一、猪流行性腹泻病毒分子生物学特征（论文文献综述）
郭涛[1]（2021）在《猪流行性腹泻病毒COE亚单位疫苗制备及免疫原性分析》文中指出猪流行性腹泻（PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）所导致的急性、高度传染性和严重致死性的肠道系统疾病。自英国于上世纪70年代首次发现PED以来,该病广泛蔓延于世界各地,对全球养殖业和农牧民造成了难以弥补的经济损失。追溯到本世纪初期,在PEDV疫苗的成功开发及广泛应用下,该病防治效果显着。2010年PED在我国多地风暴流行,基于经典毒株CV777和DR13制备的疫苗无法对仔猪起到有效的免疫保护作用,这一现象提示大家PED的暴发可能是由于PEDV进化和变异为不同的基因型引起的,所以对于多样化的PEDV毒株,传统疫苗无法保护仔猪免受感染。市场中现存的针对PEDV的疫苗普遍通过肠外方式接种,无法有效诱导高滴度的特异性血清IgG抗体和黏膜SIgA抗体,导致对PEDV感染的黏膜保护作用不佳,因此开发出能够在肠道内提供足够的黏膜保护的PEDV疫苗和免疫策略势在必行。目的:（1）分析市场现有PEDV疫苗不足以提供有效保护作用的原因;（2）分析确认可作为针对PEDV亚单位疫苗的抗原基因,摸索通过原核表达系统获得该重组蛋白的诱导表达条件和纯化方法,为PEDV亚单位疫苗的制备奠定基础;（3）评价PEDV COE亚单位疫苗的免疫原性,初步研究PEDV亚单位疫苗的免疫策略,探讨其在PEDV相关疫苗研发中的潜在价值。方法:（1）分析自2010年以后国内PEDV流行株COE（499 aa～638 aa）氨基酸序列同源性,通过全基因合成方法获得其中相对保守毒株的COE基因序列;（2）利用生物信息学工具分析COE基因的基本特点、二级结构和抗原表位等信息;（3）使用p ET32a（+）原核表达系统表达重组COE蛋白并纯化;（4）以纯化后的重组COE蛋白免疫仔猪,收集各时间段血清和黏膜样品,建立重组COE蛋白抗原检测PEDV特异性抗体的间接ELISA方法,检测免疫前后血清中特异性IgG抗体、粪便和唾液黏膜组织中特异性SIgA抗体以及细胞因子水平变化,通过体液免疫和细胞免疫综合评价猪流行性腹泻病毒COE亚单位疫苗的免疫原性。结果:（1）分析比对近年来国内PEDV流行株COE氨基酸序列同源性,选取相对保守毒株CH/PDS/2015（Gen Bank登录号:KU237224,中国河南）作为模板,成功合成了COE基因。生物信息学分析结果表明,截取的COE蛋白（499 aa～638 aa）不存在信号肽和跨膜结构域,空间结构相对紧密。B细胞抗原表位预测结果显示,COE蛋白含有丰富的B细胞抗原表位,有望成为亚单位疫苗的候选靶标。（2）构建pcDNA3.1-COE真核重组质粒,并检测到该重组质粒在基因水平成功表达。构建重组原核表达菌株pET-32a-COE-Trans B（DE3）,大小约为35 k Da的重组COE蛋白以包涵体形式表达,纯化效果良好,成功制备了PEDV COE亚单位疫苗,并建立了COE亚单位疫苗的制备方法。（3）重组COE蛋白与CpG-ODN+Curdlan通过肌肉注射免疫方式可刺激仔猪血清中特异性IgG显着升高（p<0.001）,且长期维持在较高水平。口服途径免疫后在粪便和唾液样品中检测到了低水平且短暂的特异性SIgA抗体。结论:PEDV COE亚单位疫苗具备良好的免疫原性,可刺激机体产生高水平的特异性抗体;抗原与CpG-ODN+Curdlan联合使用的肌内抗原注射（初次免疫）和随后口服抗原（加强免疫）的新型免疫策略,为猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗的免疫推广奠定了理论基础,为猪流行性腹泻病的防治提供新思路。有关PEDV COE亚单位疫苗诱导机体高水平且持久的黏膜免疫策略仍然有待深入研究。
鞠泳政[2]（2020）在《猪流行性腹泻病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及遗传进化分析》文中研究表明猪流行性腹泻病毒（Procine epidemic diaherra virus,PEDV）是猪病毒性腹泻爆发的主要病原之一,在感染仔猪后,会引起猪的流行性腹泻（Procine epidemic diaherra,PED）。哺乳期仔猪发病率及病死率极高。自2010年,PED在我国大面积爆发,因此对PEDV的流行情况进行持续的监测十分必要。本研究首先将PEDV N基因连接到p EASY-Blunt Simple载体,构建标准质粒。利用该质粒上的T7启动子,体外转录RNA模板作为荧光定量RT-PCR的标准品。对灵敏度的验证表明,本研究所建立的实时荧光定量PCR方法最低可以检测到10个拷贝。通过检测多种病毒,评估该方法的特异性及准确度,结果表明,仅PEDV可以扩增到曲线,而其他病原均无曲线扩增;无论是批内重复试验还是批间重复试验,其CT值的变异系数均在2%以下,表明该方法特异性强,准确度高。用建立好的RT-PCR方法对2018-2019年山东省四个地区采集的161份临床样品进行检测,阳性率在25.71-41.93%。这表明PEDV在本研究所取样地区猪群中的流行较为严重,对该病的防控工作刻不容缓。随后,本研究对山东部分地区PEDV流行株的S序列进行了扩增测序和比对分析,绘制遗传进化树。研究发现,本研究鉴定的毒株和近期中国某些地区分离的毒株亲缘关系密切,但本研究中所鉴定的6个毒株分处两个不同的群中,其中4株属于G2b型,1株属于G2a型,1株属于G1型。除了SDLY1801外,五株均和主要疫苗株亲缘关系较远,说明目前养殖场暴发的PEDV在流行过程中S基因序列发生了变异,极有可能导致现有疫苗失去保护作用。最终,本研究使用Vero细胞在病料中分离到一株PEDV流行株SDLY1801,该病料在Vero细胞上盲传5代,间接免疫荧光试验检测证实成功分离到PEDV毒株。根据参考毒株的基因组序列设计15对特异性引物,对PEDV SDLY1801株进行全基因组测序。测序结果表明,SDLY1801属于G1型,S基因没有发生插入或缺失突变,但存在较多变异,特别是在核心表位COE结构域存在氨基酸变异;对S基因的抗原指数进行分析,同样发现在20-100aa及300-350aa氨基酸SDLY1801株S蛋白和CV777株S蛋白的抗原性存在差别。这表明PEDV在流行过程中,不断发生突变,产生抗原性的改变。本研究也提示,尽管我国目前猪群PEDV感染以G2群为主,但仍不可以放松对G1群PEDV的防控力度。
吴龙成[3]（2020）在《福建省某猪场猪流行性腹泻的检测与防治》文中提出猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）是生猪养殖过程中的一种常见病、多发病。该病主要是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）感染猪所导致的一种急性消化道传染病。在养殖过程中发现此病传播速度快,发病急,死亡率高,其中以哺乳仔猪感染最为严重,主要临床症状有水样腹泻、呕吐和脱水等。近年在全国出现较大范围的流行,给我国的养猪业带来重大经济损失。本研究对一发生严重仔猪腹泻的规模化猪场,进行分子生物学鉴别诊断,主要采用RT-PCR和荧光定量PCR技术对猪瘟病毒、蓝耳病病毒、猪伪狂犬病毒,轮状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和代尔塔冠状病毒进行检测,分析了哺乳母猪、哺乳仔猪、保育猪粪便中的PEDV病毒载量,探讨该场PEDV的传播路径,并对目的病原的PCR产物进行了测序分析。与此同时,对猪场水质进行检测与分析。最后选择同源性最高的猪传染性胃肠炎-猪流行性腹泻二联疫苗对母猪群紧急免疫（活加灭）并加强生物安全处理措施后,检测产床仔猪粪便中的PEDV情况。结果如下:1.福建某猪场产床小猪发生严重腹泻和呕吐,1周内同栋产房的仔猪几乎全部发病,怀疑病毒感染因素,采用RT-PCR法对猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、轮状病毒和代尔塔冠状病毒进行检测,结果表明,轮状病毒、传染性胃肠炎病毒和代尔塔冠状病毒均为阴性,只有猪流行性腹泻病毒为阳性;为了分析是否存在猪瘟病毒、蓝耳病毒、伪狂犬轮状病毒、猪圆环病毒的混合感染,采用荧光定量PCR进一步对以上病毒进行检测,结果表明该猪群猪瘟病毒、蓝耳病毒、伪狂犬轮状病毒、猪圆环病毒均为阴性,没有存在与这些病毒混合感染。3个阶段猪PEDV的病毒载量检测结果为,病毒载量最高的是哺乳母猪（≥1.13×103占60%）,其次是哺乳仔猪（≥1.13×103占30%）,最后是保育猪（≥1.13×103占10%）。可见,该场PEDV疫情是哺乳母猪先发病然后传染给哺乳仔猪。2.采集猪场引用水送检,结果表明,该场猪饮用水中未检出致病菌,重金属含量低于限制量,色度、嗅和味等指标均符合饮用水标准,提示该场饮用水无异常。3.为了更合理的选择疫苗,本试验对PDEV的PCR产物进行测序分析,结果显示,该猪场的PEDV毒株与Gen Bank中9株PEDV毒株的同源性在56.2%-93.7%之间,其中与AJ1102毒株的同源性最高,为93.7%。选择猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗（WH-1R株+AJ1102-R株）对该场母猪群采取后海穴紧急免疫接种并结合严格的生物安全措施,结果表明,经紧急免疫的母猪所产仔猪健康度显着上升,仔猪粪便中PEDV的阳性率显着下降,表明该猪场已经将PED有效控制。综上,引起该猪场腹泻的病原是猪流行性腹泻病毒,该场传播路径为从哺乳母猪传染给哺乳仔猪,选择同源性高的疫苗紧急免疫,强化生物安全,对于该病的防控具有重要的意义。
常新见[4]（2020）在《华东地区猪轮状病毒分子流行病学调查及亚单位疫苗初步研究》文中研究说明猪轮状病毒腹泻是由猪轮状病毒（porcine rotavirus,Po RV）引起的一种以厌食、腹泻、呕吐、脱水为特征的急性传染病。该病多发于寒冷季节,呈地方性流行,各生长阶段的猪均可感染,感染率最高可达90%～100%,给养猪业带来巨大经济损失。目前,Po RV出现了新的基因型,导致现有疫苗对其保护效果不理想。因此,开展Po RV的分子流行病学调查,明确其流行的病毒基因型,研制安全有效的新型疫苗,对防控该病具有重要的意义。鉴于此,本论文开展了以下三方面的研究内容:1.华东地区猪轮状病毒分子流行病学调查:采用本实验室已建立的Po RV RT-PCR检测方法对2017～2019年间华东地区35个规模猪场的594份样品进行检测。结果显示,2017～2019年间华东地区Po RV的平均检出率为16.8%（100/594）;在不同类型的样品中,肠道样品的Po RV检出率最高为19.5%（68/349）;在不同生长阶段猪中,仔猪的Po RV检出率最高为18.5%（70/379）。同时,扩增阳性样品的VP7和VP4基因并测序,进行序列比对、同源性比较及遗传进化分析。结果显示,5个Po RV基因型均为A群G9P7型,与参考毒株NMTL相比,VP7蛋白第100、122、180、309位有氨基酸突变;与参考毒株OSU相比,VP4蛋白在30、137、686、774位有氨基酸突变,且两者均无氨基酸位点插入和缺失。遗传进化分析结果显示,不同地区流行毒株基因型相同,表明G9P7型Po RV可能是主要的流行基因型。2.猪轮状病毒VP4蛋白间接ELSA抗体检测方法的建立:针对VP4蛋白的保守区设计并合成引物,通过PCR、双酶切和测序鉴定后,成功构建了重组原核表达质粒p ET28a-480-VP4*。将该质粒转化到E.coli BL21（DE3）,利用SDS PAGE和Western blot鉴定了该蛋白的表达,利用Ni柱纯化蛋白。以纯化的重组480-VP4*蛋白为抗原建立间接ELISA方法,确定了该方法的最佳包被浓度为2.56μg/m L,待检血清的最佳稀释度为1:80,酶标二抗最佳稀释度为1:10 000。建立的方法与病毒中和试验的总符合率达80.0%;用该方法初步检测了华东地区的临床血清,结果显示华东地区Po RV抗体阳性检出率为87.8%。通过该试验建立的间接ELISA检测方法为Po RV的血清学调查和后续疫苗免疫后的抗体评价提供了一种新的技术手段。3.猪轮状病毒不同截短VP4蛋白免疫原性研究:VP4蛋白具有较好免疫原性,是疫苗研究的主要靶蛋白,本研究分别构建3种截断的VP4蛋白的原核表达载体,同时将破伤风毒素的通用T细胞表位（P2）作为分子佐剂与三个截断VP4蛋白融合表达,成功构建了6个重组原核表达质粒p ET28a-480-VP4*、p ET28a-618-VP4*、p ET28a-1428-VP4*、p ET28a-P2-480-VP4*、p ET28a-P2-618-VP4*及p ET28a-P2-1428-VP4*,将它们分别转化到E.coli BL21（DE3）,利用SDS-PAGE和Western blot确定了蛋白表达,利用Ni柱纯化6个重组蛋白。将6个纯化的重组蛋白与氢氧化铝佐剂以1:1体积混合后制备成亚单位疫苗,通过肌肉注射免疫6周龄小鼠,间隔2周免疫一次,共免疫3次,第3次免疫后2周,扑杀小鼠,并采集免疫前后小鼠血清,利用ELISA检测免疫前后抗体水平的变化,中和试验检测中和抗体水平。结果显示,6个蛋白免疫原性较好,小鼠血清中能产生特异性的抗体,3个截断VP4蛋白的免疫原性强弱依次为618-VP4*、1428-VP4*、480-VP4*,3个融合P2的截断VP4蛋白的免疫原性强弱依次为P2-1428-VP4*、P2-618-VP4*、P2-480-VP4*,但是6个蛋白诱导的中和抗体水平均偏低。将P2导入VP4蛋白后,1428-VP4*的蛋白免疫原性得到增强。通过该试验对不同截断VP4蛋白的免疫原性的研究,为后期研发猪轮状病毒亚单位疫苗奠定了良好的基础。
张赫桐[5]（2020）在《黑龙江省抚远市猪流行性腹泻的调查及防控研究》文中提出猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）是猪的一种以腹泻、呕吐、后期脱水以至死亡为临床症状,由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的急性、高度传染性肠道疾病。哺乳仔猪的死亡率高是本病的典型特征,死亡率可达到50%～100%,是危害养猪业的一种重要疾病。接种疫苗是防控本病的主要手段,在我国则通过接种由PEDV CV777株制备的灭活疫苗或弱毒疫苗,取得了良好的效果。但自2010年冬季以来,猪流性性腹泻出现变异株,导致PEDV CV777株疫苗免疫效果不理想,不能对免疫猪提供良好的保护,使得该病在我国以及美国、韩国等国家大范围暴发,造成数以百万头的哺乳仔猪死亡,造成巨大的经济损失。为了解黑龙江抚远地区的猪流性腹泻的流行情况,本研究采用的形式有问卷调查、血清抗体阳性率和抗原检出率等方式,对该地区的规模化猪场、散养户进行调查,并对市售的不同类型佐剂疫苗的不同接种方式的免疫效果、不同佐剂疫苗的免疫效果进行研究,为该地区不同养殖户对于猪流行性腹泻的防控提供参考。本次调查在2018年09月至2019年09月的时间段内,对抚远地区的抚远镇、浓桥镇、抓吉镇、别拉洪乡、海青乡、鸭南乡、浓江乡、通江乡、寒葱沟镇9个镇（乡）的17个规模化养猪场以及散养殖户136户进行猪流行性腹泻的调查,并进行不同生长阶段的猪群（哺乳仔猪、保育猪、育肥猪、后备母猪和种猪）数据的采集。其中规模化猪场发放17份,回收16份,回收率94.12%;散养殖户共发放136份,回收127份,回收率93.38%。从本次调查的结果来看,在该段时间内,临床诊断为PEDV的养殖厂有6份,占总调查数的5.96%。表明抚远地区存在猪流性腹泻的流行。按照不同生长阶段的猪群、不同季节和不同养殖方式,将采集的病料和血清根据抗原检出率和抗体水平统计分析,结果哺乳仔猪的抗原检出率最高、抗体阳性水平最低,随着猪日龄的增长,抗原检出率逐渐降低、抗体阳性水平逐渐升高,在成年猪阶段（包括后背母猪及种猪）的抗原检出率最低、抗体阳性水平最高;冬春季节病原的检出率较高,猪群的抗体水平较低。夏秋季节病原的检出率较低,猪群的抗体水平较高,猪流行性腹泻在冬春季节更易发生;规模化养殖场无论在抗原检出率还是抗体阳性水平均优于散养户,散养户更要注重猪流行性腹泻的防控。通过疫苗免疫仔猪、母猪的血清抗体水平变化和产后母猪乳汁的IgA（Immunoglobulin A,IgA）抗体水平检测,进行不同接种途径的免疫效果的对比,发现市售的氢氧化铝胶佐剂疫苗和水佐剂疫苗免疫后,接种水佐剂疫苗猪的免疫效果要略好于接种氢氧化铝胶佐疫苗的免疫效果,因此在进行接种的疫苗种类选择上,可以考虑优先选择水佐剂疫苗。使用猪流行性腹泻不同佐剂灭活疫苗的猪场防控效果的调查,黑龙江省抚远地区规模化养殖场和散养户血清阳性率均在80%以上,所采集的组织、粪便等样品的PEDV检出率均不超过6%,表明对PEDV取得了良好的免疫效果;在未免疫的猪群,所采集样品的抗体阳性率不超过20%,所采集的组织、粪便等样品的PEDV检出率超过9%,从中也可以看出疫苗免疫的重要性。另外,无论是规模化猪场还是散养户,接种由经典株制备的铝胶佐剂疫苗,尽管均有着良好的抗体阳性率,但抗原的检出率要显着高于采用变异株制备疫苗接种猪群的抗原检出率。由此可以推断出,抚远地区存在猪流行腹泻病毒变异株的流行,在该地区进行猪流行性腹泻防控的疫苗选择上,建议优先选用由PEDV变异株制备的疫苗来进行本病的防控。
郭倩妤[6]（2020）在《猪消化道主要病毒性疫病mPCR诊断方法的建立及应用》文中研究说明猪消化道类病毒性疫病是近年来生猪养殖生产实践中最为普遍和突出的疾病,已给我国养猪业带来了巨大的危害和损失。许多国内外的研究表明:猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（Porcine transmissible gastro enteritis virus,TGEV）、猪德尔塔冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCoV）、猪轮状病毒A型（Porcine rotavirus groupA,PoRVA）和猪轮状病毒C型（Porcine rotavirus group C,PoRV C）是临床上引起猪消化道腹泻的主要病毒性病原,且常呈现出混合感染或继发感染,导致猪群的高发病率和高死亡率,加大了诊断和防治的难度。为了实现临床对猪消化道主要病毒性疫病多种病原体混合感染的快速确诊,本研究建立了针对上述病原体的五重RT-PCR检测方法并进行了初步应用,为猪消化道病毒性疫病病原的快速诊断和防控提供了有效的技术手段和理论参考依据。主要研究内容如下:1.PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRV C单一RT-PCR检测方法的建立及检测参照Gen Bank上PEDVN（KT323979）、TGEVN（EU074218）、PDCoVN（MH715491）、PoRVAVP6（MH320796）、PoRV CVP6（KJ814472）等基因的部分序列片段,采用Primer Select等相关软件和平台,分别设计了5对用于扩增PEDVN、TGEVN、PDCoVN、PoRVAVP6和PoRV CVP6基因的部分片段的引物,大小分别为799 bp、375 bp、271 bp、525 bp和184 bp。将实验室检测呈PEDV、TGEV、PoRVA阳性的粪便样品及肠道组织等病料提取核酸和生物公司合成的含PDCoVN基因和PoRV C基因的部分片段的阳性质粒,分别以阳性病料的核酸和合成的质粒作为模板,通过对5种病毒单一RT-PCR扩增产物的鉴定,结果扩增出与预期相符的条带。将PEDV、TGEV、PoRVA的RT-PCR产物进行胶回收,并将胶回收后的产物与p MD-19T载体进行连接并转化入感受态细胞,通过对阳性克隆菌的筛选后提取相应的重组质粒,并以其中的5种重组质粒作为反应模板优化对单一病毒的PCR反应退火温度,并对敏感性进行检测,建立了能够用于PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRV C五种常见猪消化道类病毒快速诊断的单一RT-PCR检测方法。结果显示:（1）最佳反应体系:5对引物浓度均为10μmo L/L,TGEV、PDCoV和PoRV C上下游引物各1μL,PEDV和PoRVA上下游引物1.5μL,模板各2μL,金牌Mi X（Green）补足25μL。（2）最佳反应条件为:94℃5 min（预变性）;94℃45 s（变性）;在51.0～60.5℃之间的退火温度条件下,PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRV C单一病毒RT-PCR均可扩增出特异的条带,但55.1℃45 s退火温度最佳;72℃45 s延伸,35个循环;72℃延伸10 min。（3）敏感性结果表明,上述5种病毒模板的最低核酸检测量分别为:PEDV 0.39 pg、TGEV 0.34 pg、PDCoV 0.35pg、PoRVA 0.37 pg和PoRV C 0.34 pg。2.PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRV C五重RT-PCR检测方法的建立在上述建立的PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRV C的五种病毒单一RT-PCR基础上,对PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRV C五重RT-PCR反应的体系进行调整,通过不断摸索模板和引物的用量、浓度以及退火温度的优化,并对五重RT-PCR的特异性、敏感性及重复性进行探索,建立了一种能够同时快速的鉴别PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRV C五种常见猪消化道类病毒性疫病的五重RT-PCR检测方法。结果表明:（1）50μL体积是RT-PCR的最佳反应总体系。两步法的PCR体系为:上下游引物浓度均为10μmol/L,引物量TGEV、PDCoV、PoRV C各0.75μL,PEDV、PoRVA各1μL,模板量TGEV、PDCoV、PoRV C各1μL,PEDV、PoRVA各1.5μL,金牌Mi X（Green）补足50μL;一步法反应体系为:上下游引物浓度均为10μmol/L,引物量TGEV、PDCoV、PoRV C各0.75μL,PEDV、PoRVA各1μL,模板量TGEV、PDCoV、PoRV C各1μL,PEDV、PoRVA各1.5μL,2×1 Step Buffer 25μL,Prime Script One Step Enzyme Mix 2μL,RNase free water 8.5μL。（2）反应条件为:94℃5 min（预变性）;94℃45 s（变性）;55.1℃45 s（退火）;72℃45s（延伸）,35个循环;72℃10min（延伸）是最佳反应条件。（3）特异性、敏感性和重复性试验结果表明:五重RT-PCR能扩增出PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRV C的特异性片段,分别为799 bp、525 bp、271 bp、375 bp和184 bp,未扩增出CSFV、JEV、PCV2、PRV及正常细胞组织的DNA/RNA;五重RT-PCR中各种病毒的最低核酸检测量分别为:PEDV 39 pg、TGEV34 pg、PDCoV35 pg、PoRVA37pg、PoRVC 34 pg。3.PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRV C五重RT-PCR检测方法的初步应用应用所建立的猪主要消化道病毒五重RT-PCR检测方法对2017～2020年间采集自贵州省内不同地区、不同规模化养猪场、农户散养等的临床病料共计523份进行了相关的检测。通过对病料进行检测,比较多重RT-PCR与单一RT-PCR的检测情况,结果表明:来自贵州省不同猪场的523份样品中,阳性率分别为PEDV 26.96%（141/523）、PoRVA13.96%（73/523）、TGEV 1.72%（9/523）、PDCoV 1.53%（8/523）,未检测到PoRV C感染。PEDV+TGEV的二重感染阳性率为1.72%（9/523）,PEDV+PDCoV的二重感染阳性率为1.53%（8/523）,PEDV+PoRVA的二重感染阳性率为1.91%（10/523）,未检测到三重及以上的感染现象,五重RT-PCR检测结果与单一RT-PCR方法的检测结果一致。
赵东红[7]（2020）在《猪流行性腹泻病毒IgA抗体间接ELISA检测方法的建立和应用》文中研究指明猪流行性腹泻（Porcine Epidemic Diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV）引起的一种高度传染性肠道疾病,主要临床特征是急性水样腹泻、呕吐、脱水和体重减轻,各年龄段猪对该病均易感,其中哺乳仔猪的发病率和死亡率可达80%-100%,给养猪业造成巨大的经济损失。新生哺乳仔猪在感染后1-2天内即可引起严重的腹泻症状。由于免疫系统发育不完善,新生哺乳仔猪无法在感染后迅速产生免疫应答,所以母源抗体是新生哺乳仔猪获得被动免疫保护的关键途径。母乳中的分泌型IgA（sIgA）通过消化道进入仔猪肠道,对保护哺乳仔猪肠道黏膜免受PEDV入侵至关重要。因此,建立针对母乳和血清中的IgA抗体的检测方法对于监测仔猪获取的母源抗体量有一定的指导意义。本研究为了建立检测PEDV特异性IgA抗体间接ELISA检测方法,以本实验室前期分离获得的PEDV流行毒株CH/HNPJ/2017（GIIb型）毒株和CH/HBXT/2018（GIIa型）毒株的S1、S2以及N蛋白为基础,分别构建重组质粒并转入E.coli BL21（DE3）大肠杆菌中,在37℃条件下,以终浓度为1 mmol/mL的IPTG进行菌株的诱导表达。ELISA和Western-Blotting检测表明所表达的三种蛋白（PJ-N、PJ-S1和XT-S2）均有良好的抗原性。以纯化的三种蛋白分别作为抗原进行酶标板的制备,建立了三种间接ELISA检测方法,分别命名为PJ-N-iELISA、PJ-S1-iELISA、XT-S2-iELISA。其中PJ-N-iELISA检测FMD和PRRSV阳性血清表明无交叉反应,与间接免疫荧光试验结果的总符合率为85.19%;PJ-S1-iELISA、XT-S2-iELISA与病毒中和试验结果总体符合率分别为86.36%、81.82%。PJ-N-iELISA、PJ-S1-iELISA、XT-S2-iELISA的批间和批内稳定性试验的变异系数均小于11%。用PJ-N-iELISA、PJ-S1-iELISA、XT-S2-iELISA分别对177份仔猪血清样品进行检测,阳性检出率分别为72.32%、79.10%、76.84%;阴性检出率分别为27.68%、20.90%、23.16%。本实验建立的检测方法具有良好的特异性和稳定性,可以为PEDV相关研究提供有效的检测方法,对PEDV的防控、疫苗的合理使用和效果的评价有重要意义。
王震震[8]（2020）在《PEDV合肥株全基因组测序及传代生长特性的分析》文中研究指明猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的一种猪腹泻类病毒性疾病,给养猪业造成了巨大的损失。本研究对疑似PED感染的病料进行病原检测及PEDV分离鉴定,对PEDV分离株进行全基因组测序,并在Vero细胞中传代以探究分离株传代后的生长特性和遗传稳定性,了解PEDV安徽分离株的分子生物学特征和遗传进化情况,为PEDV相关研究提供参考。本研究对仔猪腹泻病料进行鉴定,采用在Vero细胞盲传的方法进行PEDV分离,经RT-PCR、间接免疫荧光和细胞超薄切片进行鉴定。根据PEDV CV777株全基因序列,设计9对覆盖PEDV全基因组的引物,分段克隆测序,对全基因组序列进行分析。将PEDV分离株在Vero细胞连续传代,扩增5、20、40、60和80代病毒液的S和ORF3基因,并对不同代次病毒生长特性进行测定。结果显示,腹泻病料为PED感染,在Vero细胞中盲传到第5代时成功分离出PEDV,命名为AH-2018-HF1。全基因组测序结果显示AH-2018-HF1株全长27 937 bp。与参考毒株相比,AH-2018-HF1株S基因在2319-2320位缺失3 bp（GTT）;与CV777、LZC株相比,AH-2018-HF1株在459-460位缺失3 bp（ATA）;和国内外变异毒株相比,AH-2018-HF1株在174-175位缺失12 bp（CAGGGTGTCAAT）,在461-462位插入6 bp（TGGAAA）。AH-2018-HF1株ORF3基因在245-246位有49个碱基缺失。AH-2018-HF1株E基因在69-70位缺失12 bp（CCTGCTTATTAT）。M、N基因无缺失和插入。同源性分析显示,AH-2018-HF1株与SD-M、HLJBY、JS2008、CV777和Virulebp DR13株核苷酸同源性较高,与变异毒株核苷酸同源性较低。全基因组遗传进化树结果显示,AH-2018-HF1株与SD-M、HLJBY、JS2008在同一分支,亲缘关系最近;与CV777和Virulebp DR13株亲缘关系较近;与PEDV变异株亲缘关系较远。S基因系统进化结果与全基因组系统进化结果相似,S基因可替代全基因组作为PEDV遗传进化分析靶基因。AH-2018-HF1株在Vero细胞中传代至80代时接毒后CPE时间缩短至约20 h,病毒滴度达到108.2TCID50/m L,序列比对分析显示不同代次的S、ORF3基因突变率低。结果表明,AH-2018-HF1株属于经典毒株,但存在一定的变异。AH-2018-HF1株随着在Vero细胞传代次数增加,CPE出现时间缩短,病毒滴度升高,对细胞适应性不断增强,S、ORF3基因在传代中保持高度稳定。
杨朋霞[9]（2020）在《抗PEDV N蛋白单克隆抗体的制备及PEDV灭活疫苗免疫攻毒保护效果的研究》文中研究表明猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea,PED）是由冠状病毒亚科（Coronavirinae）的α冠状病毒属（Alpha Coronavirus）猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的一种急性、高度接触性的肠道传染病。这种病毒可致各阶段的猪均能发病,但危害最为严重的是对10日龄以内的仔猪,临床上常引起仔猪脱水、呕吐和水样腹泻等症状。1971年在英国首先报道该病,随后在多个国家暴发流行。由于经典疫苗毒株CV777灭活苗或弱毒苗的使用,PEDV取得了较好的防控。但是好景不长,2010年冬季有人发现就算免疫过经典疫苗株的养猪场照样能发生该病,原因是PEDV发生了变异,变异毒株引发的严重腹泻病迅速席卷全球,近年来,临床上缺乏针对现行PEDV变异株的有效疫苗,一时间养猪业损失惨重,而该病也成为了危害养猪业的最为严重的疫病。因此,PED的防控具有重要的意义,而检测是防控的主要手段,但目前临床上缺少针对当前流行的PEDV变异毒株检测方法。本研究在GenBank中参照已登录的PEDV N（AF353511）基因序列,经过对比近年来流行株,设计出了一对特异性引物,将扩增后的目的片段（N基因）克隆到pQE-30原核表达载体中,进行表达、纯化,以纯化的重组N蛋白（rN）作为包被抗原,异性和重复性试验。对500份来源于不同猪场临床血清样品进行检测,并将结果与进口商品化试剂盒通过矩阵法优化ELISA反应条件,建立了 PEDV间接ELISA检测方法,并进行敏感性、特比较。结果表明,本研究成功扩增了长度1221bpN基因,表达的rN约为50.4 ku,western blot结果表明该试验所建立的ELISA方法反应原性良好。rN最佳包被浓度为2 μg/mL;血清最佳稀释度为1:100,作用时间1 h;羊抗猪HRP-IgG最适稀释度为1:5000,作用时间为30 min;TMB最佳显色时间为10 min。本方法可特异性检测PEDV抗体,而与PRV、PRRSV、CSFV、PCV、TG EV等病原的阳性血清均无交叉反应;本方法检测出相同血清的最高稀释倍数与中和试验基本一致,具有良好敏感性;批内、批间重复性检验变异系数均小于10%,具有较好的重复性和稳定性。对500份临床猪血清的检测,与进口商品化试剂盒相比符合率为99.6%。本研究为PEDV血清学检测提供了技术手段,也为下一步单克隆抗体（单抗）的筛选奠定基础。本研究按照常规技术免疫小鼠,将小鼠血清倍比稀释用所建立的间接ELISA方法检测小鼠抗体效价,将检测效价大于1:80000的小鼠脾脏充分研磨后过铜网,在PEG1500的作用下与事先培养好的SP2/0细胞进行融合,后将融合细胞铺到96孔板中,逐日观察细胞情况,取每孔上清液用建立的间接ELISA方法进行筛选鉴定,同时进行单抗亚型鉴定,对阳性孔进行5次亚克隆后,筛选出2株亚型为IgG且能稳定分泌抗PEDV N蛋白单抗的杂交瘤细胞株（2D4、6C6）。将杂交瘤细胞扩大培养并注射入小鼠腹腔,收集腹水后对其进行纯化,同时进行SDS-PAGE、稳定性、特异性检测。结果显示:制备腹水纯化后,2株中仅有1株（6C6）,纯度高达95%以上,且其可以特异性地与 PEDV抗原反应,而与PRV、PRRSV、CSFV、PCV、TGEV、大肠杆菌等抗原均不发生交叉反应,特异性良好;经过连续几次传代后,其效价依然可达到1:102400,稳定性好。为进一步建立基于PEDV N蛋白抗体阻断ELISA及应用于临床的胶体金快速检测试纸条的方法奠定了基础。本研究用本实验室分离鉴定得到的病毒制备的灭活疫苗,进行免疫效力试验的研究。选取PEDV血清中和效价<1:4,且FQ-PCR检测为阴性的母猪所产的5日龄仔猪10头,分为2组,每组5头,免疫组口服病毒液（攻毒剂量1000TCID50/mL）,对照组口服相同剂量的DMEM,在攻毒后3d内观察仔猪发病情况。结果显示:试验组均符合腹泻发病要求,对照组均未发病。用制备的灭活疫苗在临床上分别于母猪分娩前45d、分娩前21d和再次配种前7d免疫灭活疫苗,对照组在相同的时间里注射相同剂量的DMEM。选取免疫组和对照组分娩的仔猪进行攻毒免疫保护实验的研究。结果显示:试验组母猪所产仔猪获得的保护率能达到90%,对照组仔猪100%发病,且致死率为30%。且在精神状态、增重率、病原学检测和剖检症状等各方面试验组均比对照组要好。说明本实验室的毒株制备成灭活疫苗免疫接种给母猪,它能给仔猪提供有效保护,可用于当前猪流行性腹泻变异毒株疫苗的研发。
蒋子睿[10]（2019）在《PEDV SNJ-P株的分离鉴定与基因组学研究及S蛋白间接ELISA方法的建立》文中认为猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的一种急性传染病,可引起猪只急性腹泻并迅速脱水、死亡,对哺乳仔猪危害最大。2010年来,PED在世界各地大规模暴发。毒株变异是导致该疫情难以控制的主要原因之一。本研究应用PK-15细胞在腹泻哺乳仔猪肠道内容物中进行病毒分离,通过细胞病变、RT-PCR检测、琼脂糖凝胶扩散试验对细胞培养物进行鉴定,证明获得一株PEDV毒株,命名为SNJ-P。该病毒可在胰酶终浓度为4μg/mL的病毒培养液中培养,盲传至第4代产生细胞病变。继续传代至第7代,细胞稳定出现CPE。传代至第10代,出现CPE时间提前至接毒后12 h。将第15代细胞病毒液收集进行蚀斑纯化,计算出SNJ-P的TCID50为1×10-6.5/mL。观察SNJ-P人工感染哺乳仔猪后的病理学变化及检测各组织器官内病毒核酸载量,制作主要病变器官病理切片。结果表明除肠道以外,肺脏与肝脏内病毒核酸载量最高,呈肠道>肺脏>肝脏。比对多条参考株全基因组序列,设计21对扩增PEDV全基因组序列的引物,扩增SNJ-P分离株的全基因序列。分析各基因片段遗传与变异情况,讨论变异可能造成其产物功能上的变化,从基因层面分析目前疫苗免疫效果不理想原因,为新的疫苗的研发提供理论帮助。建立全基因进化树,分析该毒株与参考毒株的分子遗传进化关系。结果显示SNJ-P与中国株ZL29、CH/HNYF的同源性最高,同源性为98.4%和98.7%。与俄罗斯株Blegorod亲缘关系较远,同源性为90.9%。对分离毒株的S基因进行分析,设计了1对引物扩增其抗原性较高的抗原决定簇基因区（689794 aa）,构建pET-32a（+）-SJ重组表达质粒。诱导表达得到大小为35 kD的重组S蛋白,鉴定其为包涵体,利用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒对该蛋白进行纯化,获得浓度为1.145 mg/mL的重组蛋白。对其进行Western-blotting鉴定,证明其具有良好的抗原性。将纯化的重组蛋白作为包被抗原,优化各反应条件,建立检测PEDV血清抗体的间接ELISA方法。判定标准为OD450nm≥0.324为阳性,反之为阴性。与市售试剂盒符合率为96.67%。该方法特异性良好,重复性高,且成本低。可用于临床PEDV血清抗体检测以及PEDV流行病学的监测,对本病的预防具有重要意义。
二、猪流行性腹泻病毒分子生物学特征（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、猪流行性腹泻病毒分子生物学特征（论文提纲范文）
（1）猪流行性腹泻病毒COE亚单位疫苗制备及免疫原性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文词缩略表 |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 第一章 猪流行性腹泻病毒研究进展 |
| 1.1 猪流行性腹泻病毒概述 |
| 1.2 猪流行性腹泻病毒基因组结构 |
| 1.3 猪流行性腹泻病毒的几种关键蛋白 |
| 1.4 猪流行性腹泻病毒流行病学 |
| 1.5 猪流行性腹泻病毒疫苗研究进展 |
| 第二章 免疫佐剂研究进展 |
| 2.1 CpG-ODN研究进展 |
| 2.2 Curdlan研究进展 |
| 试验研究 |
| 第三章 猪流行性腹泻病毒COE基因合成及生物信息学分析 |
| 3.1 试验方法 |
| 3.1.1 PEDV S蛋白COE基因设计与合成 |
| 3.1.2 COE基因生物信息学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 PEDV S蛋白COE基因合成 |
| 3.2.2 COE基因生物信息学分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 猪流行性腹泻病毒COE基因原核表达与真核表达 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 主要菌种和载体 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 目的基因与表达载体重组构建 |
| 4.2.2 真核质粒pcDNA3.1-COE在293T细胞中的表达 |
| 4.2.3 重组COE蛋白的原核表达 |
| 4.2.4 重组COE蛋白的纯化 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 目的基因与载体质粒酶切 |
| 4.3.2 重组质粒酶切验证 |
| 4.3.3 真核表达质粒在基因水平表达 |
| 4.3.4 重组COE蛋白表达及纯化 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 猪流性腹泻病毒COE亚单位疫苗免疫原性分析 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 试验动物 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 试验动物分组及免疫 |
| 5.2.2 样品采集与处理方法 |
| 5.2.3 免疫效果评价 |
| 5.2.4 统计学分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 间接ELISA法确定抗原最佳包被浓度 |
| 5.3.2 血清中特异性IgG抗体水平变化 |
| 5.3.3 粪便中特异性SIgA抗体水平变化 |
| 5.3.4 唾液中特异性SIgA抗体水平变化 |
| 5.3.5 血清中细胞因子IFN-γ和IL-4 水平变化 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一:试验方法说明 |
| 附录二:常用试剂配制方法说明 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 附件 |
（2）猪流行性腹泻病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及遗传进化分析（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 PEDV的病原学特点 |
| 1.1.1 PEDV的形态及理化特征 |
| 1.1.2 PEDV的分类 |
| 1.2 PEDV的分子生物学 |
| 1.2.1 PEDV的复制酶基因及其蛋白 |
| 1.2.2 PEDV的 ORF3 基因及其蛋白 |
| 1.2.3 PEDV的S基因及其蛋白 |
| 1.2.4 PEDV的M基因及其蛋白 |
| 1.2.5 PEDV的N基因及其蛋白 |
| 1.2.6 PEDV的E基因及其蛋白 |
| 1.3 PEDV的流行病学 |
| 1.4 PEDV的临床症状和病理变化 |
| 1.4.1 临床症状 |
| 1.4.2 病理变化 |
| 1.5 PEDV的防控 |
| 1.5.1 PEDV传统疫苗 |
| 1.5.2 PEDV基因工程疫苗 |
| 1.6 PEDV的诊断技术 |
| 1.7 本研究的目的意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料来源 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要配制试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 PEDV荧光定量RT-PCR检测方法的建立 |
| 2.2.1.1 引物和探针的设计 |
| 2.2.1.2 样品处理 |
| 2.2.1.3 病毒RNA的提取 |
| 2.2.1.4 反转录聚合酶链式反应 |
| 2.2.1.5 扩增产物的回收 |
| 2.2.1.6 回收产物的连接 |
| 2.2.1.7 连接产物的转化 |
| 2.2.1.8 质粒的提取 |
| 2.2.1.9 PEDV-N基因标准质粒的制备 |
| 2.2.1.10 荧光定量RT-PCR标准品的制备 |
| 2.2.1.11 荧光定量RT-PCR的建立和条件优化 |
| 2.2.1.12 荧光定量RT-PCR标准曲线的建立 |
| 2.2.1.13 荧光定量RT-PCR的敏感性检测 |
| 2.2.1.14 荧光定量RT-PCR的特异性检测 |
| 2.2.1.15 荧光定量RT-PCR的重复性检测 |
| 2.2.1.16 临床样品的检测 |
| 2.2.2 六株PEDV流行株S基因的遗传进化分析 |
| 2.2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2.2 样品模板的制备 |
| 2.2.3.3 PEDV S基因的RT-PCR扩增 |
| 2.2.3.4 PEDVS基因的遗传进化分析 |
| 2.2.3 SDLY01株的分离与鉴定 |
| 2.2.3.1 PEDV流行株的分离 |
| 2.2.3.2 间接免疫荧光(IFA) |
| 2.2.4 PEDV SDLY1801 株全基因组序列测定及拼接 |
| 2.2.4.1 SDLY1801序列的分段扩增与测序 |
| 2.2.4.2 PEDV SDLY1801 毒株遗传进化分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 基于N基因的PEDV荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 3.1.1 荧光定量PCR标准品的构建 |
| 3.1.2 实时荧光定量RT-PCR的建立和条件优化 |
| 3.1.3 标准曲线的建立 |
| 3.1.4 实时荧光定量PCR的敏感性检测 |
| 3.1.5 实时荧光定量PCR的特异性检测 |
| 3.1.6 实时荧光定量PCR的重复性检测 |
| 3.1.7 临床样品PEDV检测结果 |
| 3.2 六株PEDV流行株S基因的分段扩增及分析 |
| 3.2.1 PEDV毒株S基因的RT-PCR分段扩增 |
| 3.2.2 PEDV毒株S基因的核苷酸和氨基酸同源性分析 |
| 3.2.3 PEDV毒株S基因的变异情况分析 |
| 3.2.4 PEDV毒株S基因的遗传进化分析 |
| 3.3 PEDV SDLY1801 的分离与鉴定与遗传进化分析 |
| 3.3.1 PEDV SDLY1801 的分离与鉴定 |
| 3.3.2 PEDV SDLY1801 毒株的IFA鉴定 |
| 3.3.3 PEDV SDLY1801 的全基因扩增结果 |
| 3.3.4 PEDV SDLY1801 株基因组结构分析 |
| 3.3.5 PEDV SDLY1801 株基因组同源性与遗传进化分析 |
| 3.3.6 PEDV SDLY1801株S基因同源性与遗传进化分析 |
| 3.3.7 PEDV SDLY1801株M基因同源性与遗传进化分析 |
| 3.3.8 PEDV SDLY1801株N基因同源性与遗传进化分析 |
| 3.3.9 PEDV SDLY1801株E基因同源性与遗传进化分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 PEDV特异性荧光定量RT-PCR方法的建立 |
| 4.2 山东部分地区PEDV流行株S基因的序列分析 |
| 4.3 山东部分地区PEDV SDLY1801 株的分离鉴定与病毒基因序列分析 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）福建省某猪场猪流行性腹泻的检测与防治（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 PED研究进展 |
| 1.1 病原特征 |
| 1.2 PEDV基因组结构与功能 |
| 1.3 流行病学 |
| 1.4 临床表现 |
| 1.5 致病机制 |
| 1.6 诊断方法 |
| 1.6.1 病毒分离 |
| 1.6.2 血清学试验 |
| 1.6.3 分子生物学检测 |
| 1.7 防治措施 |
| 1.7.1 预防 |
| 1.7.2 治疗 |
| 1.7.3 制定科学的免疫程序 |
| 1.7.4 检测淘汰措施 |
| 第二章 发病猪场猪流行性腹泻的诊断 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 背景 |
| 1.2 材料 |
| 1.2.1 样品采集 |
| 1.2.2 试剂耗材 |
| 1.2.3 仪器 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 核酸提取及反转录 |
| 1.3.2 RT-PCR检测 |
| 1.3.3 不同阶段猪群PEDV病毒载量分析 |
| 1.3.4 水质检测 |
| 1.3.5 数据的处理与分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 临床症状观察及剖检病理变化 |
| 2.2 猪流行性腹泻RT-PCR检测结果 |
| 2.3 猪传染性胃肠炎RT-PCR检测结果 |
| 2.4 猪轮状病毒RT-PCR检测 |
| 2.5 猪代尔塔冠状病毒RT-PCR检测 |
| 2.6 猪瘟荧光定量PCR检测结果 |
| 2.7 猪蓝耳荧光定量PCR检测结果 |
| 2.8 猪伪狂犬荧光定量PCR检测结果 |
| 2.9 猪圆环荧光定量PCR检测结果 |
| 2.10 不同阶段猪群PEDV病毒载量分析 |
| 2.11 水质检测 |
| 3 讨论 |
| 第三章 福建某猪场PEDV同源性分析及防控 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 病料 |
| 1.1.2 材料 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 PCR检测 |
| 1.2.2 PCR产物测序分析 |
| 1.2.3 疫情处理 |
| 1.2.4 荧光定量PCR分析处理后哺乳仔猪粪便中的病毒情况 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 PCR产物测序结果 |
| 2.2 紧急免疫效果 |
| 3.讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）华东地区猪轮状病毒分子流行病学调查及亚单位疫苗初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 轮状病毒形态及分子生物学特征研究 |
| 1.1 轮状病毒形态 |
| 1.2 轮状病毒分子生物学特征 |
| 2 猪轮状病毒的诊断方法研究进展 |
| 2.1 猪轮状病毒的临床诊断方法 |
| 2.2 猪轮状病毒实验室诊断方法 |
| 3 猪轮状病毒病流行现状 |
| 4 猪轮状病毒疫苗研究进展 |
| 4.1 猪轮状病毒灭活苗 |
| 4.2 猪轮状病毒弱毒活疫苗 |
| 4.3 猪轮状病毒新型疫苗 |
| 5 研究目的和意义 |
| 第二章 华东地区猪轮状病毒分子流行病学调查 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 样品来源 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 RT-PCR检测 |
| 1.4 数据处理与分析 |
| 1.5 VP7 和VP4 基因克隆与序列鉴定 |
| 1.6 VP7 基因和VP4 基因序列分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 华东地区猪轮状病毒病流行病学调查 |
| 2.2 VP7 和VP4 基因序列分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 猪轮状病毒抗体ELISA检测方法的建立与初步应用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 样品来源 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 PoRV480-VP4*基因原核表达载体的构建与转化 |
| 1.4 重组480-VP4*蛋白的表达、纯化及鉴定 |
| 1.5 重组480-VP4*蛋白浓度测定 |
| 1.6 间接ELISA最佳反应条件的筛选 |
| 1.7 间接ELISA的临界值 |
| 1.8 特异性试验 |
| 1.9 敏感性试验 |
| 1.10 重复性试验 |
| 1.11 与中和抗体检测的比对试验 |
| 1.12 间接ELISA检测临床猪血清样品 |
| 2 结果 |
| 2.1 Po RV480-VP4*基因原核表达载体的构建 |
| 2.2 重组Po RV480-VP4*蛋白SDS PAGE和 Western Blot试验 |
| 2.3 间接ELISA最佳反应条件的筛选 |
| 2.4 间接ELISA的临界值 |
| 2.5 特异性试验 |
| 2.6 敏感性试验 |
| 2.7 重复性试验 |
| 2.8 与中和抗体检测的比对试验结果 |
| 2.9 间接ELISA检测临床猪血清样品结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 猪轮状病毒不同截短VP4 蛋白免疫原性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 样品来源 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 引物设计及目的基因扩增 |
| 1.4 不同的重组基因原核表达载体的构建与转化 |
| 1.5 重组蛋白诱导表达、纯化及鉴定 |
| 1.6 纯化的重组蛋白浓度测定 |
| 1.7 疫苗制备 |
| 1.8 试验动物及免疫接种 |
| 1.9 血清ELISA抗体检测 |
| 1.10 血清中和抗体检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组表达质粒RT-PCR产物及双酶切产物电泳结果 |
| 2.2 重组蛋白的表达 |
| 2.3 重组蛋白Western Blot试验 |
| 2.4 纯化的重组蛋白Western Blot试验 |
| 2.5 纯化的重组蛋白浓度测定结果 |
| 2.6 血清ELISA抗体检测结果 |
| 2.7 血清中和抗体检测结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（5）黑龙江省抚远市猪流行性腹泻的调查及防控研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 猪流行性腹泻病毒的病原学 |
| 1.1.1 分类学地位及其粒子结构 |
| 1.1.2 基因组结构 |
| 1.1.3 病毒的理化与培养特性 |
| 1.1.4 病毒的致病机理 |
| 1.2 猪流行性腹泻的流行病学 |
| 1.2.1 猪流行性腹泻国外的流行与发展情况 |
| 1.2.2 猪流行性腹泻在国内的流行与发展情况 |
| 1.2.3 猪流行性腹泻的流行特点 |
| 1.3 猪流行性腹泻病毒的检测方法 |
| 1.3.1 病原学诊断 |
| 1.3.2 血清学诊断 |
| 1.3.3 分子生物学诊断 |
| 1.4 猪流行性腹泻疫苗的研究进展 |
| 1.4.1 灭活疫苗 |
| 1.4.2 弱毒疫苗 |
| 1.4.3 基因工程疫苗 |
| 1.5 猪流行性腹泻的防控 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 样品来源 |
| 2.1.2 疫苗 |
| 2.1.3 主要试剂和检测试剂盒 |
| 2.1.4 主要实验仪器与设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 问卷调查 |
| 2.2.2 猪流行性腹泻分子生物学检测 |
| 2.2.3 猪流行性腹泻血清抗体检测 |
| 2.2.4 不同佐剂疫苗不同接种途径免疫效果的对比研究 |
| 2.2.5 不同佐剂疫苗对猪流行性腹泻防控的研究 |
| 2.2.6 数据处理与统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 调查问卷的发放与回收 |
| 3.2 猪流行性腹泻分子生物学检测结果 |
| 3.2.1 猪流行性腹泻的临床表现与剖检变化 |
| 3.2.2 不同生长阶段猪分子生物学检测结果 |
| 3.2.3 不同季节猪分子生物学检测结果 |
| 3.2.4 不同养殖方式猪流行性腹泻分子生物学检测结果 |
| 3.3 猪流行性腹泻血清抗体的调查结果 |
| 3.3.1 不同生长阶段猪流行性腹泻血清抗体的检测结果 |
| 3.3.2 不同季节猪流行性腹泻血清抗体的检测结果 |
| 3.3.3 不同养殖方式猪流行性腹泻血清抗体的检测结果 |
| 3.4 不同佐剂流行性腹泻疫苗不同接种途径免疫效果的比较 |
| 3.4.1 不同佐剂猪流行性腹泻疫苗肌肉注射的免疫效果 |
| 3.4.2 不同佐剂流行性腹泻后海穴注射的免疫效果 |
| 3.5 不同佐剂疫苗对猪流行性腹泻防的控效果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 黑龙江省抚远地区PED的流行病学特点 |
| 4.2 不同检测方法在猪流行性腹泻流行病学调查中的应用 |
| 4.3 疫苗的免疫效果 |
| 4.3.1 不同类型佐剂对疫苗免疫效果的影响 |
| 4.3.2 不同接种途径对疫苗免疫效果的影响 |
| 4.4 不同佐剂疫苗猪流行性腹泻的防控效果 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（6）猪消化道主要病毒性疫病mPCR诊断方法的建立及应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 猪主要消化道类病毒概述 |
| 1.1 猪流行性腹泻病毒 |
| 1.1.1 PEDV病原学特征及基因组结构 |
| 1.1.2 PEDV编码蛋白 |
| 1.2 猪传染性胃肠炎病毒 |
| 1.2.1 TGEV病原学特征及基因组结构 |
| 1.2.2 TGEV编码蛋白 |
| 1.3 猪德尔塔冠状病毒 |
| 1.3.1 PDCoV病原学特征及基因组结构 |
| 1.3.2 PDCoV编码蛋白 |
| 1.4 猪轮状病毒 |
| 1.4.1 PoRV病原学特征及基因组结构 |
| 1.4.2 PoRV编码蛋白 |
| 1.4.3 PoRV分群 |
| 2 猪消化道类病毒分子生物学检测方法研究进展 |
| 2.1 猪消化道病毒性疫病常规RT-PCR方法研究进展 |
| 2.1.1 猪流行性腹泻病毒常规RT-PCR方法研究进展 |
| 2.1.2 猪传染性胃肠炎病毒常规RT-PCR方法研究进展 |
| 2.1.3 猪德尔塔冠状病毒常规RT-PCR方法研究进展 |
| 2.1.4 猪轮状病毒常规RT-PCR方法研究进展 |
| 2.2 猪消化道病毒性疫病实时荧光定量RT-PCR方法研究进展 |
| 2.2.1 猪流行性腹泻病毒实时荧光定量RT-PCR方法研究进展 |
| 2.2.2 猪传染性胃肠炎病毒实时荧光定量RT-PCR方法研究进展 |
| 2.2.3 猪德尔塔冠状病毒实时荧光定量RT-PCR方法研究进展 |
| 2.2.4 猪轮状病毒实时荧光定量RT-PCR方法研究进展 |
| 2.3 猪消化道病毒性疫病环介导等温扩增(LAMP)方法研究进展 |
| 2.3.1 猪流行性腹泻病毒环介导等温扩增(LAMP)方法研究进展 |
| 2.3.2 猪传染性胃肠炎病毒环介导等温扩增(LAMP)方法研究进展 |
| 2.3.3 猪德尔塔冠状病毒环介导等温扩增(LAMP)方法研究进展 |
| 2.3.4 猪轮状病毒环介导等温扩增(LAMP)方法研究进展 |
| 2.4 猪消化道病毒性疫病重组酶聚合酶扩增(RPA)方法研究进展 |
| 2.4.1 猪流行性腹泻病毒重组酶聚合酶扩增(RPA)方法研究进展 |
| 2.4.2 猪传染性胃肠炎病毒重组酶聚合酶扩增(RPA)方法研究进展 |
| 2.4.3 猪德尔塔冠状病毒重组酶聚合酶扩增(RPA)方法研究进展 |
| 2.5 猪消化道病毒性疫病基因芯片检测方法研究进展 |
| 2.5.1 猪流行性腹泻病毒基因芯片检测方法研究进展 |
| 2.5.2 猪传染性胃肠炎病毒基因芯片检测方法研究进展 |
| 2.5.3 猪轮状病毒因芯片检测方法研究进展 |
| 2.6 猪消化道病毒性疫病多重PCR检测方法研究进展 |
| 2.6.1 二重PCR检测方法研究进展 |
| 2.6.2 三重PCR检测方法研究进展 |
| 2.6.3 四重及以上PCR检测方法研究进展 |
| 3 本研究的目的和意义 |
| 第二章 PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA及 PoRVC单重RT-PCR检测方法的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒来源 |
| 1.2 病料来源 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要实验仪器 |
| 1.5 主要溶液的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物的设计与合成 |
| 2.2 病料的处理 |
| 2.3 病毒核酸的提取及cDNA模板的制备 |
| 2.4 病毒核酸的PCR扩增 |
| 2.5 PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRVC目的基因的鉴定 |
| 2.5.1 目的基因的回收纯化 |
| 2.5.2 目的基因与pMD19-T载体的连接 |
| 2.5.3 重组质粒的转化 |
| 2.5.4 重组质粒的抽提及鉴定 |
| 2.6 单一病毒PCR检测方法的建立 |
| 2.6.1 单一病毒PCR反应体系的建立 |
| 2.6.2 单一病毒PCR反应条件的优化 |
| 2.6.3 单一病毒PCR的敏感性试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRVC目的基因的鉴定 |
| 3.2 单一病毒RT-PCR检测方法的建立 |
| 3.2.1 单一病毒RT-PCR反应体系的建立 |
| 3.2.2 单一病毒RT-PCR扩增结果 |
| 3.2.3 单一病毒的RT-PCR反应条件的优化 |
| 3.2.4 单一病毒RT-PCR敏感性检测 |
| 3.3 单一RT-PCR检测方法对临床样本的检测 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三章 规模化猪场猪消化道主要病毒五重RT-PCR方法的建立与初步应用研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 模板来源 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 1.4 试验使用的主要溶液的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物的设计与合成 |
| 2.2 五重RT-PCR反应体系的建立 |
| 2.2.1 五重RT-PCR反应体系的建立 |
| 2.2.2 五重RT-PCR反应退火温度的优化 |
| 2.2.3 五重RT-PCR反应敏感性试验 |
| 2.2.4 五重RT-PCR反应特异性试验 |
| 2.2.5 五重RT-PCR反应特异性试验 |
| 2.2.6 五重RT-PCR试剂盒的组装 |
| 2.3 五重RT-PCR对临床病料的检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 五重RT-PCR反应体系的建立 |
| 3.1.1 五重RT-PCR最佳反应体系 |
| 3.1.2 五重RT-PCR退火温度的优化 |
| 3.1.3 五重RT-PCR反应敏感性试验 |
| 3.1.4 五重RT-PCR反应特异性试验 |
| 3.1.5 五重RT-PCR反应重复性试验 |
| 3.2 五重RT-PCR对临床病料的检测 |
| 4 猪消化道主要病毒五重RT-PCR试剂盒的组装 |
| 4.1 阳性对照的制备 |
| 4.2 阴性对照的制备 |
| 4.3 反应液的制备 |
| 4.4 试剂盒说明 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 主要参考文献 |
| 附录一 攻读硕士学位期间参与发表的论文 |
| 附录二 攻读硕士学位期间参与的课题 |
| 附录三 本文用到的部分英文缩写及含义说明 |
| 致谢 |
（7）猪流行性腹泻病毒IgA抗体间接ELISA检测方法的建立和应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 猪流行性腹泻概况 |
| 1.1.1 猪流行性腹泻病毒分类、基因组成及蛋白质组成 |
| 1.1.2 猪流行性腹泻病毒的理化性质和细胞培养特性 |
| 1.1.3 猪流行性腹泻病毒发病机制及机体的免疫应答 |
| 1.1.4 猪流行性腹泻病毒流行病学、传播特点及预防措施 |
| 1.2 猪流行性腹泻病毒检测方法的研究进展 |
| 1.3 本研究的目的及意义 |
| 第二章 猪流行性腹泻病毒结构蛋白表达及鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 载体及菌株 |
| 2.1.2 实验试剂及耗材 |
| 2.1.3 溶液的配置 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 阳性单克隆菌株的获取及鉴定 |
| 2.2.2 阳性单克隆菌株的诱导表达及菌液回收 |
| 2.2.3 蛋白的纯化条件探究及抗原性鉴定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 单克隆菌株的获取及鉴定结果 |
| 2.3.2 蛋白的纯化条件探究及反应原性鉴定结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 间接ELISA方法的建立及应用 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 蛋白、细胞及病毒 |
| 3.1.2 实验试剂及耗材 |
| 3.1.3 溶液的配置 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 间接ELISA检测条件的优化 |
| 3.2.2 临界值的测定 |
| 3.2.3 符合率的测定 |
| 3.2.4 特异性的测定 |
| 3.2.5 稳定性的测定 |
| 3.2.6 在检测临床血清样品中的应用 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 间接ELISA检测条件的确定 |
| 3.3.2 临界值的确定 |
| 3.3.3 符合率检测结果 |
| 3.3.4 特异性检测结果 |
| 3.3.5 稳定性检测结果 |
| 3.3.6 三种检测方法在临床血清样品检测中的应用及效果比对结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（8）PEDV合肥株全基因组测序及传代生长特性的分析（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要缩略词对照表 |
| 文献综述 |
| 1 猪流行性腹泻的概述 |
| 2 PEDV基因组结构特征 |
| 3 PEDV基因分型和流行情况 |
| 4 PED诊断和防治 |
| 5 结语 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料与细胞 |
| 2.1.2 主要试剂和试剂配置 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 样品处理 |
| 2.2.2 病毒RT-PCR鉴定 |
| 2.2.3 病毒的分离鉴定 |
| 2.2.4 PEDV分离株的全基因组序列测定 |
| 2.2.5 PEDV AH-2018-HF1株传代生长特性测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 病毒RT-PCR鉴定结果 |
| 3.2 病毒的分离鉴定 |
| 3.2.1 细胞病变观察 |
| 3.2.2 病料感染细胞RT-PCR结果 |
| 3.2.3 间接免疫荧光鉴定 |
| 3.2.4 细胞超薄切片观察 |
| 3.3 病毒全基因组序列测定及分析 |
| 3.3.1 全基因组分段PCR检测 |
| 3.3.2 重组质粒PCR鉴定 |
| 3.3.3 AH-2018-HF1株全基因组序列拼接结果 |
| 3.3.4 病毒全基因组序列分析 |
| 3.3.5 S基因序列分析 |
| 3.3.6 ORF3基因序列分析 |
| 3.3.7 E基因序列分析 |
| 3.3.8 M基因序列分析 |
| 3.3.9 N基因序列分析 |
| 3.4 AH-2018-HF1株传代的生长特性测定 |
| 3.4.1 病毒液RT-PCR鉴定 |
| 3.4.2 细胞脱落时间观察 |
| 3.4.3 病毒滴度测定 |
| 3.4.4 病毒传代过程中稳定性结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 PEDV的分离鉴定 |
| 4.2 全基因组序列分析 |
| 4.3 AH-2018-HF1株传代的生长特性 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（9）抗PEDV N蛋白单克隆抗体的制备及PEDV灭活疫苗免疫攻毒保护效果的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 文献综述 |
| 1 流行病学 |
| 1.1 临床流行病学 |
| 1.2 分子流行病学 |
| 2 PEDV病原学 |
| 2.1 PEDV分类 |
| 2.2 形态结构 |
| 2.3 理化性质 |
| 2.4 细胞培养特性 |
| 2.5 基因组结构 |
| 2.5.1 ORF3基因与相关蛋白功能 |
| 2.5.2 PEDV ORF1ab基因与相关蛋白功能 |
| 2.5.3 PEDV S基因与编码蛋白功能 |
| 2.5.4 M基因与相关蛋白功能 |
| 2.5.5 PEDV E基因与编码蛋白功能 |
| 2.5.6 PEDV N基因与编码蛋白功能 |
| 3 PEDV的病理变化与发病机理 |
| 4 变异株的流行特征 |
| 5 PED的诊断技术 |
| 5.1 病毒的分离鉴定 |
| 5.2 血清学检测方法 |
| 5.3 病毒核酸检测 |
| 6 疫苗研究进展 |
| 6.1 灭活疫苗 |
| 6.2 弱毒疫苗 |
| 6.3 联苗 |
| 6.4 基因工程苗 |
| 7 单抗在PEDV诊断中的应用 |
| 引言 |
| 试验1 基于PEDVN蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病毒和血清 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物设计与合成 |
| 1.2.2 PEDV N基因的扩增及表达载体的构建 |
| 1.2.3 重组N(rN)蛋白的表达、纯化及western blot分析 |
| 1.2.4 间接ELISA方法条件的优化 |
| 1.2.5 阴性样品临界值的确定 |
| 1.2.6 特异性分析 |
| 1.2.7 敏感性分析 |
| 1.2.8 重复性分析 |
| 1.2.9 临床样品检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 PEDV N基因的扩增及表达载体的构建 |
| 2.2 rN蛋白的表达、纯化及western blot分析 |
| 2.3 间接ELISA方法优化结果 |
| 2.4 阴性样品临界值的确定 |
| 2.5 特异性试验结果 |
| 2.6 敏感性试验结果 |
| 2.7 重复性试验结果 |
| 2.8 临床样品检测结果 |
| 3 讨论与分析 |
| 试验2 抗PEDV N蛋白单克隆抗体的制备 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞、病毒和实验动物 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 免疫抗原的制备 |
| 1.2.2 小鼠的免疫 |
| 1.2.3 免疫小鼠血清效价的检测 |
| 1.2.4 建立杂交瘤细胞株 |
| 1.2.4.1 先制备饲养细胞 |
| 1.2.4.2 SP2/0细胞的准备 |
| 1.2.4.3 脾细胞的制备 |
| 1.2.4.4 细胞融合 |
| 1.2.4.5 阳性杂交瘤细胞的筛选 |
| 1.2.4.6 亚型的鉴定 |
| 1.2.4.7 亚克隆 |
| 1.2.5 杂交瘤细胞特异性检测 |
| 1.2.6 杂交瘤细胞稳定性检测 |
| 1.2.7 腹水的制备及纯化 |
| 1.2.8 纯化腹水的效价测定 |
| 1.2.9 纯化腹水的特异性检测 |
| 1.2.10 纯化腹水的稳定性检测 |
| 1.2.11 阻断ELISA方法的初步鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 小鼠效价检测结果 |
| 2.2 杂交瘤细胞株的建立 |
| 2.3 单抗亚型的鉴定 |
| 2.4 杂交瘤细胞特异性检测 |
| 2.5 杂交瘤细胞稳定性检测 |
| 2.6 腹水的制备及纯化 |
| 2.7 纯化腹水的效价测定 |
| 2.8 纯化腹水的特异性测定 |
| 2.9 纯化腹水的稳定性测定 |
| 2.10 阻断ELISA方法的鉴定 |
| 3 讨论与分析 |
| 试验3 PEDV(变异毒株)灭活疫苗免疫攻毒保护效果的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病毒与试验动物 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 仔猪攻毒试验 |
| 1.2.2 妊娠母猪攻毒仔猪获得免疫保护试验 |
| 1.2.3 仔猪腹泻发病指标 |
| 2 结果 |
| 2.1 仔猪攻毒实验 |
| 2.2 妊娠母猪攻毒仔猪获得免疫保护试验 |
| 3 讨论与分析 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 个人简历 |
（10）PEDV SNJ-P株的分离鉴定与基因组学研究及S蛋白间接ELISA方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 猪流行性腹泻概述 |
| 1.1 国内外PEDV的流行现状 |
| 1.2 PEDV生物学特性 |
| 1.2.1 PEDV分类及病毒粒子结构 |
| 1.2.2 PEDV基因结构特征 |
| 1.2.3 PEDV结构基因及产物功能 |
| 1.2.4 PEDV非结构基因及产物功能 |
| 1.3 PEDV分离培养 |
| 1.4 PEDV诊断与防制 |
| 1.5 本研究的目的及意义 |
| 第二章 PEDV的分离鉴定及动物回归试验 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 细胞及实验动物 |
| 1.2 病料采集 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 PEDV阳性病料的筛选 |
| 2.1.1 病料检测引物合成 |
| 2.1.2 病毒RNA提取 |
| 2.1.3 反转录合成c DNA |
| 2.1.4 RT-PCR检测 |
| 2.2 PEDV的分离培养 |
| 2.2.1 细胞的复苏 |
| 2.2.2 细胞的传代培养 |
| 2.2.3 细胞的冻存 |
| 2.2.4 PK-15 细胞对胰酶耐受性测定 |
| 2.2.5 原代病毒液的制备 |
| 2.2.6 PEDV病毒液的接毒与盲传 |
| 2.3 PEDV分离株的纯化及滴度测定 |
| 2.3.1 病毒蚀斑纯化试验 |
| 2.3.2 病毒滴度测定 |
| 2.4 PEDV分离株的鉴定 |
| 2.4.1 分离株RT-PCR鉴定 |
| 2.4.2 琼脂糖凝胶扩散试验 |
| 2.5 动物回归试验及各组织器官病毒核酸载量的检测 |
| 2.5.1 动物回归试验及病理学观察 |
| 2.5.2 仔猪各组织器官病毒核酸载量检测 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 病料检测结果 |
| 3.2 PEDV分离鉴定 |
| 3.2.1 细胞胰酶耐受试验 |
| 3.2.2 PEDV的分离与培养 |
| 3.3 病毒的纯化及滴度测定 |
| 3.3.1 病毒蚀斑纯化试验 |
| 3.3.2 病毒TCID50 测定 |
| 3.4 分离株的鉴定 |
| 3.4.1 分离株RT-PCR鉴定 |
| 3.4.2 琼脂糖凝胶扩散试验 |
| 3.5 动物回归试验及各组织器官病毒核酸载量的检测 |
| 3.5.1 动物回归试验及病理学观察 |
| 3.5.2 相对荧光定量法的建立 |
| 3.5.3 仔猪器官组织病毒核酸载量 |
| 4 讨论 |
| 第三章 SNJ-P全基因测序分析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验主要试剂 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 SNJ-P全基因扩增引物的设计与合成 |
| 2.2 5 ’UTR与3'UTR c DNA的合成 |
| 2.3 5 'UTR与3'UTR序列扩增 |
| 2.4 SNJ-P全基因分段克隆 |
| 2.4.1 PCR产物的纯化回收 |
| 2.4.2 重组质粒构建 |
| 2.4.3 全基因序列分析 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 全基因组序列拼接及分析 |
| 3.2 各序列片段遗传与变异情况 |
| 3.2.1 5 'UTR与3'UTR基因变异情况 |
| 3.2.2 非结构基因变异情况 |
| 3.2.3 结构基因 |
| 4 讨论 |
| 第四章 PEDV S截段基因原核表达 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 毒株、菌种、质粒及抗体 |
| 1.2 试验主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 SJ基因重组质粒的克隆鉴定 |
| 2.1.1 引物的设计 |
| 2.1.2 目的基因SJ的 PCR鉴定 |
| 2.1.3 重组质粒pMD-19T-SJ的构建与鉴定 |
| 2.2 重组表达质粒构建与鉴定 |
| 2.2.1 pET-32a(+)的提取、酶切与回收 |
| 2.2.2 pET-32a(+)酶切片段与SJ基因片段连接 |
| 2.2.3 重组表达质粒鉴定 |
| 2.3 重组蛋白的诱导表达 |
| 2.3.1 pET-32a(+)-SJ重组菌的制备 |
| 2.3.2 pET-32a(+)-SJ重组菌初步表达 |
| 2.3.3 重组蛋白可溶性鉴定 |
| 2.4 重组蛋白诱导条件优化 |
| 2.4.1 重组蛋白诱导时间的优化 |
| 2.4.2 重组蛋白诱导IPTG浓度的优化 |
| 2.5 重组蛋白的纯化 |
| 2.6 纯化蛋白浓度的测定 |
| 2.7 重组表达蛋白的免疫印迹分析 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 SJ基因重组质粒的克隆鉴定 |
| 3.2 重组表达质粒鉴定 |
| 3.3 重组蛋白的诱导表达 |
| 3.3.1 重组菌的初步表达及可溶性鉴定 |
| 3.4 重组蛋白诱导条件的优化 |
| 3.5 重组蛋白纯化及浓度测定 |
| 3.6 重组蛋白Western-blotting分析 |
| 4 讨论 |
| 第五章 猪流行性腹泻S蛋白间接ELISA方法的建立 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 蛋白与血清 |
| 1.2 试验主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 ELISA主要试剂的配制 |
| 2 试验方法 |
| 2.2 ELISA常规步骤 |
| 2.3 PEDV S蛋白间接ELISA方法的建立 |
| 2.3.1 抗原最佳包被浓度与血清最佳稀释度的确定 |
| 2.3.2 最佳包被条件的确定 |
| 2.3.4 最佳封闭时间的确定 |
| 2.3.5 最佳酶标抗体稀释度的确定 |
| 2.3.6 最佳显色时间的确定 |
| 2.3.7 标准临界值的确定 |
| 2.3.8 重复性试验 |
| 2.3.9 特异性试验 |
| 2.3.10 符合率试验 |
| 2.3.11 临床的初步应用 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 PEDV S蛋白间接ELISA方法的建立 |
| 3.1.1 抗原最佳包被浓度和阴阳性血清的稀释浓度的确定 |
| 3.1.2 最佳包被条件的确定 |
| 3.1.3 最佳包被液的确定 |
| 3.1.4 最佳封闭液的确定 |
| 3.1.5 最佳封闭时间的确定 |
| 3.1.6 最佳酶标抗体稀释度的确定 |
| 3.1.7 最佳酶标抗体孵育时间的确定 |
| 3.1.8 最佳底物显色时间时间的确定 |
| 3.1.9 间接ELISA判定标准的确定 |
| 3.1.10 重复性试验 |
| 3.1.11 特异性试验 |
| 3.1.12 符合性试验 |
| 3.1.13 临床血清检测结果 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
四、猪流行性腹泻病毒分子生物学特征（论文参考文献）
- [1]猪流行性腹泻病毒COE亚单位疫苗制备及免疫原性分析[D]. 郭涛. 石河子大学, 2021(02)
- [2]猪流行性腹泻病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及遗传进化分析[D]. 鞠泳政. 山东农业大学, 2020(02)
- [3]福建省某猪场猪流行性腹泻的检测与防治[D]. 吴龙成. 福建农林大学, 2020(06)
- [4]华东地区猪轮状病毒分子流行病学调查及亚单位疫苗初步研究[D]. 常新见. 西藏大学, 2020(12)
- [5]黑龙江省抚远市猪流行性腹泻的调查及防控研究[D]. 张赫桐. 东北农业大学, 2020(07)
- [6]猪消化道主要病毒性疫病mPCR诊断方法的建立及应用[D]. 郭倩妤. 贵州大学, 2020
- [7]猪流行性腹泻病毒IgA抗体间接ELISA检测方法的建立和应用[D]. 赵东红. 中国农业科学院, 2020
- [8]PEDV合肥株全基因组测序及传代生长特性的分析[D]. 王震震. 安徽农业大学, 2020(04)
- [9]抗PEDV N蛋白单克隆抗体的制备及PEDV灭活疫苗免疫攻毒保护效果的研究[D]. 杨朋霞. 河南农业大学, 2020(06)
- [10]PEDV SNJ-P株的分离鉴定与基因组学研究及S蛋白间接ELISA方法的建立[D]. 蒋子睿. 四川农业大学, 2019(01)