素阳性表达率以及胃泌素对组织病理类型、分化程度及临床Duke’s分期等大肠癌生物学特性的影响。方法：运用ELISA法和RT-PCR技术对79例大肠癌手术切除标本检测，筛选出胃泌素表达阳性及阴性的大肠癌组织标本，并对其阳性表达率、组织病理类型、组织分化程度及Duke’s分期进行分析。结果：79例大肠癌组织中GAS mRNA表达阳性率为46.8％（36/79），蛋白表达阳性率为40.5％（32/79）；GAS mRNA与其蛋白表达呈正相关（r=0.99, P<0.01）。GAS mRNA及其蛋白在高、中分化组织的阳性表达率明显低于低分化（P<0.05）。GAS mRNA及其蛋白在乳头状腺癌、管状腺癌的阳性表达率明显低于粘液印戒细胞癌及未分化癌（P<0.05）。DukesA,B期的GAS mRNA及其蛋白阳性表达率明显低于C,D期（P<0.05）。结论：部分大肠癌组织中存在胃泌素的表达，胃泌素的异常表达与组织分化程度、病理类型及临床Duke’s分期密切相关，胃泌素检测能够反应部分大肠癌的生物学特性，可作为临床大肠癌生物学行为的评估指标之一。第二部分：胃泌素表达阳性与阴性的大肠癌组织中MAPK信号转导通路差异基因筛选目的：探讨胃泌素表达阳性与阴性的大肠癌组织中MAPK信号转导通路相关差异基因表达。方法：应用基因芯片技术分别对大肠癌胃泌素表达阳性的癌组织、癌旁正常组织以及大肠癌胃泌素表达阴性的癌组织、癌旁正常组织中MAPK信号通路相关的差异基因表达谱进行分析，并将两组分析结果进行比较，筛选出表达明显差异的基因，并选择明显表达差异的基因进行real-time PCR验证，同时将所有差异表达基因导入Rpackage中，筛选出与MAPK信号转导通路相关的差异基因。结果：胃泌素表达阳性的癌组织与癌旁正常粘膜组织基因芯片分析结果显示：上调2倍以上的差异基因有3529个，下调2倍以下的差异基因3328个；胃泌素表达阴性的癌组织与癌旁正常粘膜组织基因芯片分析结果显示：上调2倍以上的差异基因有2867个，下调2倍以下的差异基因2549个。将两组分析的差异基因以癌组织的荧光值标记，并进行与胃泌素相关的差异基因分析，结果显示：上调2倍以上的差异基因有567个，下调2倍以下的差异基因342个。并筛选出与MAPK信号转导通路相关的差异基因78。分别选择上调和下调基因各3个进行基因验证，验证结果显示：PCR与芯片分析结果基本一致。结论：cDNA微阵列法可以用于胃泌素相关的大肠癌的相关基因的筛选，获得的差异基因具有强烈的代表性。大肠癌组织中胃泌素表达阳性与阴性之间存在着差异基因的表达；MAPK信号转导通路参与了胃泌素对大肠癌细胞生长的调控。第三部分：MAPK信号转导通路在胃泌素调节大肠癌细胞增殖与凋亡中的作用及机制目的：探讨胃泌素对体外培养的人大肠癌细胞株HT-29增殖、凋亡的影响，以及与MAPK信号转导通路的关系。方法：通过体外对大肠癌HT-29细胞株的培养，分别运用MTT法观察细胞增生活力改变情况，确立5-肽胃泌素（pentagastrin, PG）和丙谷胺（proglumide, PGL）处理HT-29细胞的最佳浓度；流式细胞仪Annexin V-FITC法检测各组细胞增殖指数（proliferationindex, PI）及凋亡率（apoptosis rate, AR）的变化；RT-PCR检测大肠癌HT-29细胞株胃泌素受体CCK-BR mRNA表达情况以及各组ERK1/2、K-ras、p38、bax、bcl-2mRNA表达水平的变化；Western blot法检测ERK1/2、K-ras、p38、bax、bcl-2蛋白表达及其ERK1/2、K-ras、p38磷酸化水平。结果：胃泌素浓度在6.25～100.00mg/L范围内能促进大肠癌HT-29细胞的增殖抑制凋亡，且度增加到25.00mg/L时OD值最大，促增生能力最强（P<0.05）；胃泌素受体拮抗剂丙谷胺单独对大肠癌HT-29细胞增殖、凋亡无明显影响，但丙谷胺在一定浓度范围内（8.00～128.00mg/L）能明显拮抗胃泌素促进HT-29细胞的增殖作用,其最佳浓度为32.00mg/L（P<0.05）。胃泌素组细胞增殖指数显着高于对照组和胃泌素+丙谷胺组（P<0.01）；胃泌素组凋亡率显着低于对照组和胃泌素+丙谷胺组（P<0.05）；HT-29细胞中存在明显的CCK-BR mRNA表达；PG组（0.43±0.04,0.45±0.06）与对照组（0.32±0.02,0.31±0.05）及PG+PGL组（0.36±0.01，0.35±0.04）相比，ERK1/2、K-ras磷酸化水平明显升高，而p38磷酸化水平明显降低（P<0.05），ERK1/2、K-ras及p38mRNA及蛋白表达无明显差异；胃泌素组与对照组和胃泌素+丙谷胺组比较bax mRNA及蛋白表达明显降低、Bcl-2mRNA及蛋白表达明显增高（P<0.05）。结论：胃泌素能够促进大肠癌HT-29细胞增殖、抑制凋亡，但能被其受体拮抗剂丙谷胺抑制。其机制可能是通过激活ERK-MAPK信号通路中Ras→Raf→MEK1/2→ERK1/2途径促进大肠癌HT-29细胞增殖；通过激活p38-MAPK信号通路中p38MAPK→bcl-2/bax途径抑制大肠癌HT-29细胞凋亡。
马玉滨[8]（2013）在《K-RAS、MDM-2在大肠癌中的表达及临床意义》文中指出目的：1、检测k-ras、mdm2在大肠癌及正常组织的表达及其临床意义。2、检测k-ras、mdm2异常表达为临床个体化治疗提供理论依据。方法：采用免疫组化技术检测42例大肠腺癌组织及癌旁正常组织（距离肿块≧5cm）中k-ras、mdm2的表达水平及表达差异，结合临床病理资料对二者进行综合分析。结果：大肠癌中k-ras阳性表达率为67%，癌旁正常组织阳性表达率为33%，有显着差异性（P<0.05）。大肠癌中mdm2阳性表达率为66%，癌旁正常组织阳性表达率为14%，有显着差异性（P<0.05）。大肠癌中k-ras、mdm2的表达与患者的性别、年龄、肿瘤大小及部位均无关系；大肠癌中k-ras、mdm2的表达与大肠癌的分化程度、病理分期、淋巴结转移程度相关。结论：K-ras基因、mdm2基因在大肠癌中存在高表达率，二者的表达与大肠癌的分化程度、病理分期、淋巴结转移和预后密切相关，二者的联合测定可以作为诊断、治疗大肠癌和判定大肠癌预后的有效方法。
单宝珍,童强,刘丽娜[9]（2012）在《EGFR、Ras蛋白在大肠癌及其癌前组织中的表达及临床意义》文中提出目的探讨在大肠癌发生过程中EGFR、Ras蛋白表达及其与大肠癌临床病理特征的关系。方法应用免疫组织化学SP法检测115例大肠癌、36例大肠腺瘤、43例正常大肠黏膜中EGFR和Ras的蛋白表达,并分析两者与大肠癌临床病理特征的关系。结果大肠癌、大肠腺瘤与正常大肠黏膜组EGFR蛋白的阳性表达率分别为62.61%（72/115）、30.56%（11/36）与12.77%（6/47）,三组间差异有统计学意义（P<0.05）;Ras蛋白的阳性表达率分别为46.09%（53/115）、38.89%（14/36）与10.63%（5/47）,前两者明显高于后者（P<0.05）。其中在大肠癌浸润深度达黏膜下层和肌层、浆膜下层及侵透浆膜层组EGFR蛋白阳性表达率分别为36.84%（7/19）、67.09%（53/79）与70.59%（12/17）,后两者明显高于前者（P<0.05）;在低分化癌与高中分化癌组中Ras蛋白的阳性表达率分别为59.52%（25/42）与38.36%（28/73）,两者差异有统计学意义（P<0.05）。相关性分析显示EGFR与Ras在大肠癌组织中表达呈正相关（r=0.354,P<0.05）。结论 EGFR蛋白表达与大肠癌组织浸润深度相关,而Ras蛋白表达与肿瘤的分化程度相关,联合检测两基因有助于大肠癌的诊断及预后评估。
杨景[10]（2011）在《SEMA3F及其受体NRP2在结直肠癌演进中的作用及机制研究》文中指出结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率一直高居不下。尽管诊治方法不断进步,结直肠癌的治疗效果仍不理想。业已公认,结直肠癌的发生、演进是一个多因素参与、多基因改变的多步骤过程,而转移是威胁患者生存的最重要的因素。因此,寻找转移相关基因和有效的预后标记物对于认识结直肠癌的演进机制,实施有效靶向治疗具有重要的理论和实践意义。神经生物学研究显示,轴突导向分子SEMA3F及其受体NRP2具有排斥上颈神经节轴突和调节神经系统发育的功能。近年发现,SEMA3F和NRP2亦表达于肺癌、乳腺癌、卵巢癌以及结直肠癌等人类多种恶性肿瘤组织,提示其在肿瘤生物学行为调节中可能发挥重要作用。已有的研究结果显示,SEMA3F和NRP2虽然是配受体关系,但NRP2亦能够通过其他信号通路介导与SEMA3F截然相反的生物学效应。因此,我们推测SEMA3F和NRP2的比值可能是决定肿瘤演进的关键因素,其分子间的相互作用与临床意义值得探讨。然而,目前针对SEMA3F和NRP2分子的肿瘤大样本临床研究非常缺乏,二者在常见肿瘤结直肠癌中的表达特点及其临床病理学意义尚待探讨,对肿瘤预后的影响亦未见报道,SEMA3F的表达对结直肠癌细胞的作用及其机制还有待进一步阐明。为此,本研究分为两部分:第一部分采用免疫组织化学和免疫印迹技术在大样本临床资料上观测了SEMA3F与NRP2在人结直肠癌中的表达特点,并探讨其临床意义;第二部分通过慢病毒干扰技术沉默结直肠癌细胞SEMA3F基因表达,然后采用基因芯片技术研究了差异基因表达特点,进一步探讨了SEMA3F对结直肠癌细胞生物学功能的影响及其分子机制。主要研究结果和结论如下:1.在结直肠癌发生和演进过程中NRP2表达呈现“双峰”改变NRP2蛋白定位于结直肠癌及正常结肠黏膜上皮细胞胞浆,其表达在正常粘膜、癌旁增生性粘膜（包括腺瘤在内的轻、中、重度不典型增生粘膜）以及肿瘤组织中依次增强,以癌旁粘膜表达阳性率最高;肿瘤组织中NRP2在结直肠癌早期表达下调,低于癌旁组织,晚期则显着上调,与癌旁组织水平相近甚至高于之;NRP2表达与结直肠癌的浸润深度、Dukes分期、淋巴结转移、TNM分期、远处转移、复发等临床病理特征显着正相关,与分化程度负相关,在淋巴结转移灶中的表达显着强于原发灶。以上结果提示,NRP2的上调表达可能在结直肠黏膜癌变的早期就已出现,可能与肿瘤的发生、分化、侵袭和转移有关。2. SEMA3F在结直肠癌粘膜癌变过程中表达上调,随着肿瘤演进表达下调SEMA3F蛋白定位于结直肠癌细胞及正常结肠黏膜上皮细胞胞浆,其表达在正常粘膜、癌旁增生性粘膜（包括腺瘤在内的轻、中、重度不典型增生粘膜）中依次增强,在重度不典型增生粘膜中到达“平台期”,然后在肿瘤组织中下调,显着低于癌旁组织;随着Dukes分期增高,癌组织以及癌旁组织的SEMA3F表达均显着降低;SEMA3F表达与结直肠癌的淋巴结转移、Dukes分期、肿瘤复发显着负相关,在淋巴结转移灶中SEMA3F表达显着弱于原发灶。以上结果提示,SEMA3F表达上调可能是结直肠癌发生的早期事件,表达下调与结直肠癌的演进密切相关,并可能促进肿瘤的淋巴结转移和复发。3.SEMA3F、NRP2表达水平与结直肠癌的淋巴管生成相关结直肠癌组织的微淋巴管的分布、形态和数量存在异质性;结直肠癌组织及癌旁粘膜的微淋巴管密度与淋巴结转移和NRP2表达正相关,与SEMA3F表达显着负相关。以上结果提示,SEMA3F可能对淋巴管生成具有抑制作用,而NRP2则与之相反。4.SEMA3F、NRP2表达水平影响结直肠癌患者预后NRP2表达与患者预后显着负相关;肿瘤具有高T/A比值（癌组织NRP2表达与癌旁组织NRP2表达的比值,≥2）的患者预后显着差于肿瘤有低T/A比值（<2）的患者;SEMA3F表达与患者预后显着正相关;当肿瘤NRP2表达强于SEMA3F时患者预后最差,而NRP2表达弱于或等于SEMA3F者预后最好,NRP2和SEMA3F双阴性患者预后介于二者之间;肿瘤的转移、复发以及SEMA3F表达、NRP2和SEMA3F表达比值是独立的预后因素。5.下调SEMA3F表达调控多基因表达采用siRNA干扰结直肠癌细胞SEMA3F表达共筛选出709条表达上调的差异表达基因和759条表达下调的差异表达基因;经GO分类比对,共有1468条基因与63个GO分类匹配,涉及生物过程的相关性较高的GO以对细胞生长与增殖、细胞运动、细胞肌动蛋白丝重组、组织器官发育、细胞过程的调节的影响最为显着,细胞组份以细胞前缘最为突出,提示SEMA3F基因广泛参与了细胞的多项生命过程并对之有显着影响。6.SEMA3F的功能可能涉及多个信号分子改变KEGG通路分析显示:多条肿瘤信号通路、增殖相关的细胞周期信号通路,以及与细胞运动迁移密切相关的肌动蛋白骨架通路发生显着改变,提示调节细胞增殖、迁移、转移相关的信号通路改变可能是SEMA3F基因参与肿瘤发生、发展的重要分子机制。结论:1.SEMA3F与NRP2的上调可能是结直肠癌发生的早期事件,提示其可能参与了结直肠癌的发生;2. NRP2的上调与结直肠癌的分化、转移、复发以及淋巴管生成等恶性特征正相关,提示其可能作为促转移基因参与了结直肠癌的演进;3. SEMA3F表达与结直肠癌的转移、复发以及淋巴管生成负相关,调节细胞增殖、迁移、转移相关的信号通路改变可能是其参与肿瘤发生、发展的重要分子机制,提示SEMA3F可能作为肿瘤抑制基因阻遏结直肠癌的发生与演进;4.NRP2和SEMA3F表达和二者的比值,以及肿瘤与癌旁组织的NRP2表达比值与结直肠癌患者预后密切相关,可能是预测结直肠癌预后的重要指标。
二、大肠癌及癌旁粘膜p21~(ras)表达及意义（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、大肠癌及癌旁粘膜p21~(ras)表达及意义（论文提纲范文）
（1）口腔鳞状细胞癌LncRNA HCG11的表达及作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 口腔鳞状细胞癌LncRNA HCG11和PTPRS的表达水平研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 LncRNA HCG11/miR-455-5P分子轴调控PTPRS对口腔鳞癌细胞株增殖的机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 LncRNA HCG11对口腔鳞状细胞癌裸鼠移植瘤影响的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 非编码RNA在口腔鳞状细胞癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）结直肠癌患者KRAS、NRAS、BRAF基因突变与关键基因表达的相关性及circGLG1/miR-622/KRAS轴的分子作用机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略表 |
| 第1章 结直肠癌患者KRAS、NRAS、BRAF基因突变与关键基因表达的相关性 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料 |
| 1.2.1 实验试剂 |
| 1.2.2 实验仪器 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 研究对象 |
| 1.3.2 组织DNA提取 |
| 1.3.3 DNA浓度测定 |
| 1.3.4 KRAS、NRAS、BRAF检测位点及突变类型 |
| 1.3.5 ARMS-PCR反应 |
| 1.3.6 KRAS、NRAS、BRAF基因突变结果判定 |
| 1.3.7 免疫组织化学染色 |
| 1.3.8 免疫组化结果判定 |
| 1.3.9 统计学分析 |
| 1.4 结果 |
| 1.4.1 患者一般资料 |
| 1.4.2 KRAS突变分布及其与结直肠癌患者临床病理学特征分析 |
| 1.4.3 NRAS突变分布及其与结直肠癌患者临床病理学特征分析 |
| 1.4.4 BRAF突变情况及其与结直肠癌患者临床病理学特征分析 |
| 1.4.5 免疫组织化学染色结果 |
| 1.4.6 KRAS、NRAS、BRAF基因突变与免疫组化结果分析 |
| 1.4.7 KRAS、NRAS、BRAF基因突变与免疫组化结果的多重对应分析 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 结论 |
| 第2章 Circ GLG1/miR-622/KRAS轴在结直肠癌中的分子作用机制 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 细胞系 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 研究对象 |
| 2.3.2 细胞培养 |
| 2.3.3 RNA提取及浓度测定 |
| 2.3.4 m RNA及 circRNA qRT-PCR反应 |
| 2.3.5 MiRNA qRT-PCR反应 |
| 2.3.6 生物信息学分析方法 |
| 2.3.7 细胞功能学实验 |
| 2.3.8 Western blot实验 |
| 2.3.9 双荧光素酶报告实验 |
| 2.3.10 统计学分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 KRAS在结直肠癌组织中表达上调 |
| 2.4.2 生物信息学方法预测KRAS潜在的上游调控miRNA和circRNA分子 |
| 2.4.3 CircGLG1及miR-622 在临床样本中的表达水平 |
| 2.4.4 Circ GLG1 在结直肠癌细胞系中表达上调并促进结直肠癌细胞增殖及侵袭 |
| 2.4.5 CircGLG1 通过调控miR-622/KRAS轴促进结直肠癌细胞增殖及侵袭 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 结论 |
| 第3章 全文总结 |
| 3.1 结论 |
| 3.2 创新点 |
| 3.3 本论文的不足 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述1 RAS突变在肿瘤中的靶向治疗进展 |
| 1 RAS基因及蛋白的结构及功能 |
| 2 RAS基因及蛋白的直接靶向治疗 |
| 3 RAS蛋白下游信号通路靶向治疗进展 |
| 4 RAS突变的其他靶向治疗策略 |
| 5 总结 |
| 参考文献 |
| 综述2 环状RNA在结直肠癌中的研究进展 |
| 1 环状RNA的起源与特点 |
| 2 环状RNA的形成机制 |
| 3 环状RNA的功能 |
| 4 环状RNA在结直肠癌中的研究 |
| 5 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 博士研究生指导组成员和课题基金资助项目 |
| 致谢 |
（3）超保守RNA uc.454抑制肺癌细胞侵袭转移的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 uc.454在非小细胞肺癌中的表达及临床病理意义 |
| 实验方法和材料 |
| 研究方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 uc.454表达对肺癌细胞侵袭和迁移能力的影响 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 uc.454 抑制K-RAS表达的机制研究 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 uc.454 通过K-RAS抑制肺癌细胞侵袭转移的信号通路研究 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 综述 非编码RNA在肺癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 攻读学位期间公开发表的论文 |
| 致谢 |
（4）HMGB1-RAGE炎症信号通路促进直肠癌进展机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 1.1 课题来源、研究目的和意义 |
| 1.2 国内外研究概况 |
| 1.3 论文的主要研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 第三章 小结 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 本研究所获的基金资助 |
| 攻读博士学位期间公开发表的论文及参编着作 |
| 致谢 |
（5）PARP6和Survivin在大肠癌中的表达及意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英汉缩略词对照表 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料和仪器 |
| 1.1.1 石蜡标本的收集 |
| 1.1.2 细胞株 |
| 1.1.3 质粒PARP6和ΔC PARP6 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 1.2.1 实验常用试剂 |
| 1.2.2 常用试剂的配制 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 1.4 实验方法一:检测PARP6和Survivin在大肠中的表达及关联以及两者与临床病理学特征的关系 |
| 1.4.1 免疫组织化学染色法检测 PARP6,Survivin和Ki-67蛋白在不同组织中的表达 |
| 1.4.2 大肠癌细胞株培养 |
| 1.4.3 Western Blot方法检测PARP6及Survivin蛋白在不同组织中的表达 |
| 1.5 实验方法二—检测PARP6和Survivin在大肠癌中表达的意义 |
| 1.5.1 随访 |
| 1.5.2 重组表达质粒PARP6和ΔCPARP6转染SW480细胞 |
| 1.5.3 Western Blot方法检测转染后PARP6的表达与周期蛋白P21、P27及凋亡相关基因Bcl-2、Bcl-XL等的关系 |
| 1.5.4 MTT实验 |
| 1.6 统计分析 |
| 2 结果和分析 |
| 2.1 PARP6在大肠癌组织中呈低表达,Survivin呈高表达 |
| 2.2 PARP6的低表达及Survivin的高 表达与大肠癌的恶性度相关 |
| 2.3 PARP6和Survivin及Ki-67在大肠癌中的表达有相关性 |
| 2.4 PARP6和Survivin在大肠癌细胞株及组织中的表达情况 |
| 2.5 PARP6在大肠癌中的低表达预后不良 |
| 2.6 MTT实验结果显示SW480细胞转染PARP6质粒后存活率降低 |
| 2.7 WB实验结果显示PARP6抑制细胞周期进展 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 PARP与肿瘤治疗的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间主持及参与的基金课题 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 致谢 |
（6）视黄酸受体α在结肠癌发生发展中的作用及机理（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 结肠癌临床研究概况 |
| 1.1.1 结肠癌的流行病学与危险因素 |
| 1.1.2 结肠癌的诊断与治疗 |
| 1.2 结肠癌分子生物学研究进展 |
| 1.2.1 结肠癌发生发展的分子机制 |
| 1.2.2 结肠癌转移的分子机制 |
| 1.2.3 结肠癌耐药性产生机理 |
| 1.3 视黄酸受体α研究进展 |
| 1.3.1 视黄酸受体α概述 |
| 1.3.2 视黄酸受体α生物学功能 |
| 1.3.3 视黄酸受体α调控肿瘤的分子机制 |
| 1.4 本论文的研究内容和研究意义 |
| 1.4.1 研究内容 |
| 1.4.2 研究意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 常用药品和试剂 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 主要试剂耗材 |
| 2.1.3 主要试剂配置 |
| 2.2 分子克隆相关实验 |
| 2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.2.2 质粒DNA的转化 |
| 2.2.3 质粒DNA小量抽提 |
| 2.2.4 质粒DNA中量抽提 |
| 2.2.5 DNA样品琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.6 琼脂糖胶回收DNA片段 |
| 2.2.7 细胞基因组DNA的提取 |
| 2.2.8 pIRES2-EGFP-RARα载体构建 |
| 2.2.9 pLL3.7-neo-shRARα载体构建 |
| 2.2.10 pcDNA3.0-flag-RARα全长及缺失载体构建 |
| 2.2.11 pcDNA3.0-3HA-GSK3β载体构建 |
| 2.2.12 GST-GSK3β融合蛋白表达载体构建 |
| 2.2.13 p21启动子及点突变荧光素酶报告载体构建 |
| 2.3 细胞相关实验 |
| 2.3.1 细胞的培养和传代 |
| 2.3.2 细胞瞬时转染 |
| 2.3.3 细胞稳定转染 |
| 2.3.4 细胞存活实验(MTT) |
| 2.3.5 细胞增值实验(EdU) |
| 2.3.6 集落形成实验 |
| 2.3.7 迁移和侵袭实验 |
| 2.3.8 流式细胞术 |
| 2.3.9 细胞荧光素酶活性检测 |
| 2.4 RNA相关实验 |
| 2.4.1 RNA的提取 |
| 2.4.2 反转录合成cDNA |
| 2.4.3 实时荧光定量PCR |
| 2.5 蛋白质相关实验 |
| 2.5.1 Western blot |
| 2.5.2 免疫共沉淀 |
| 2.5.3 细胞免疫荧光 |
| 2.5.4 GST Pulldown实验 |
| 2.6 染色质免疫共沉淀(ChIP) |
| 2.7 H&E染色和免疫组织化学 |
| 2.7.1 H&E染色 |
| 2.7.2 免疫组织化学(IHC) |
| 2.8 裸鼠皮下移植瘤实验 |
| 2.9 统计学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 RARα在结肠癌组织中的表达及临床意义 |
| 3.1.1 RARα在结肠癌组织中的表达情况 |
| 3.1.2 RARα在结肠癌组织中表达的临床意义 |
| 3.2 构建RARα的表达和干扰载体 |
| 3.2.1 RARα表达载体的构建 |
| 3.2.2 pIRES2-EGFP-RARα重组质粒表达验证 |
| 3.2.3 RARα干扰载体的构建 |
| 3.2.4 pLL3.7-neo-shRARα干扰载体的验证 |
| 3.3 RARα稳定敲除细胞株的构建 |
| 3.3.1 RARα在结肠癌细胞中的表达情况 |
| 3.3.2 稳定敲除细胞株的筛选 |
| 3.3.3 RARα稳定敲除细胞株的验证 |
| 3.4 RARα表达改变对结肠癌细胞生长与成瘤的影响 |
| 3.4.1 RARα表达改变对结肠癌细胞存活的影响 |
| 3.4.2 RARα表达改变对结肠癌细胞增殖的影响 |
| 3.4.3 RARα表达改变对结肠癌细胞集落形成能力的影响 |
| 3.4.4 RARα表达改变对裸鼠皮下成瘤能力的影响 |
| 3.5 RARα表达改变对结肠癌细胞迁移与侵袭能力的影响 |
| 3.6 RARα表达改变对结肠癌细胞耐药性的影响 |
| 3.6.1 RARα表达改变对结肠癌细胞药物敏感性影响 |
| 3.6.2 RARα表达改变对裸鼠皮下瘤的药物敏感性影响 |
| 3.7 RARα促进结肠癌生长的分子机制研究 |
| 3.7.1 RARα参与调控结肠癌细胞周期 |
| 3.7.2 RARα调控p21的分子机制 |
| 3.7.3 RARα调控GSK3β/β-catenin信号通路 |
| 3.7.4 RARα与GSK3β相互作用 |
| 4 讨论 |
| 4.1 RARα在结肠癌组织中高表达具有重要的临床意义 |
| 4.2 RARα通过调控细胞周期促进结肠癌细胞的生长与成瘤 |
| 4.3 RARα促进结肠癌细胞的侵袭与迁移 |
| 4.4 RARα促进结肠癌细胞耐药性的产生 |
| 4.5 RARα促进结肠癌生长的分子机制 |
| 4.5.1 RARα通过抑制p21的转录促进结肠细胞的生长 |
| 4.5.2 RARα通过GSK3β/β-catenin信号通路促进结肠癌细胞的生长 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 在校期间发表论文 |
| 在校期间获奖情况 |
| 致谢 |
（7）MAPK信号转导通路在胃泌素调节大肠癌生长中的作用及其分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分：大肠癌组织中胃泌素表达检测及生物学行为分析 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分：胃泌素表达阳性与阴性的大肠癌组织中 MAPK 信号转导通路差异基因筛选 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分：MAPK 信号转导通路在胃泌素调节大肠癌细胞增殖与凋亡中的作用及机制 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 本文的创新之处 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间公开发表的论文 |
| 英文缩略词表 |
| 致谢 |
（8）K-RAS、MDM-2在大肠癌中的表达及临床意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验仪器及试剂 |
| 1.2.1 仪器 |
| 1.2.2 试剂 |
| 1.3 检测方法及操作步骤 |
| 1.4 结果判定 |
| 1.5 统计学处理 |
| 附图 |
| 第二章 结果 |
| 2.1 K-ras 在大肠癌、癌旁正常组织中的表达 |
| 2.2 Mdm2 在大肠癌、癌旁正常组织中的表达 |
| 2.3 K-ras、mdm2 表达与大肠癌临床病理参数的关系 |
| 第三章 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
（9）EGFR、Ras蛋白在大肠癌及其癌前组织中的表达及临床意义（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 资料和方法 |
| 1.1 标本来源 |
| 1.2 试剂与方法 |
| 1.3 结果判定 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 大肠癌、大肠腺瘤与癌旁黏膜组织中EGFR与Ras蛋白的表达情况 |
| 2.2 EGFR、Ras蛋白表达与大肠癌临床病理特征的关系 |
| 2.3 大肠癌中EGFR与Ras蛋白表达的关系 |
| 3 讨 论 |
（10）SEMA3F及其受体NRP2在结直肠癌演进中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 结直肠癌中SEMA3F 及其受体NRP2 的表达规律及其临床病理学意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 结直肠癌细胞SEMA3F 沉默后差异表达基因谱的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 文献综述一 SEMA3F 抑制肿瘤侵袭、转移及其机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 Neuropilins 在肿瘤中的生物学效应与临床应用前景 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间以(共同)第一作者发表和投稿的论文 |
四、大肠癌及癌旁粘膜p21~(ras)表达及意义（论文参考文献）
- [1]口腔鳞状细胞癌LncRNA HCG11的表达及作用机制研究[D]. 吴景景. 河北医科大学, 2021(02)
- [2]结直肠癌患者KRAS、NRAS、BRAF基因突变与关键基因表达的相关性及circGLG1/miR-622/KRAS轴的分子作用机制[D]. 郝书弘. 吉林大学, 2020(08)
- [3]超保守RNA uc.454抑制肺癌细胞侵袭转移的机制研究[D]. 周俊. 苏州大学, 2020(06)
- [4]HMGB1-RAGE炎症信号通路促进直肠癌进展机制研究[D]. 钱飞. 苏州大学, 2018(04)
- [5]PARP6和Survivin在大肠癌中的表达及意义[D]. 刘甜. 桂林医学院, 2017(06)
- [6]视黄酸受体α在结肠癌发生发展中的作用及机理[D]. 黄桂丽. 厦门大学, 2017(01)
- [7]MAPK信号转导通路在胃泌素调节大肠癌生长中的作用及其分子机制研究[D]. 茆家定. 苏州大学, 2013(11)
- [8]K-RAS、MDM-2在大肠癌中的表达及临床意义[D]. 马玉滨. 青海大学, 2013(02)
- [9]EGFR、Ras蛋白在大肠癌及其癌前组织中的表达及临床意义[J]. 单宝珍,童强,刘丽娜. 肿瘤防治研究, 2012(06)
- [10]SEMA3F及其受体NRP2在结直肠癌演进中的作用及机制研究[D]. 杨景. 第三军医大学, 2011(07)