一、NGF对体外培养人血管内皮细胞细胞周期和PCNA表达的影响（论文文献综述）
刘春洁[1]（2020）在《绵羊卵泡颗粒细胞中POSTN基因的表达调控及功能研究》文中研究说明调控卵巢卵泡发育是提高动物繁殖效率的主要途径之一。哺乳动物卵泡发育过程中,99.9%以上的卵泡会发生闭锁退化并消失,早期的一些报道指出,卵泡闭锁与卵泡颗粒细胞（Granulosa cell,GCs）凋亡密切相关,但GCs凋亡调控机制仍不完全清楚。本课题组前期采用FSH超排处理成年母羊,获得不同直径卵泡液和GCs,基于RNA-seq高通量测序和iTRAQ定量蛋白组学联合分析发现,随着卵泡直径的增加,卵泡液和GCs中POSTN表达量逐渐升高。因此提出假设:卵泡发育过程中,FSH与POSTN可能存在一定的相关性,但其具体调节机制尚不清楚。本论文以绵羊卵泡及GCs为研究对象,系统地探究POSTN在卵泡发育过程中表达规律及FSH-POSTN存在的表达调控机制,主要试验结果如下:1.绵羊POSTN基因cDNA的克隆及表达分析。绵羊中克隆出1557 bp长的POSTN cDNA序列,可编码由518个氨基酸组成的蛋白,克隆的绵羊POSTN与牦牛和奶牛同源性较近。POSTN基因在绵羊心、肝、脾、肺、肾、肌肉、子宫和卵巢组织中均有表达,其中卵巢组织中表达量较高,而且随着卵泡直径增加,POSTN表达量逐渐升高,且在卵泡中的GCs中呈高表达。免疫荧光染色发现POSTN在GCs的细胞核和细胞质中都有分布。试验进一步利用RAI法检测不同直径卵泡液和GCs中激素与POSTN含量变化,结果显示,POSTN在不同直径卵泡液和GCs中的变化与FSH存在显着正相关性,表明POSTN可能参与调节卵泡发育进程,而这一过程可能受FSH影响。2.FSH对绵羊卵泡GCs中POSTN的表达具有调节作用。采用10 ng/mL FSH对体外培养GCs处理24 h,能显着增加GCs中POSTN表达,并加速细胞增殖进程,减少其凋亡,还有效促进GCs增殖相关基因PCNA、Ccnd-2和抗凋亡相关基因Bcl-2表达。另外,敲减GCs中POSTN基因,能显着降低FSH条件下引起的POSTN表达上调,并抑制GCs增殖、分化过程,增加其凋亡,同时下调GCs增殖分化基因PCNA、Ccnd-2与抗凋亡基因Bcl-2的转录,上调凋亡相关基因Bim、FasL和Caspase-3的表达。3.FSH通过PI3K-AKT-FOXO1信号通路调控POSTN表达。检测FSH涉及的多条信号通路,发现绵羊卵泡GCs中FSH主要通过激活PI3K、AKT和FOXO1信号通路影响POSTN表达,进而抑制GCs凋亡。进一步分析PI3K、AKT和FOXO1三者关系,结果显示FSH处理能同时激活这三种激酶活性;阻断PI3K或AKT后,FSH对FOXO1激活作用被阻断;而阻断FOXO1后,PI3K和AKT活性不受影响。PI3K抑制剂能同时阻断FSH对AKT和FOXO1的诱导,而AKT抑制剂能阻断FOXO1活性但不能阻断PI3K活性。另外还发现阻断AKT后,POSTN的表达量显着降低,即使加入10 ng/mL FSH在24 h内也无法恢复上调POSTN的转录,未能完全挽救GCs凋亡过程。4.FSH通过调节转录因子SRF调控POSTN表达。分析POSTN转录调控区,发现POSTN上游-1至-387 bp区域内包含1个SRF和1个JunD结合位点,进一步对结合位点定点突变分析,发现位于-222至-210的SRF结合位点突变明显降低了POSTN转录活性;同时还发现10 ng/mL FSH处理GCs 24 h后,能促进SRF表达,实现POSTN转录增强,该结果与ChIP分析结果相一致。因此推测,适量FSH一定时间内可能通过调节转录因子SRF调控POSTN表达,表明SRF可能是FSH调节POSTN表达以促进GCs生长的核心因子。综上所述,本论文主要围绕POSTN在绵羊卵泡GCs凋亡及卵泡闭锁中的作用及其分子调控机制进行了研究,建立了 FSH、POSTN,GCs凋亡和卵泡存活之间的联系,发现了 FSH-PI3K-AKT-FOXO1信号轴与GCs中POSTN表达的调控机制。本论文结果有助于进一步阐明卵泡存活/闭锁的分子机制,也为提高家畜繁殖效率提供新的理论基础。
郭长权[2]（2020）在《细胞因子bFGF和LIF对雏鸡原始卵泡发育的调节作用及其机理的研究》文中提出家禽卵巢中早期卵泡的发育与卵母细胞及颗粒细胞之间的物质传递和信息通讯密切相关,而细胞因子在其中扮演了重要的媒介作用。细胞因子能促进细胞的增殖和生长,而且还可以调节细胞的迁移、分化和有丝分裂。细胞因子包含很多种类,各种细胞因子经由旁分泌或自分泌以及卵母细胞和颗粒细胞间的物质运输、信号通讯对卵泡形成发育产生作用:调控颗粒细胞的增殖分化、激素分泌和其他细胞因子生成等。而细胞因子参与家禽早期卵泡生长发育相关的研究很少。同时家禽的繁殖性能是畜牧业上比较关注的问题,而早期卵泡发育对于最终的繁殖性能是有决定性影响的。所以对细胞因子在早期卵泡发育中的调控作用开展深入研究是有意义的。本实验以雏鸡为研究对象,检测雏鸡卵泡发育中基因的表达量变化以及利用已经建立的体外培养的卵巢模型来研究两种细胞因子,即碱性成纤维细胞生长因子（Basic fibroblast growth factor,bFGF）和白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor,LIF）在雏鸡早期卵泡发育中的调控作用和其中的机理,为家禽产蛋性能的后续研究提供理论依据。1.雏鸡卵巢早期卵泡发育中miRNA表达的变化雏鸡早期卵泡的形成和发育涉及许多基因表达的变化。本实验以不同日龄的雏鸡卵巢作为实验样品,利用RNA-seq的实验技术来研究早期雏鸡卵巢中miRNA的表达。取D0、D4、D7的雏鸡卵巢各三个,用于RNA-seq分析。在RNA-seq建库结果中对miRNA进行质检,筛选出有显着差异表达的基因来进行RT-qPCR的验证,验证结果是趋势一致,RNA-seq结果可信。结果显示,与D0卵巢组织相比较,D4卵巢组织共有10种表达显着差异的miRNA,包括8条上调基因,2条下调基因;与D0卵巢组织相比较,D7卵巢组织共有50种表达显着差异的miRNA,包括35条上调基因,15条下调基因;与D4卵巢组织相比较,D7卵巢组织共有18种表达显着差异的miRNA,包括12条上调基因,6条下调基因。对差异表达miRNA的靶基因做汇总,结果显示,D4vs D0中,靶基因与细胞的抗凋亡和细胞因子作用相关;D7vs D0中,靶基因与细胞抗凋亡、细胞因子作用和激素合成相关;D7vs D4中,靶基因与缝隙连接、细胞因子作用、MAPK信号通路相关,其中涉及的靶基因有GJA5、HLF、MAP3K14等。上述结果表明,miRNA可通过缝隙连接、细胞抗凋亡、卵巢发育信号相关通路和细胞因子作用等方面来影响雏鸡卵泡的发育。2.雏鸡卵巢早期卵泡发育中lncRNA表达的变化本实验以不同日龄的雏鸡卵巢作为实验材料,用RNA-seq来分析雏鸡卵巢中lncRNA水平随时间的变化。并像上一章一样筛选出有显着差异表达的基因并用RT-qPCR来进行验证,使用GO数据库把有表达差异的lncRNA靶基因做富集处理分析,使用KEGG数据库给表达差异的lncRNA靶基因做通路注释。结果显示,与D0卵巢组织相比较,D4卵巢组织共有106种表达显着差异的基因,包括65条上调基因,41条下调基因;与D0卵巢组织相比较,D7卵巢组织共有305种表达显着差异的基因,包括214条上调基因,91条下调基因;与D4卵巢组织相比较,D7卵巢组织共有109种表达显着差异的基因,包括52条上调基因,57条下调基因。RT-qPCR的验证实验证实了 RNA-seq结果的可靠性。GO数据库的结果表明差异表达的lncRNA靶基因大多富集于抗原受体介导的信号通路、细胞因子的合成和非膜跨蛋白酪氨酸激酶活性等生理活动,KEGG数据库结果显示差异的表达lncRNA靶基因大多与细胞因子-细胞因子受体间的相互作用、细胞黏附分子和卵泡发育相关的信号通路有关。其中D7 vs D4结果显示,不少靶基因为细胞因子或细胞因子受体的lncRNA表达明显增加,其中包括了FGF2,IL6R以及GDF9等。上述结果表明,lncRNA可通过细胞因子、细胞连接以及卵泡生长相关的信号通路等方面促进早期雏鸡卵泡的形成和发育,其中相关的细胞因子有FGF2,LIF和GDF9等。3.bFGF对雏鸡原始卵泡发育的调控作用许多细胞因子在雌性原始卵泡激活的过程中发挥重要的促进作用。而RNA-seq结果显示,D4雏鸡卵巢发育到D7的过程中表达明显增加的lncRNA的靶基因中有FGF2。同时先前也有研究报道,FGF2在大鼠中可以促进原始卵泡的激活。FGF2在禽类调节原始卵泡激活的作用研究很少。本实验检测了细胞因子bFGF和FSH对原始卵泡发育的相互刺激作用及其可能的信号机制,包括蛋白激酶B（AKT）和细胞外调节蛋白激酶（ERK）通路。对4日龄雏鸡卵巢进行3天的bFGF和FSH处理,观察bFGF和FSH对卵泡发育的影响。本研究采用HE染色、免疫组化、实时定量PCR（qRT-PCR）、Western blot、免疫荧光等方法。在鸡早期卵巢中发现,bFGF受体（FGFR1）mRNA表达和原始卵泡激活的时间进程之间有变化的相关性。bFGF与FSH的相互刺激作用在原始卵泡的激活过程中表现为促进颗粒细胞的增殖、减少细胞的凋亡。FGFR1的抑制剂SU5402减弱了 bFGF的促进作用,降低了生长卵泡的比例。AKT和ERK信号通路介导了 bFGF和FSH促进原始卵泡激活的作用。上述研究结果表明,细胞因子bFGF和FSH通过PI3K-AKT和ERK信号通路对鸡早期卵巢颗粒细胞的增殖和抗凋亡产生相互刺激作用,促进原始卵泡激活。4.LIF对雏鸡原始卵泡发育的调控作用RNA-seq结果显示,D4雏鸡卵巢发育到D7的过程中表达明显增加的lncRNA的靶基因也有IL6R,IL6R与LIF的受体组成有关。LIF对雏鸡原始卵泡激活的作用研究较少。本实验检测了细胞因子LIF和bFGF在原始卵泡发育过程中的作用和相互之间的关联,以及涉及到的信号通路,包括了 AKT、ERK和Wnt/β-catenin信号通路。对出雏后4天的雏鸡进行卵巢组织的取材,并用LIF和bFGF单独或者联合处理3天,观察卵泡发育情况的变化。本研究采用HE染色、免疫组化、Western blot、透射电镜、免疫荧光等实验方法。结果显示,LIF以及其受体（LIFR）蛋白表达的变化与早期卵泡的发育过程之间有一定的时间相关性。LIF和bFGF的对于促进原始卵泡的激活有一定的协同作用,而具体的表现是促进卵泡细胞的增殖、同时减少卵泡细胞的凋亡。而LIFR的抑制剂SC144能够抑制LIF的这种促进原始卵泡激活的作用。同时AKT和ERK信号通路也参与了 LIF和bFGF这两者促增殖抑凋亡的过程,而Wnt/β-catenin信号通路在其中也有一定的介导作用。上述研究结果表明,LIF和bFGF可通过促进雏鸡卵泡细胞的增殖和抑制其凋亡,并产生协同作用从而促进原始卵泡的激活,这一过程中会涉及到AKT,ERK和Wnt/β-catenin信号通路。本实验利用RNA-seq来检测雏鸡卵巢卵泡发育过程中基因表达量的变化,将有显着表达差异的lncRNA与miRNA汇总并进行对比补充,发现在雏鸡原始卵泡激活阶段,靶基因与FGF2和LIF有关的lncRNA表达显着增加;利用已建立的卵巢组织体外培养模型,研究bFGF和LIF在雏鸡卵巢中原始卵泡激活的调控作用,发现FSH与bFGF发挥协同作用,可通过PI3K-AKT和ERK信号通路对雏鸡早期卵巢中颗粒细胞的增殖和抗凋亡的刺激作用从而促进卵泡激活;而LIF和bFGF可通过协同作用促进卵泡细胞增殖并抑制其凋亡,再通过AKT、ERK和Wnt/β-catenin信号通路促进卵泡激活。这些结果将为后续深入研究家禽卵泡发育的调控机制以及提高家禽产蛋性能奠定一定的理论基础。
徐兴丽[3]（2020）在《血管重塑性疾病模型中NONO蛋白作用及其基因调控的机制》文中研究表明1研究背景目前,心血管疾病目前已成为发达国家最常见的致死疾病,而动脉粥样硬化是心血管疾病的主要病理原因。对于危及生命的冠状动脉粥样硬化患者,血管成形术、支架植入术、动脉粥样硬化斑块切除和旁路移植术等手术治疗仍然是不可缺少的手段。然而,机械损伤后导致的血管再狭窄是限制患者预后的最突出的病理问题。血管再狭窄是以血管中膜层增厚导致动脉新生内膜形成为特征的血管性疾病。术后血管再狭窄是位于手术扩张局部血管中膜平滑肌细胞移行至内膜并在内膜增殖,产生大量细胞外基质,造成血管内膜明显增厚,从而形成新生内膜收缩型和合成型两种表现为特征的血管重塑性疾病。因此,探讨VSMCs增殖、迁移及表型转化的影响因素和分子机制在血管新生内膜导致的血管再狭窄的防治中具有重要意义。NONO（即人p54nrb）是一个无POU结构域的八聚体结合蛋白,与SFPQ、PSPC1蛋白和长非编码RNA NEAT1共同构成DBHS蛋白家族。NONO蛋白具有RRMs、NOPS和卷曲螺旋结构域,可作为转录因子或剪切因子参与蛋白-蛋白互作和蛋白-核酸互作,在DNA损伤、RNA合成和转录调控等方面发挥重要的生物学作用。近年来研究发现,NONO还参与了乳腺癌、黑色素瘤、神经母细胞瘤、主动脉夹层及动脉粥样硬化等多种疾病。NONO作为一种多功能核蛋白,还被证实参与自身免疫性疾病的炎症因子分泌等多种病理过程。我们在前期的研究发现,过表达NONO蛋白明显抑制ApoE-/-小鼠粥样硬化斑块纤维帽的形成、抑制斑块内胶原的沉积,进而导致斑块的不稳定,促进ApoE-/-小鼠粥样硬化斑块的进展;而降低NONO蛋白的表达,通过促进胶原沉积、抑制炎症因子的表达水平,发挥稳定粥样硬化斑块的作用。然而NONO蛋白对血管新生内膜的作用及机制尚未明确,仍需进一步探索。2研究目的（1）检测NONO蛋白在人体冠状动脉组织和小鼠新生内膜组织中的表达水平;（2）检测NONO对正常幼年小鼠血管形态的影响;（3）检测NONO蛋白缺失对小鼠颈动脉结扎导致的血管新生内膜的影响;（4）探索NONO对血管新生内膜影响的潜在机制。3研究方法3.1利用CRISPR/Cas9技术获得NONO基因敲除小鼠本实验室姜虹教授利用CRISPR/Cas9技术在C57BL/6J背景小鼠中得到NONOgt/0敲基因小鼠。NONO基因位于X染色体,通过杂合母鼠NONOgt/+和野生型WT雄鼠杂交,获得NONOgt/0敲基因小鼠及其同窝对照的NONO+/0野生WT雄鼠。3.2颈动脉结扎小鼠模型的构建稳定繁殖10代后的NONO敲基因鼠及其同窝对照WT雄鼠为本实验中的所有研究用鼠。9-10周NONO基因敲除小鼠及同窝对照WT雄鼠于左侧颈动脉结扎21天后取材。3.3动物取材腹腔注射戊巴比妥钠麻醉小鼠,称量体重后固定。心尖取血后留取血清,检测总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL-C）和高密度脂蛋白（HDL-C）水平。生理盐水充分灌流后,留取小鼠心脏、肝脏、脾脏、肾脏及两侧颈动脉,置于4%多聚甲醛或液氮中保存。颈动脉组织于甲醛固定24小时后流水冲洗,梯度酒精脱水后石蜡包埋。石蜡切片机进行5 μm连续切片。3.4组织蛋白提取采用Invent MinuteTM蛋白提取试剂盒,将液氮保存的人冠脉组织及小鼠组织放入离心管套柱中,按照1mg组织对应10μl体积的比例加入变性总蛋白提取裂解液,用研磨棒充分研磨后高速离心获得组织蛋白。采用BCA试剂盒检测蛋白浓度,加入蛋白上样缓冲液后99℃煮沸10 min使蛋白变性。3.5组织切片染色颈动脉切片分别进行苏木素-伊红（H&E）染色、Verhoeff氏酒精苏木素染色、免疫组织化学染色及组织免疫荧光染色。测量血管新生内膜面积、新生内膜内平滑肌细胞、巨噬细胞和内皮细胞的含量、NONO表达水平的检测、PCNA及Ki67等增值指标表达水平的检测、SPHK1及S1PR1等迁移指标表达水平的检测。3.6小鼠原代平滑肌细胞VSMCs的提取与培养5-6周大小的NONOgt/0敲基因小鼠及其同窝对照的WT雄鼠用于提取小鼠原代平滑肌细胞。剥离、冷PBS清洗小鼠的主动脉后,采用组织贴壁法提取VSMCs,在含20%胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）的高糖DMEM培养基培养并按照常规方法传代。3.7人原代平滑肌细胞HASMCs的培养HASMCs购买于美国ScienCell公司,采用SMCM培养基培养并按常规方法传代。3.8 VSMCs细胞迁移的检测采用细胞划痕实验和Transwell细胞迁移实验检测有无20ng/ml的PDGF-BB刺激对WT和NONO KO的VSMCs细胞迁移的影响3.9 VSMCs细胞增殖的检测采用细胞周期检测试剂盒和CCK8检测20ng/ml的PDGF-BB对WT和NONO KO的VSMCs细胞周期及细胞增殖能力的影响。3.10逆转录荧光定量PCR（RT-PCR）组织RNA采用Qiagen的RNA提取试剂盒提取。细胞RNA采用Fastagen的RNA提取试剂盒提取。步骤均参照试剂盒说明书。Nanodrop检测RNA浓度后,采用Takara反转录试剂盒获得cDNA,SYBR及特异性引物进行实时定量PCR,检测NONO、PCNA、p21、SPHK1、S1PR1、α-SMA、CNN1、SM22α的 mRNA 表达水平。3.11细胞免疫荧光细胞免疫荧光检测20ng/ml的PDGF-BB对WT和NONO KO的VSMCs细胞诱导的Erkl/2表达水平及细胞核转位的影响。3.12 蛋白质印记法（Western blot,WB）收集人冠脉组织及小鼠动脉组织和细胞,提取蛋白,检测组织NONO及VSMCs细胞内 NONO、PCNA、p21、α-SMA、SM22α、p-MEK1、t-MEK1、p-Erk1/2、t-Erk1/2的蛋白表达水平,以GAPDH作为内参。3.13蛋白质免疫共沉淀（Co-IP）适用于IP实验的RIPA及PMSF裂解VSMCs细胞蛋白,检测20ng/ml的PDGF-BB刺激细胞后NONO与Erk1/2相互结合的情况。3.14人冠状动脉组织的获取冠状动脉组织来自山东大学齐鲁医院心血管实验室。从器官供者的移植心脏获取冠状动脉,并在手术室内以最短的缺血时间（<15分钟）进行处理。由经验丰富的心脏外科医生根据器官供者冠状动脉粥样硬化的不同程度,将动脉段划分为健康或病变。研究方案由山东大学齐鲁医院科研伦理委员会批准科研伦理号:KYLL-2016-333。3.15统计分析实验数据均以均数±标准误表示。应用SPSS 19和Graphpad Prism 5软件进行统计学分析及作图。对于符合正态分布的两组样本间比较采用独立样本t检验,多样本间比较采用单因素方差分析One-way ANOVA检验,其下的各组间事后检验采用Dunnett’s多重检验;对于不符合正态分布的样本比较采用非参数检验。双侧P<0.05认为具有统计学差异。4研究结果4.1 NONO在人体狭窄的冠脉组织和WT小鼠颈动脉结扎组织中的表达增加人体粥样硬化斑块导致的狭窄冠脉组织中NONO的RNA水平及蛋白水平均显着高于正常冠脉组织中NONO的表达水平（P<0.05）;在WT小鼠颈动脉结扎后内膜新生的动脉组织NONO的RNA水平及蛋白水平均明显高于对侧正常的小鼠颈动脉组织（P<0.05）。4.2 NONO蛋白主要分布在平滑肌细胞内人粥样硬化斑块导致的狭窄冠脉组织及WT小鼠颈动脉结扎导致血管新生内膜的组织免疫荧光染色显示,NONO与SM22α的荧光共定位最多,推测在狭窄的冠脉及内膜新生组织中,NONO蛋白主要分布在平滑肌细胞内。4.3 NONO基因敲除小鼠及其同窝对照小鼠的基本情况通过CRISPR/Cas9技术在C57BL/6J背景小鼠中得到NONOgt/0敲基因小鼠。NONOgt/0雄鼠的体重、出生率和存活率严重低于同窝对照的WT雄鼠,此外,与WT小鼠相比,NONO KO小鼠的颅面形态也发生了变化。在NONOgt/0敲基因小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、脑及主动脉血管等组织中均不存在NONO蛋白的表达。9-10周龄的NONO基因敲除小鼠及其同窝对照小鼠的血清TC、TG、LDL-C及HDL-C表达水平无统计学差异,提示NONO对小鼠的血脂水平无影响。但NONO基因敲除小鼠的体重明显低于同窝对照的WT小鼠（P<0.05）,提示NONO对小鼠的生长发育有影响。4.4 NONO蛋白不参与小鼠血管形态的维持NONO蛋白缺失会导致小鼠体重减轻,但对血管形态的维持无影响。分别取4周、5周、6周龄NONOgt/0敲基因小鼠及其同窝对照WT雄鼠的左侧颈动脉H&E染色,显示2组小鼠血管内径及血管中膜厚度均无显着差异。此外,NONO蛋白缺失会影响DBHS蛋白家族PSPC1的表达,对SFPQ的表达量无影响。4.5 NONO蛋白缺失抑制小鼠结扎血管的内膜新生Verhoeff染色显示NONO蛋白缺失明显抑制了小鼠结扎颈动脉血管的内膜新生（P<0.05）。4.6 NONO蛋白缺失抑制血管平滑肌细胞的增殖组织免疫荧光染色及组织化学染色显示,NONO蛋白缺失通过抑制Ki67及PCNA的表达明显抑制血管新生内膜病理过程中的细胞增殖作用（P<0.05）。体外培养原代VSMCs的实验结果进一步显示,NONO蛋白缺失明显抑制PDGF-BB刺激下细胞周期中的合成期（S期）、抑制细胞增殖（P<0.05）,同时WB及PCR结果显示NONO KO能显着抑制PDGF-BB刺激下的VSMCs中PCNA表达量（P<0.05）,显着增加p21的表达量（P<0.05）。4.7 NONO蛋白缺失抑制血管平滑肌细胞的迁移和表型转换组织化学染色显示,NONO蛋白缺失通过抑制SPHK1及S1PR1的表达明显抑制血管新生内膜病理过程中的细胞迁移作用（P<0.05）。体外培养原代VSMCs的实验结果进一步显示,NONO蛋白缺失明显抑制细胞迁移（P<0.05）,PCR结果显示NONO KO明显抑制PDGF-BB刺激下的VSMCs中SPHK1及S1PR1的表达量显着下降（P<0.05）。同时WB及PCR结果显示,PDGF-BB刺激的NONO KO的VSMCs中平滑肌收缩表型α-SMA、CNN1、SM22α的表达水平显着增加（P<0.05）。4.8 NONO蛋白与Erk1/2相互作用共同调控血管新生内膜中VSMCs的作用细胞免疫荧光染色显示,在PDGF-BB的刺激下,WT VSMCs中Erk1/2发生明显核转位,而NONO KO能够显着抑制Erk的核转位。免疫共沉淀检测发现NONO蛋白能够与Erk1/2蛋白相互结合。WB结果进一步显示,NONO KO降低PDGF-BB刺激下Erk1/2的磷酸化表达水平。5结论（1）血管新生内膜的NONO蛋白主要存在于平滑肌细胞中,NONO蛋白缺失明显抑制血管重塑的病理过程;（2）NONO蛋白缺失对血管的完整性无影响;（3）NONO蛋白缺失通过抑制VSMCs的增殖、迁移、细胞表型转化,抑制新生内膜,并通过抑制Erk1/2的磷酸化水平发挥作用。1研究背景腹主动脉瘤（AAA）是一种慢性退行性血管疾病,病人常突发动脉瘤破裂、猝死等严重并发症。目前,世界上每年至少20万人死于AAA,而其中瘤体破裂出血占AAA患者死因的90%。对于AAA瘤体巨大的患者而言,外科手术进行血管修复是目前唯一可行的办法;而对于瘤体较小的患者,仍缺乏行之有效的药物治疗或手术替代疗法。AAA的病理过程包括细胞外基质（ECM）受损及炎性反应。血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）是肾素-血管紧张素系统的重要调控因子,促进AAA的基质降解、慢性炎症浸润及血管重塑。一方面,转化生长因子β（TGF-β）信号转导通路的失活通过抑制ECM合成及促进基质降解,促进AAA的病理性发展。而TGF-β1通过促进胶原合成的关键限速酶辅氨酰-4-羟化酶α1（P4Hα1）的合成促进胶原的合成。另一方面,AAA组织炎性细胞的浸润增加基质金属蛋白酶（MMPs）活性导致ECM的降解,进而加剧AAA的发展。本实验室首次发现肿瘤坏死因子α（TNF-α）通过ASK-JNK-NONO信号通路直接抑制P4Hα1的活性,抑制胶原合成;并首次提出NONO蛋白参与动脉粥样硬化（AS）的病理过程,同时通过与NF-κB p65蛋白相互作用调控AS的炎症反应。NONO（即人p54nrb）作为核蛋白,参与DNA损伤修复、RNA转运及翻译调控等基因调控过程,是一个多功能的高度保守蛋白。NONO蛋白作为cAMP信号通路的重要组成部分,调控cAMP下游TNF-α及白介素6（IL-6）的表达。一方面,NONO下调人主动脉平滑肌细胞（HASMCs）及小鼠AS斑块P4Hα1的表达,抑制ECM合成;另一方面,NONO与NF-κB p65相互作用加剧AS的炎症反应并参与不稳定斑块的形成。这两方面的作用均表明,NONO可能参与AAA的病理过程,而目前尚无相关研究。由此,我们推测通过NONO蛋白的敲减可能会通过增加胶原沉积及抑制炎症反应发挥抑制AAA病理过程的作用。2研究目的（1）探索NONO在AAA中的分布及作用;（2）观察NONO敲减后对AAA病理过程的影响;（3）探索NONO敲减对AAA的作用机制。3研究方法3.1分离并培养小鼠原代血管平滑肌细胞（VSMCs）将6周龄ApoE-/-雄性小鼠主动脉剥离后,剥去动脉外膜及内膜,冷PBS加1%青链霉素清洗三遍后,将血管用无菌维纳斯剪成长度为1mm左右的动脉组织,在含20%胎牛血清（FBS）的高糖培养基（DMEM）中贴壁培养,7天后换液。第3～9代的小鼠原代VSMCs用于本实验研究。3.2小干扰RNA（siRNA）及干扰慢病毒的制备无义序列的小干扰RNA（si-NC）作为阴性对照,NONO干扰序列的小干扰RNA（si-NONO）如下:CCCACCAACAACTGAACGTTTCTCGAGAAACGTTCA GTTGTTGGTGGG。利用含有 pHelper 1.0 和 pHelper 2.0 的 siRNA 表达载体,在293T细胞中构建慢病毒（LV）。在293T细胞中转染si-RNA48小时后,收集病毒上清并将其通过0.45孔径的醋酸纤维素针式过滤器过滤。通过对293T细胞GFP阳性细胞进行荧光激活细胞分选分析,检测病毒载体的滴度。按照病毒感染复数（MOI）=100的比例,利用NONO干扰慢病毒转染VSMCs。病毒转染3天后收集细胞蛋白检测转染效率或用于不同实验研究。3.3动物造模8周龄ApoE-/-雄性小鼠购于北京维通利华动物实验中心,遵循山东大学齐鲁医院伦理委员会要求饲养小鼠并造模。在22℃室温12h白天/12h黑夜齐鲁医院心血管实验室动物中心高脂（0.25%胆固醇加15%可可脂）喂养小鼠。本实验共包括三个部分:第一部分:20只8周龄ApoE-/-雄性小鼠随机分为对照组（n=10）和AAA组（n=10）。高脂喂养4周后对照组小鼠继续高脂喂养4周获得对照组模型;AAA组小鼠通过高脂喂养4周后皮下埋入渗透泵（Alzet model 2004）泵注Ang Ⅱ（1.44mg/kg/d）4周获得小鼠AAA组。用以检测小鼠AAA组织中NONO蛋白的表达量。第二部分:20只8周龄ApoE-/-雄性小鼠随机分为以下四组。无尾静脉注射慢病毒且无Ang Ⅱ泵注高脂喂养4周后取材（n=5）;高脂喂养初期尾静脉注射sh-NC慢病毒（2 × 107TU/只）并高脂喂养4周后取材（n=5）;高脂喂养初期尾静脉注射sh-NC慢病毒（2 × 107 TU/只）并高脂喂养4周后皮下埋入渗透泵泵注Ang Ⅱ（1.44mg/kg/d）2周后取材（n=5）;高脂喂养初期尾静脉注射sh-NC慢病毒（2 × 107 TU/只）并高脂喂养4周后皮下埋入渗透泵泵注Ang Ⅱ（1.44mg/kg/d）4周后取材（n=5）时取材,均用于检测GFP荧光强度,明确转染效率。第三部分:100只8周龄ApoE-/-雄性小鼠随机分为对照组（n=25）、Ang Ⅱ组（NT 组,n=25）、Ang Ⅱ+sh-NC 组（sh-NC 组,n=25）、以及 Ang Ⅱ+sh-NONO组（sh-NONO组,n=25）。其中,对照组小鼠无尾静脉注射慢病毒且无Ang Ⅱ泵注高脂喂养8周后取材;NT组于高脂喂养初期尾静脉注射0.9%生理盐水4周后皮下埋入渗透泵泵注Ang Ⅱ（1.44mg/kg/d）4周后取材,sh-NC组于高脂喂养初期尾静脉注射sh-NC（2 × 107TU/只）的阴性对照慢病毒4周后皮下埋入渗透泵泵注Ang Ⅱ（1.44mg/kg/d）4周后取材,sh-]NO]NO组于高脂喂养初期尾静脉注射sh-NONO（2 × 107 TU/只）的干扰慢病毒4周后皮下埋入渗透泵泵注Ang Ⅱ（1.44mg/kg/d）4 周后取材。3.4小鼠体重及血脂水平的检测分别于实验前及试验结束时称量ApoE-/-小鼠体重。左室心尖部抽血留取血清,分别检测总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL-C）和高密度脂蛋白（HDL-C）的血脂水平。3.5血压测量分别于实验前及试验结束时,通过尾静脉测量ApoE-/-小鼠血压。每只小鼠血压测量三次取平均值。3.6AAA测量留取小鼠全长主动脉,置于4%多聚甲醛过夜保存。大体显微镜下剥离主动脉外膜多余的结缔组织及脂肪组织,拍照记录。通过Image-Pro Plus 6.0测量动脉最大直径以测量瘤体大小。AAA是以主动脉直径增加150%,或任何瘤体内出血（含直径增加仅110%）。AAA的严重度分级包括:None,无动脉瘤;Ⅰ型,管腔扩张但无腔内血栓形成;Ⅱ型,管腔扩张伴腔内血栓形成;Ⅲ型,明显的管腔扩张但无腔内血栓形成;Ⅳ型多发动脉瘤伴血栓,部分动脉瘤重叠。两名研究者进行统计分析。3.7主动脉组化分析石蜡包埋主动脉弓至肾动脉的组织,在主动脉直径最大部分利用石蜡切片机进行5μm连续切片用于组织化学染色。苏木素-伊红染色（HE染色）用于评估AAA形态;Verhoeff染色用于观察AAA弹力纤维的完整性:Masson染色及天狼猩红染色用于检测AAA胶原含量;组化染色分别检测巨噬细胞、平滑肌细胞、胶原Ⅰ（CI）、胶原Ⅲ（CⅢ）、P4Hα1、基质金属蛋白酶2（MMP2）、基质金属蛋白酶9（MMP9）、白介素1β（IL-1β）、单核细胞趋化因子1（MCP-1）、白介素6（IL-6）及TNF-α的表达量,IgG作为组化染色的阴性对照,所有组化染色结果利用Image J软件统计分析。3.8细胞培养含20%胎牛血清的高糖DMEM用于培养原代小鼠VSMCs。首先,1 × 10-7 mol/L的Ang Ⅱ用于刺激VSMCs模拟AAA,收集细胞蛋白检测NONO表达量;然后,通过MOI=100的病毒复染指数转染VSMCs分别转染sh-NC及sh-NONO病毒,三天后加入1 × 10-7 mol/L的Ang Ⅱ刺激VSMCs进行体外实验研究。所有实验结果至少重复三次。3.9 Western Blot 检测ApoE-/-雄性小鼠主动脉或VSMCs提取组织蛋白或细胞蛋白用于Western blot实验。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、5%脱脂牛奶封闭非特异性抗原、孵育对应的一抗及二抗、辣根过氧化物酶发光显影等操作,检测NONO、CⅠ、CⅢ、P4Hαl、MMP2、MMP9、IL-lβ、MCP-1、TNF-α 磷酸化NF-κB p65（p-p65）及总NF-κB p65（t-p65）的蛋白表达量,GAPDH作为western blot的内参以证实蛋白上样量一致。3.10细胞免疫共沉淀（co-IP）将VSMCs种于150 mm2培养皿中,在细胞密度达80%-90%后血清饥饿细胞24h,加入1 × 10-7 mol/L的Ang Ⅱ刺激1h,提取蛋白进行免疫共沉淀。分别用NONO一抗或NF-κB p65一抗孵育的蛋白A/G琼脂糖珠拉取NONO蛋白及NF-κB p65蛋白,IgG为阴性对照。通过western blot技术检测结合蛋白。3.11细胞免疫荧光检测1 × 10-7 mol/L的Ang Ⅱ刺激80%密度的VSMCs细胞爬片1h后,通过甲醛固定、Triton破膜、5%BSA封闭非特异性抗原、孵育NONO及NF-κB p65一抗、相对应的荧光二抗、DAPI染色及荧光共聚焦显影,检测NONO及NF-κB p65的共定位。3.12数据统计利用SPSS v19.0进行数据分析。统计数据均以均数±标准误表示。通过独立样本t检验进行两两比较;单因素方差分析用于满足方差齐性假设的多组比较;非参数齐性检测用于多因素比较。卡普兰-迈耶曲线（生存率曲线）用于小鼠生存状态的统计分析。P<0.05表示差异有统计学意义。4研究结果4.1 NONO蛋白在ApoE--小鼠AAA组织及Ang Ⅱ刺激的VSMCs中的表达与正常主动脉组织相比,ApoE-/-小鼠AAA组织中NONO蛋白的表达量明显增加（P<0.05）;与正常VSMCs相比,Ang Ⅱ刺激后VSMCs中NONO蛋白的表达量明显增加（P<0.05）。小鼠AAA组织荧光共定位染色显示,NONO蛋白在巨噬细胞、血管平滑肌细胞及内皮细胞中均有表达,且无明显的统计学差异。4.2慢病毒在体内及体外的转染效率检测分别于ApoE-/-小鼠尾静脉注射sh-NC慢病毒4周、6周及8周时,通过检测小鼠主动脉GFP荧光强度明确小鼠体内慢病毒的转染效率,结果显示三个不同的时间节点取材获得的小鼠主动脉均观察到GFP的绿色荧光。Sh-NONO慢病毒转染小鼠后,AAA组织中NONO蛋白表达量下调约50%（P<0.01）。Sh-NONO慢病毒转染VSMCs后,小鼠原代平滑肌细胞中NONO蛋白表达量下调超过50%（P<0.01）。4.3四组ApoE-/-小鼠的血脂及血压水平本实验第三部分的四组ApoE-/-小鼠的血脂水平均无明显差异。皮下泵注AngⅡ的小鼠收缩压水平明显升高,而NONO蛋白敲减组AAA造模小鼠的收缩压较其他AAA造模小鼠的收缩压无明显差异。4.4降低NONO蛋白的表达明显下调Ang Ⅱ导致的ApoE-/-小鼠AAA的发生率第三部分实验结果显示,对照组小鼠无AAA的发生,而Ang Ⅱ导致的ApoE-/-小鼠AAA的发生率在NT组、sh-NC组及sh-NONO组分别为80%（P<0.05）、84%（P<0.05）及48%（P<0.05）。根据AAA的严重度分级显示,NT组及sh-NC组中Ⅲ型及Ⅳ型AAA 比例更高,而sh-NONO组中Ⅰ型及Ⅱ型AAA的比例较高。因此,降低NONO蛋白的表达量能够明显降低AAA的发生发展。此外,腹主动脉的最大直径在Ang Ⅱ刺激ApoE-/-小鼠中明显升高（P<0.05）,sh-NONO组腹主动脉的最大直径显着低于NT组（P<0.05）及sh-NC组（P<0.05）,NT组及sh-NC组无明显统计学差异。生存曲线显示,Ang Ⅱ明显降低小鼠的存活率。4.5降低NONO蛋白的表达对AAA组织及形态的影响HE及Verhoeff染色显示,Ang Ⅱ刺激ApoE-/-、鼠导致AAA的病理过程中出现主动脉外膜病理性膨大、中膜结构损坏及弹力纤维断裂等。慢病毒敲减NONO蛋白后,上述病理性改变较NT组及sh-NC组明显减轻;而NT组及sh-NC组的血管病理性形态改变无明显差异。此外,sh-NONO组小鼠AAA组织中动脉壁胶原含量、平滑肌细胞含量明显升高（P<0.05）,巨噬细胞含量明显下降（P<0.01）;而NT组及sh-NC组的血管中的胶原含量及细胞组成成分的改变无明显差异。4.6降低NONO蛋白的表达对胶原沉积和胶原降解的影响免疫组化及天狼猩红染色结果显示,相比NT组及sh-NC组的AAA组织,敲减 NONO 蛋白能够显着增加 P4Hα1（P<0.01）、CI（P<0.01）和 CⅢ（P<0.01）的表达量及天狼猩红阳性率（P<0.01）,同时显着降低MMP2（P<0.01）、MMP9（P<0.01）的表达量;而上述指标在NT组及sh-NC组的AAA组织无明显差异。Ang Ⅱ刺激VSMCs 24h提取细胞蛋白的Western Blot结果显示,相比NT组及sh-NC组的VSMCs,敲减NONO蛋白能够显着增加CI（P<0.01）、CⅢ（P<0.01）及P4Hα1（P<0.01）的蛋白表达量,同时显着降低MMP2（P<0.01）、MMP9（P<0.05）的表达量。4.7降低NONO蛋白的表达对炎性因子浸润的影响免疫组化染色结果显示,相比NT组及sh-NC组的AAA组织,敲减NONO蛋白能够显着降低 IL-1β（P<0.01）、MCP-1（P<0.01）、IL-6（P<0.01）和 TNF-α（P<0.01）的表达;而上述指标在NT组及sh-NC组的AAA组织无明显差异。Ang Ⅱ刺激VSMCs 24h提取细胞蛋白的Western Blot结果显示,相比NT组及sh-NC组的VSMCs,敲减NONO蛋白能够显着抑制IL-1β（P<0.01）、MCP-1（P<0.01）和TNF-α（P<0.01）的表达。4.8降低NONO蛋白的表达对NF-κB p65核转位及磷酸化水平的影响转录因子NF-κB p65作为AS的重要调控因子,参与调控炎症因子IL-1β、IL-6及MCP-1的表达水平。通过细胞免疫共沉淀实验,发现NONO蛋白与NF-κB p65在Ang Ⅱ刺激后能够相互结合。荧光染色结果显示,NONO蛋白敲减能够显着抑制Ang Ⅱ刺激导致的NF-κB p65的核转位,IgG为阴性对照。同时,NONO蛋白敲减能够显着抑制Ang Ⅱ刺激导致的NF-κB p65的磷酸化水平（P<0.01）。5结论（1）通过慢病毒敲减ApoE-/-小鼠NONO蛋白的表达量,可通过增加胶原沉积、抑制炎症反应,抑制Ang Ⅱ导致的小鼠AAA的形成;（2）敲减NONO蛋白可能通过抑制NF-κB p65的磷酸化水平发挥对AAA的有益作用。
牛巧歌[4]（2020）在《神经生长因子调节牛睾丸支持细胞增殖的机制研究》文中指出神经生长因子（NGF）作为神经营养素家族的一员,被证明在多种组织和器官中表达,包括雄性的生殖系统,并在雄性生殖生理中起重要作用。但到目前为止具体的分子机制仍不清楚。本课题以新生牛睾丸支持细胞（NBS）为对象,研究了NGF调节NBS细胞增殖的分子机制。研究的主要内容与结果如下:1、细胞鉴定和NGF在NBS细胞上的表达本试验利用免疫荧光技术成功鉴定出NBS细胞内FSHR的表达,利用吉姆萨染色观察NBS细胞发现符合睾丸支持细胞的形态学特点:细胞呈现梭形,细胞核大而明显,细胞核内部核仁周围存在两到三个卫星小体;神经胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）和干细胞因子（SCF）作为睾丸内支持细胞特有的分子标记被成功检测到转录本。证明了所用的NBS细胞是牛睾丸支持细胞。利用免疫荧光技术鉴定出NGF及其受体TrkA在NBS细胞中大量表达。2、NGF对NBS细胞增殖的作用CCK8细胞增殖实验检测发现在体外用NGF（100 ng/ml）处理NBS细胞18小时,对细胞具有提高活力的作用。检测细胞增殖相关基因,Inhibin-B和紧密连接相关基因的表达水平,发现NGF可以有效促进NBS细胞增殖基因CCNE2、CCND1、PCNA的表达,并促进细胞Inhibin-B和胞质特化连接相关基因Vinculin的表达。采用siRNA干扰技术降低NBS细胞内源NGF的表达。发现NBS细胞活力出现下降。检测上述基因的表达发现,NGF的敲低可有效抑制细胞增殖基因CCNE2、CCND1、PCNA的表达,并抑制细胞Inhibin-B和Vinculin的表达,从而抑制细胞增殖。3、NGF调节NBS细胞增殖的机制添加NGF高亲和力受体TrkA的抑制剂K252α,发现NGF通过受体TrkA促进NBS细胞增殖。另外检测发现NGF可在短时间内明显激活NBS细胞中PI3K/AKT和MAPK/ERK信号通路。添加PI3K/AKT信号通路的抑制剂LY294002或MAPK/ERK信号通路的抑制剂PD98059。发现NBS细胞添加抑制剂处理后,NGF对细胞增殖的促进作用明显降低。采用qRT-PCR和Western blot技术检测发现PI3K/AKT信号通路参与NGF对NBS细胞增殖基因CCNE2,CCND1,Inhibin-B以及Vinculin表达的促进作用;MAPK-ERK信号通路参与NGF对NBS细胞增殖基因CCNE2,PCNA,CCND1以及Inhibin-B表达的促进作用。上述实验结果表明,NGF通过其高亲和力受体TrkA激活NBS细胞中PI3K/AKT和MAPK/ERK信号通路,促进细胞增殖基因CCNE2、CCND1、PCNA,以及细胞Inhibin-B和Vinculin的表达,调节NBS细胞的增殖。上述所有试验研究结果将有助于进一步了解NGF在雄性生殖中的作用,并为睾丸发育不全和精子发生障碍等生殖方面的问题提供新的治疗靶标。
陈秋燃[5]（2020）在《IGF-1与EGF因子联合使用对毛兔毛囊生长的影响》文中提出我国是毛兔产销大国,随着兔毛纺织技术的革新,生活水平的提高,目前约60%-70%兔毛用于国内市场需求,国内市场对其需求量越来越大。深入了解毛兔毛囊发育的控制因素,对我国毛兔产业的发展具有重要意义。毛囊是毛兔兔毛生长发育的基础,对兔毛的生长具有调控作用。研究发现有一些细胞因子可以调控毛发生长,如胰岛素生长因子-1（Insulion-Like Growth Factor-1,IGF-1）和表皮生长因子（Epidermal Growth Factor,EGF）,但其对毛兔毛囊发育的调节作用有待进一步研究。基于此,我们通过体外分离培养毛兔毛囊器官,确定毛兔毛囊最适培养环境,并利用毛囊器官,选出EGF与IGF-1联合使用的最佳培养浓度。然后皮下注射IGF-1与EGF联合因子,观察联合因子对毛囊发生、生长的影响,以期为毛兔毛囊发育提供理论基础,助力我国毛兔产业的发展。1、不同体外培养条件对毛兔毛囊体外培养的影响采集毛兔触须毛囊,分离多余组织和脂肪,保留完整毛囊,构建触须毛囊器官培养模型,分别利用Williams E、DMEM、MEM三种不同培养基进行培养,结果发现Williams E和MEM培养基分别培养的毛囊在第2天与第4天时,毛囊生长速度极显着大于第6天（P<0.01）,而DMEM组显着大于第六天（P<0.05）。在第2天和第6天Williams和DMEM组生长速度显着大于MEM组,第4天Williams组生长速度显着大于DMEM和MEM组。整个体外培养周期中,WilliamsE组在3组中生长最快,平均生长速度显着高于DMEM和MEM组（P<0.05）。毛囊HE染色结果显示3组毛囊结构存在差异,Williams E组和DMEM毛囊结构完整清晰无明显差异,而MEM组毛囊开始萎缩,内根鞘向前方移动,并且与外根鞘分离,毛囊变得相对较短圆。进一步利用PCNA免疫荧光染色发现,PCNA在Williams E组的毛乳头部阳性表达清晰可见,阳性表达明显高于DMEM组和MEM组,DMEM组仅有毛囊外根鞘有微弱表达,MEM组基部基本无明显表达,说明Williams E组的毛囊增殖能力最强。以上结果表明,与其他两组相比,Williams E培养基更适合毛兔毛囊体外生长。2、IGF-1与EGF因子对毛兔毛囊体外生长的影响设置不同浓度的IGF-1因子和EGF因子,对照组不加因子,利用CCK-8检测毛乳头细胞的增殖能力,筛选IGF-1与EGF因子单独使用的最适浓度,结果发现IGF-1在浓度为10 ng/mL时毛乳头细胞增殖最快,EGF在浓度20 ng/mL时毛乳头细胞增殖最快,进一步发现2种因子联合使用（10 ng/mLIGF-1+20 ng/mL EGF）的效果极显着高于因子单独使用（P<0.01）。根据以上结果,将联合因子加入体外毛囊培养基中,并设置对照组,发现联合因子组毛囊毛发生长长度高于对照组（P<0.05）。生长速率结果表明,联合因子组与对照组在第4天差异显着（P<0.05）,两组毛囊在第4天生长速度极显着大于第6天（P<0.01）。加入IGF-1和EGF因子后刺激毛囊生长作用与对照组相比更明显。培养4天后毛囊HE染色发现两组结构均保持完整性,无明显区别。利用PCNA免疫荧光染色发现,培养四天的两组毛囊毛球部均有PCNA表达,但联合因子组毛乳头外表达更强,说明联合因子组的毛囊增殖能力强,与对照组相比,更能促进毛发生长。因此,兔毛囊体外培养可优先考虑在基础培养液中联合添加IGF-1和EGF,这两种因子浓度分别为10 ng/mL IGF-1、20ng/mLEGF。3、IGF-1与EGF因子联用对毛兔毛发生长的影响为了进一步分析IGF-1与EGF因子联用对毛兔毛发生长的影响,进行了毛兔活体注射实验。联用因子组从第8天毛兔毛发开始出现,对照组第10天毛发开始出现,对照组比联合因子组明显延迟,说明联合因子处理组毛兔背部进入毛发开始出现的时间早于对照组。HE染色结果显示在同一处理时期,与联合因子组相比,对照组毛囊密度更为稀疏。进一步检测两组在不同处理时期皮肤组织中毛囊发育相关基因表达量（LEF1、IGF-1、CCND1、WINT2、EGF、IGF-1和FGF2）,结果发现处理后第7天,联合因子处理组LEF1和WINT2的表达水平极显着高于对照组（P<0.01）,IGF-1和EGF的表达水平显着高于对照组（P<0.05）,其他基因的表达水平不显着（P>0.05）。在处理后第14天,联合因子组CCND1、WINT2、IGF-1的表达水平极显着高于对照组（P<0.01）,LEF1和EGF显着高于对照组（P<0.05）。当处理第21天时,两组毛发生长均覆盖表皮,联合因子组只有LEF1和EGF显着大于对照组（P<0.05）。当毛囊形成时在7、14天PCNA开始表达于毛囊,实验第21天对照组仅表达于毛囊毛乳头,而联合因子组在毛囊外根鞘、毛乳头均有表达,且明显高于对照组。这说明IGF-1和EGF联合使用对毛兔毛发的生长有促进作用。可将IGF-1和EGF因子作为促进毛发生长的参考。
赵清梅[6]（2008）在《山羊角膜上皮细胞与角膜内皮细胞分离培养研究》文中研究表明各种角膜疾病和外科损伤都会导致角膜细胞受损,当损伤超过其生理代偿时,就会发生角膜病变,严重时会导致角膜盲。目前角膜移植是治疗此类角膜疾病比较成熟的方法,但受到了供体角膜缺乏、术后并发症、角膜供体老龄化等条件的限制。将自体或异体角膜细胞体外培养构建组织工程化人工角膜移植,既可解决临床应用供体短缺问题,又可为角膜体外药理或生理研究提供大量材料。本研究通过体外分离培养山羊角膜上皮细胞和角膜内皮细胞,并研究其体外生长特性和接种羊膜载体培养情况,为组织工程人工角膜的构建奠定理论基础。1.山羊角膜上皮细胞的体外分离培养与鉴定通过比较组织块和酶消化法培养山羊原代角膜缘上皮细胞,发现酶消化法更适合原代角膜缘上皮细胞的分离纯化培养。获取的山羊角膜缘上皮细胞形态为多角形,具有较强的增殖能力,体外培养能传20多代,细胞冻存后仍具有细胞冻存前的形态和活力。经免疫组化和RT-PCR检测,培养的角膜缘上皮细胞表达K3/K12、p63、Cx43、ABCG2和PCNA,具有角膜上皮细胞和角膜缘干细胞表型,说明分离培养的细胞为角膜缘上皮细胞和角膜缘干细胞混合物,可为组织工程化人工角膜上皮的构建提供种子细胞。2.组织工程化人工角膜上皮的构建在去上皮细胞人羊膜上接种关中奶山羊角膜缘组织块或培养的关中奶山羊角膜缘上皮细胞构建的组织工程角膜上皮,并对其进行组织形态学、超微结构观察和免疫组化检测。结果显示,角膜缘组织块和角膜上皮细胞在羊膜上培养15 d均可形成6～7层结构,细胞内含丰富的细胞器和糖原颗粒,细胞间有大量的桥粒连接,细胞与羊膜间形成半桥粒连接,构建的复合角膜上皮p63染色阳性。比较角膜缘组织块在去羊膜上皮细胞的新鲜羊膜、冻存30 d羊膜、冻存60 d羊膜和冻存180 d羊膜上生长情况发现,从角膜缘组织块脱出的细胞生长面积在冻存30 d羊膜上最大,而在新鲜羊膜上细胞生长面积最小。比较角膜缘组织块在冻存60 d去上皮羊膜和未去上皮羊膜上生长情况发现,从角膜缘组织块脱出的细胞生长面积在去上皮羊膜上显着大于未去上皮羊膜上。说明用组织块法和种传代细胞法均能构建组织工程化人工角膜上皮,细胞培养载体需用冻存30 d左右去上皮细胞的羊膜,为组织工程化人工角膜上皮的构建研究奠定理论基础。3.山羊角膜内皮细胞的体外分离培养与鉴定比较组织块法、胰酶消化法、dispase酶消化法和dispase酶+胰酶消化法培养山羊原代角膜内皮细胞。dispase酶+胰酶消化法为角膜内皮细胞原代分离纯化的最适方法,分离的细胞在体外能连续传20多代,细胞冻存后解冻培养能保持冻存前细胞形态和活力。培养的细胞经扫描电镜和透射电镜观察,具有正常角膜内皮细胞特征,免疫组化染色和RT-PCR检测角膜内皮细胞表达神经元标志NSE和β3-tublin、星形胶质细胞标志GFAP、细胞间连接蛋白ZO-1和Cx43,不表达神经干细胞标志物Nestin、角膜缘干细胞标志p63和角膜上皮细胞标志K3/K12。比较细胞培养板包被物对角膜内皮细胞贴壁和增殖能力影响发现,Ⅳ胶原、多聚赖氨酸和明胶均能明显促进细胞贴壁和增殖,Ⅳ胶原和明胶组强于多聚赖氨酸组,而Ⅳ胶原组和明胶组之间差异不显着,提示可选择价格便宜的明胶作为细胞培养板用包被物。角膜内皮细胞培养液筛选发现:与NBS相比,FBS能更好的促进角膜内皮细胞增殖和维持其形态;培养液中添加bFGF能显着促进细胞增殖,但能促进细胞形态向成纤维形转变;添加EGF对细胞增殖影响不大,但能促进细胞形态改变;添加硫酸软骨素显着抑制细胞增殖,但能较好的维持细胞形态;添加Vc对细胞增殖和形态均无明显影响。将传代培养的角膜内皮细胞种羊膜上培养,经组织切片、透射和扫描电镜观察发现细胞在羊膜上具有形成单层的能力。说明分离培养的角膜内皮细胞具有正常角膜内皮细胞特征,能体外传代培养,在羊膜载体上具有形成单层的能力,可为构建组织工程化人工角膜内皮和角膜内皮细胞的体外实验研究提供种子细胞。4.山羊角膜内皮细胞人端粒酶逆转录酶基因转染将人端粒酶逆转录酶基因（hTERT）转入培养至7代的角膜内皮细胞内,通过免疫组化和RT-PCR检测证明转染的hTERT在山羊角膜内皮细胞内表达。通过传代培养观察,转染hTERT的角膜内皮细胞体外能传20多代,与未转染hTERT的角膜内皮细胞相比,并未显着提高其增殖能力。说明将人端粒酶基因转入山羊角膜内皮细胞内,未能明显延长细胞寿命。
任秀君[7]（2007）在《针刺对高血脂合并脑缺血大鼠神经干细胞和神经营养因子的影响》文中进行了进一步梳理研究目的:高脂血症（hyperlipidemia,HLP）由血中脂蛋白合成与清除紊乱所致,表现为血浆脂蛋白异常、血脂增高等,属于祖国医学的“痰浊”“瘀血”范畴。它是动脉粥样硬化等心脑血管疾病发生的重要危险因素,有效地防治HLP是防治心脑血管疾病的重要途径。脑血管疾病是目前严重危害人类健康的主要疾病之一。在我国死于脑血管病者居三大死因首位。其中缺血性脑血管疾病占60%～80%。脑血管病具有发病率高、致残率高、死亡率高的“三高”特点,是威胁人类尤其是中老年人健康的常见病、多发病。为了减少和延缓中风的发生,减轻中风后机体状态,从高血脂阶段早期进行针刺干预,是针刺防治中风的新视角,具有重要流行病学研究意义。高血脂与中风,神经干细胞与神经营养因子之间的关系是目前研究尚未进行探讨的部分,本研究试图通过建立高血脂合并脑缺血动物模型,并观察针刺的影响,探讨在高血脂阶段积极早期进行针刺干预,是否可通过升高神经营养因子的合成与分泌,从而促进神经干细胞的增殖、迁移和分化,促进脑损伤的修复和再生。研究方法:应用大鼠喂养经典高脂饲料,化学诱导大脑中动脉血栓闭塞制造高血脂合并脑缺血模型。将动物随机分为八组:正常对照组、高血脂模型组、高血脂治疗组、脑缺血模型组、脑缺血治疗组、高血脂合并脑缺血模型组、高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ、Ⅱ组。高血脂治疗组用电针三阴交、丰隆穴治疗10天。脑缺血治疗组用针刺人中、百会穴治疗7天。高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ、Ⅱ组,先给大鼠喂养高脂饲料造成高血脂模型,治疗Ⅰ组电针三阴交、丰隆穴10天后,两组同时电针三阴交、丰隆穴,针刺人中、百会穴,7天后处死。正常对照组和模型组均不针刺。用生化方法检测各组治疗前后血脂四项。应用神经行为学指标观察治疗前后神经症状的改善情况。实验结束用免疫组化方法检测海马区和额叶皮层脑缺血病理改变、室管膜下区和大脑额叶皮层nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1表达情况。用酶联免疫法（ELISA）检测右侧大脑匀浆中神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经生长因子（NGF）、脑源性神经营养因子（BDNF）、碱性成纤维生长因子（bFGF）浓度。实验结果:1高血脂合并脑缺血模型的建立本实验选用经典高脂饲料喂养6周造成高脂血症大鼠模型,在此基础上用大脑中动脉FeCl3刺激血栓性闭塞法造成局灶性脑缺血,最终造成高血脂合并脑缺血模型。预实验结果显示,与同时段正常对照组比较,高血脂组4周、6周CHO、LDL-C、TG升高有显着差异,P<0.01,HDL-C没有显着差异。说明高脂饲料喂养4-6周可以造成大鼠高血脂模型。由于高血脂形成时间较长,饲养6周的高血脂症大鼠模型更近似于人类高血脂症的病理变化,正式实验定为6周。正式实验,42天,高脂饮料喂养的各组大鼠的CHO和LDL-C、TG与正常对照组大鼠比较,升高有显着性差异,P<0.01。HLD-C降低有显着性差异,P<0.01。证明高血脂症大鼠造模成功,可以进行实验。52天脑缺血造模后,在MCAO清醒（术后约1h）后,在1～2h内观察模型动物有脑缺血模型出现的神经功能缺失症状,各组大鼠在造模后1～2h的神经症状行为在评定上均有阳性反应,与正常对照组比较均有显着性差异p<0.01。HE染色结果可见,实验组动物脑缺血造模后,缺血灶出现在额叶,位置比较恒定,缺血灶内细胞排列散乱,并见大量神经元变性坏死,出现脑水肿表现,海马区大量神经元变性坏死,排列紊乱,各组有不同程度的神经元脱失现象等病理改变,说明本实验的脑缺血模型制作是成功的。本实验首次建立高血脂合并脑缺血的动物模型,此模型成功率高,死亡率小,重复性好,充分模拟了人类疾病的病理及生理改变。2正常大鼠血脂、HE染色结果、神经干细胞、NSE、神经营养因子的表达正常大鼠CHO 51.92±9.46mg/dL, HDL-C 26.80±8.16 mg/dL,LDL-C 30.50±8.19 mg/dL,TG47.98±12.18 mg/dL。HE染色结果显示,大鼠右侧海马区和额叶皮层神经细胞排列清楚,细胞形态清晰。神经干细胞标志,nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1阳性细胞,在正常大鼠右侧脑内表达较少,在前脑背外侧伸展、侧脑室外侧壁可观察到散在的nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1的阳性细胞（背外侧伸展nestin:阳性细胞数63±9.40;面密度0.62±0.10%;光密度0.50±0.03%。PCNA:阳性细胞数185±10.60;面密度1.93±0.11%;光密度1.22±0.07%。vimentin:阳性细胞数95±6.31;面密度0.61±0.04%;光密度0.34±0.02%。Tuj-1:阳性细胞数56±7.69;面密度0.96±0.13%;光密度0.22±0.03%。侧脑室外侧壁:nestin:阳性细胞数41±5.61;面密度0.35±0.05%;光密度0.23±0.03%。PCNA:阳性细胞数114±22.79;面密度1.25±0.25%;光密度0.94±0.19%。vimentin:阳性细胞数48±11.85;面密度1.05±0.26%;光密度0.58±0.14%。Tuj-1:阳性细胞数35±4.69;面密度0.88±0.12%;光密度0.45±0.06%。）正常对照组大脑右侧额叶皮层相应区域表达更少。（nestin:阳性细胞数14±3.47;面密度0.11±0.03%;光密度0.09±0.02%。PCNA:阳性细胞数58±6.52;面密度0.64±0.07%;光密度0.39±0.04%。vimentin:阳性细胞数56±6.46;面密度0.22±0.03%;光密度0.11±0.01%。Tuj-1:阳性细胞数13±5.14;面密度0.08±0.03%;光密度0.05±0.02%。）右侧大脑匀浆中NSE（41.70±3.47 ng/dL）及神经营养因子NGF（79.36±7.07 pg/ml）、BDNF（5.66±0.86μg/L）、bFGF（51.20±6.05 ng/L）含量呈基础表达。3针刺对实验性高血脂大鼠的治疗作用3.1针刺对实验性高血脂大鼠血脂的作用经针刺治疗后,和高血脂模型组相比,高血脂治疗组大鼠的CHO、LDL-C、TG降低有极显着差异,P<0.01。HLD-C升高有极显着差异,P<0.01。说明针刺能降低实验性高血脂大鼠CHO、LDL-C、TG,升高HLD-C,调节血脂水平。3.2针刺对实验性高血脂大鼠右侧大脑SVZ和额叶皮层神经干细胞的作用nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1在实验性高血脂造模后大鼠脑内表达较少,在室管膜下区SVZ、背外侧角可观察到散在的nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1的阳性细胞,额叶皮质表达更少,与正常对照组相比,其阳性细胞数、面密度、光密度没有显着差异,P>0.05。针刺对实验性高血脂大鼠nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1表达影响不大。3.3针刺对高血脂大鼠右侧脑组织匀浆中NSE的作用高血脂造模后,右侧脑匀浆中NSE浓度与正常脑匀浆中NSE浓度没有显着差异,P>0.05,说明高血脂本身不能影响右侧脑组织中NSE的分泌与合成。高血脂大鼠治疗组和模型组之间没有显着差异,说明针刺不能影响实验性高血脂大鼠NSE的分泌。3.4针刺对实验性高血脂大鼠右侧脑组织匀浆中神经营养因子的作用与正常对照组比较,高血脂模型组大鼠大脑匀浆中NGF、BDNF、bFGF含量明显降低,P<0.05或P<0.01;与高血脂模型组比较,针刺治疗组BDNF显着升高,P<0.05,NGF、bFGF没有显着差异,P>0.05,但有升高的趋势。实验结果提示高血脂可降低大鼠大脑中NGF、BDNF、bFGF的分泌与合成,针刺可升高高血脂状态某些神经营养因子的含量,如BDNF。4针刺对实验性脑缺血大鼠的治疗作用4.1针刺对实验性脑缺血大鼠脑缺血后神经行为评分和脑缺血病理改变的作用59天,与正常对照组比较,脑缺血模型组和脑缺血治疗组神经症状评分升高有极显着性差异,p<0.01;与脑缺血模型对照组比较,脑缺血治疗组的神经症状评分降低有极显着性差异,p<0.01。HE染色结果显示,脑缺血治疗组缺血区周围组织水肿减轻,无明显的细胞空泡变性,细胞核正常。海马CA3区结构完整的神经细胞明显增多,变性坏死细胞较少,细胞周围间隙明显缩小,血管病变主要以内皮细胞肿胀,空泡形成为主。说明针刺治疗对局灶性脑缺血大鼠具有显着的治疗作用。4.2针刺对实验性脑缺血大鼠脑缺血后缺血侧SVZ和额叶皮层神经干细胞的作用脑缺血后,大鼠缺血侧前脑室管膜下区（背外侧伸展、侧脑室外侧壁）、缺血区额叶皮层nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1强表达,并有多层阳性细胞,背外侧角可见大量的nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1阳性细胞,并向外形成了背外侧伸展,脑缺血区可见散在的nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1表达。与正常对照组比较,脑缺血模型组、治疗组nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1阳性细胞个数、面密度、光密度升高均有极显着差异,P<0.01;与脑缺血模型组比较,脑缺血治疗组各项升高均有极显着差异,P<0.01。脑缺血后存在神经干细胞的增殖,并有一部分神经干细胞有向胶质细胞和神经元祖细胞定向分化的趋向。针刺后各项指标高于脑缺血组。说明针刺可提高实验性脑缺血大鼠大脑侧脑室背外侧伸展、侧脑室外侧壁、缺血区nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1的表达。针刺结果显示,针刺可促进大脑SVZ和额叶皮层神经干的增殖,并能促进神经干细胞向胶质细胞和神经元祖细胞定向分化,同时可能促进神经干细胞从SVZ区向缺血区迁移。4.3针刺对实验性脑缺血大鼠缺血侧脑组织匀浆中NSE的作用与正常组相比,脑缺血模型组大脑匀浆中NSE含量明显上升,有极显着性差异,P<0.01;与脑缺血模型组相比,脑缺血治疗组大脑匀浆中NSE含量降低有极显着差异,P<0.01。实验结果提示:脑缺血后,脑匀浆中NSE浓度显着升高,说明出现脑损伤。针刺可降低NSE浓度,从而减轻脑损伤。4.4针刺对实验性脑缺血大鼠脑缺血后缺血侧脑组织匀浆中神经营养因子的作用与正常组相比,脑缺血模型组缺血侧脑组织匀浆中NGF、BDNF、bFGF含量明显上升,有显着性差异,P<0.05;与脑缺血模型组相比,脑缺血治疗组缺血侧脑组织匀浆中NGF、bFGF含量升高有显着差异,P<0.05或P<0.01。实验结果提示脑缺血后,缺血侧脑组织匀浆中NGF、BDNF、bFGF浓度显着升高,说明脑缺血后,自身可分泌神经营养因子,从而产生一定的脑保护作用。针刺可通过促进缺血侧大脑NGF、bFGF的分泌与合成,加强脑保护作用。5针刺对实验性高血脂合并脑缺血大鼠的治疗作用5.1针刺对实验性高血脂合并脑缺血大鼠血脂的作用经针刺治疗后,与正常对照组比较,高血脂合并脑缺血模型组、高血脂合并脑缺血模型治疗Ⅰ组、Ⅱ组CHO、LDL-C升高有极显着性差异,P<0.01;高血脂合并脑缺血模型组、高血脂合并脑缺血模型治疗Ⅱ组TG升高,有极显着性差异,P<0.01;与高血脂合并脑缺血模型组比较,治疗Ⅰ组CHO、TG、LDL-C降低有显着性差异,P<0.01或P<0.05,治疗Ⅱ组没有显着差异,P>0.05;与治疗Ⅰ组比较,治疗Ⅱ组CHO、LDL-C、TG没有显着差异,P>0.05;HDL-C,各组之间比较没有显着差异,P>0.05,但与42天比较,治疗Ⅰ组HDL-C升高有显着差异,P<0.01。本实验表明,针刺可降低高血脂合并脑缺血大鼠CHO、TG、LDL-C水平,升高HDL-C水平,高血脂合并脑缺血模型治疗治疗Ⅰ组疗效好于治疗Ⅱ组,从而说明从高血脂阶段积极介入针刺治疗,可更好、更有效地调节血脂水平。5.2针刺对实验性高血脂合并脑缺血脑缺血后神经行为评分和脑缺血病理改变的作用与合并模型组比较,合并治疗组神经症状评分显着降低,p<0.05;与合并治疗Ⅰ组比较,Ⅱ组没有显着差异,p>0.05,说明针刺治疗对局灶性脑缺血大鼠具有显着的治疗作用。针刺后缺血区HE结果显示,针刺后缺血区周围组织水肿减轻。高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ组水肿程度最轻,无明显的细胞空泡变性,细胞核正常。海马CA3区结构完整的神经细胞明显增多,变性坏死细胞较少,细胞周围间隙明显缩小,血管病变主要以内皮细胞肿胀,空泡形成为主。说明电针在高血脂成模后积极治疗可减轻脑损害。5.3针刺对实验性高血脂合并脑缺血大鼠缺血侧SVZ和额叶皮层神经干细胞的作用高血脂合并脑缺血模型组前脑侧脑室背外侧伸展、侧脑室外侧壁、额叶缺血区nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1阳性细胞的表达弱于单纯脑缺血模型组。与正常对照组比较,高血脂合并脑缺血模型组、高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ组、Ⅱ组阳性细胞个数、面密度、光密度升高均有极显着差异,P<0.01;与高血脂合并脑缺血模型组比较,高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ组、Ⅱ组阳性细胞个数、面密度、光密度升高均有极显着差异,P<0.01;与高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ组比较,高血脂合并脑缺血Ⅱ组各项降低有极显着差异,P<0.01。实验结果提示高血脂可减弱脑缺血后nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1阳性细胞的表达。即高血脂可减弱脑缺血后神经干细胞的增殖,迁移和分化。针刺可提高高血脂合并脑缺血模型大鼠大脑侧脑室背外侧伸展、侧脑室外侧壁、缺血区nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1的表达。高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ组比Ⅱ组各项表达要强,说明在高血脂阶段介入治疗,更能提高nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1表达。针刺结果显示,针刺可促进高血脂合并脑缺血模型大鼠大脑SVZ和额叶皮层神经干的增殖,并能促进神经干细胞向胶质细胞和神经元祖细胞定向分化,同时可能促进神经干细胞从SVZ区向缺血区迁移。说明在高血脂阶段介入治疗,更能促进神经干细胞的增殖,分化和迁移。5.4针刺对实验性高血脂合并脑缺血大鼠缺血侧脑组织匀浆中NSE的作用与正常对照组和脑缺血模型组比较,高血脂合并脑缺血模型组大脑匀浆中NSE含量显着上升,有显着性差异,P<0.05,P<0.01。与正常对照组相比,合并各组缺血侧大脑匀浆中NSE含量明显上升,有极显着性差异,P<0.01;与合并模型组比较,合并治疗Ⅰ组、Ⅱ组下降有显着差异P<0.01,P<0.05;与高血脂合并脑缺血模型治疗Ⅰ组比较,Ⅱ组升高有显着差异P<0.05。实验结果提示,高血脂合并脑缺血可加重脑缺血后脑损伤,针刺可减低高血脂合并脑缺血大鼠的脑损伤,尤其在高血脂阶段介入针刺治疗的治疗Ⅰ组疗效远远好于治疗Ⅱ组。5.5针刺对实验性高血脂合并脑缺血大鼠缺血侧脑组织匀浆中神经营养因子的作用与正常对照组、脑缺血模型组比较,高血脂合并脑缺血模型组NGF、BDNF、bFGF降低有极显着差异,P<0.01;与高血脂合并脑缺血模型组比较,治疗Ⅰ组和治疗Ⅱ组NGF、bFGF上升有显着差异P<0.01;与高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ组比较,Ⅱ组NGF、BDNF降低有显着差异P<0.01。实验结果提示:高血脂可降低脑缺血后脑自身的保护作用,针刺可通过促进NGF、BDNF、bFGF的分泌和合成,从而起到脑保护的作用。针刺治疗Ⅰ组的NGF、BDNF高于Ⅱ组,说明在高血脂阶段积极进行针刺治疗可更好的提高神经营养因子分泌,从而起到脑保护的作用。实验结论:1高血脂合并脑缺血模型的建立是成功的。2高血脂本身并不能影响实验性高血脂大鼠右侧室管膜下区和右侧额叶皮层神经干细胞的增殖、迁移与分化,和右侧脑匀浆中NSE的表达,但能降低右侧大脑匀浆中神经营养因子,如NGF、BDNF、bFGF的分泌。3脑缺血能增强实验性脑缺血大鼠缺血侧室管膜下区和额叶皮层神经干细胞的增殖、迁移与分化,促进缺血侧脑组织中NSE的分泌,促进缺血侧脑组织中NGF、BDNF、bFGF的分泌与合成。4高血脂合并脑缺血,可减弱脑缺血后室管膜下区和右侧额叶皮层神经干细胞的增殖、迁移与分化,促进缺血侧脑组织NSE的分泌,降低缺血侧脑组织NGF、BDNF、bFGF的分泌,减弱大脑的自我保护作用。5针刺“丰隆”、“三阴交”,可降低实验性高血脂大鼠CHO、TG、LDL-C,升高HDL-C水平。针刺不能影响实验性高血脂大鼠高血脂后大脑右侧室管膜下区和额叶皮层神经干细胞的增殖、迁移与分化,和右侧脑组织中NSE的分泌,但能促进右侧脑组织中BDNF的分泌与合成。6针刺“百会”“人中”可改善实验性脑缺血大鼠神经行为症状评分,改善脑缺血状态,降低缺血侧NSE的分泌,增强实验性脑缺血大鼠缺血侧大脑室管膜下区和额叶皮层神经干细胞的增殖、迁移与分化,促进大脑缺血侧脑组织NGF、bFGF的分泌与合成。7针刺可降低高血脂合并脑缺血大鼠CHO、TG、LDL-C水平,升高HDL-C水平,改善高血脂合并脑缺血模型大鼠神经行为症状评分,改善脑缺血状态,可提高高血脂合并脑缺血后缺血侧室管膜下区和缺血区神经干细胞的增殖、迁移与分化,降低缺血侧脑组织中NSE的分泌,促进缺血侧脑组织中神经营养因子NGF、BDNF、bFGF的分泌与合成。8从高血脂阶段积极介入针刺治疗,可更好、更有效地调节血脂水平,改善脑缺血状态,明显提高高血脂合并脑缺血后缺血侧室管膜下区和缺血区神经干细胞的增殖、迁移与分化,降低缺血侧大脑NSE的分泌,促进缺血侧大脑匀浆中神经营养因子NGF、BDNF、bFGF的分泌与合成。9针刺能通过促进缺血侧脑组织NGF、BDNF、bFGF的分泌,降低NSE分泌,促进神经干细胞的增殖、迁移和分化,从而促进神经元的修复和再生。综上所述本实验结果显示,神经营养因子和神经干细胞增殖、迁移、分化之间存在必然联系。在实验性脑缺血和实验性高血脂合并脑缺血大鼠脑缺血造模后,神经营养因子含量的升高,往往同神经干细胞的增殖同时出现,所以猜测本实验脑缺血后是神经营养因子的升高促进了神经干细胞的增殖、迁移和分化。实验结果表明,针刺作为一种治疗手段在一定程度上促进了神经营养因子的分泌,从而最终促进了脑缺血后神经干细胞增殖、迁移、分化,尤其在高血脂阶段针刺治疗可减轻脑缺血后损伤,促进神经元的修复与再生。
屈雷[8]（2004）在《组织工程化角膜上皮与内皮的构建和移植》文中认为角膜作为眼球光学系统的重要组成部分，其上皮的完整性和透明度是良好视力的基本要求，临床上常见各种原因所引起的角膜缘干细胞及角膜上皮的损伤和缺失，使患者视力下降或致盲。上世纪九十年代以来，随着细胞培养技术和组织工程技术的兴起，组织工程化人工角膜、角膜上皮、内皮：基质细胞植片的构建与移植研究也正在兴起。为探索从根本上解决角膜疾患的新方法与途径，本研究用人流产儿、家兔和山羊角膜体外分离角膜缘干细胞、角膜基质细胞和内皮细胞；采用无饲养层细胞培养体系和冻存的角膜缘干细胞构建家兔和山羊角膜上皮组织，并自体移植到角膜缘干细胞完全缺失的动物模型角膜表面，恢复病损角膜上皮；同时，探索来源于自体的表皮干细胞替代角膜缘干细胞用于角膜上皮重建的可行性；利用体外快速扩增获得角膜内皮细胞，以羊膜和角膜基质为载体构建组织工程化角膜内皮组织，为组织工程角膜内皮层移植实验奠定基础。实验研究主要取得以下六个方面成果和进展： 1．流产儿角膜细胞经体外分离培养可甩于组织工程化角膜组织构建，并且认为移植时同种异体免疫反应更弱。但是，就人胎儿角膜细胞体外分离培养的条件和各类细胞的生长特性未见系统报道，资料相对缺乏。为了充分利用好胎儿角膜组织这一资源，本研究对30例人流产胎儿角膜上皮细胞，基质细胞和内皮细胞进行体外分离培养。发现胎儿角膜上皮细胞采用dispase消化法和完整的全层角膜组织贴壁法可获得纯化的角膜上皮细胞，传至10代冷冻保存；胎儿角膜基质细胞无论采用消化法还是组织块法都可得到纯化培养的目的，传至20代冷冻保存；而角膜内皮细胞体外纯化培养比较困难。 2．山羊或家兔角膜缘上皮组织用1．2 IU／ml dispase酶和0．25％胰蛋白酶4℃冷消化，认为1．2 IU／ml dispase酶是分离角膜缘干细胞较理想的消化酶，其作用时间以冷消化14h～16h为宜。比较DMEM／F12，RPMll640和EpilifeTM三种培养液培养原代山羊和家兔角膜缘干细胞用DMEM／F12培养液可提高细胞的传代次数。山羊角膜缘干细胞传至20代，家兔角膜缘干细胞己传至14代，于一196℃液态氮冷冻保存，获得稳定增殖的角膜缘干细胞。将角膜缘干细胞分别保存在4℃、一20℃、一80℃冰箱和一196℃液态氮中，分别在12～48 h，l～7 d、1～6周和1～6月解冻，经体外培养扩增，细胞在形态上和增殖能力上与冻存前基本相似。可以满足不同的实验条件下，对角膜缘干细胞的运输、保存和增殖的要求，为组织工程技术构建角膜上皮提供丰富的细胞来源。 3．为了制作角膜缘干细胞完全缺失，用于移植角膜缘干细胞的动物模型，将角膜缘上皮板层切除，中央角膜用1 N NaOH擦除上皮层的方法，成功制作实验性角膜缘干 <WP=7>细胞移植的病理模型。 4．本研究首次采用冻存的角膜缘干细胞和无饲养层细胞培养体系构建家兔角膜上皮组织，自体移植后观察对角膜缘干细胞缺失的治疗效果。结果7例移植羊膜角膜上皮的家兔，有2例有效，移植后角膜的透明度增加，新生血管和结膜组织明显减少，4例部分有效，1例无效；仅移植羊膜的4只家兔有3例无效，l例部分有效；未移植的3只家兔全部无效。认为构建的角膜上皮组织自体移植后可以修复角膜缘干细胞缺失的角膜上皮，为临床上角膜缘干细胞缺失所致的角膜疾患治疗提供新的措施。（该方法己申请了发明专利，申请专利号：200410026154．4）。 5．为了探索利用自体来源的表皮干细胞替代角膜缘干细胞用于角膜表面的重建的可行性，本文设计一种羊膜负载山羊表皮干细胞构建角膜上皮的新方法，进行移植治疗角膜缘干细胞完全缺损。通过与角膜缘上皮细胞构建的角膜上皮比较发现，表皮干细胞与角膜缘上皮细胞一样都可以在羊膜上培养形成复层上皮结构，细胞间形成致密连接，细胞在羊膜上形成半桥粒，重建了上皮基底膜。构建羊膜植片移植到角膜缘完全缺失的病理模型，在观察期内，表皮干细胞的异体移植组，观察期6～10个月，4只中有3只部分有效1只无效；表皮干细胞的自体移植组，观察期3～6个月，5只中有3只部分有效2只有待于进一步观察；角膜缘干细胞的自体移植组，观察期3～5个月，4只中有2只部分有效2只有待于进一步观察。3组移植效果未见明显不同，与仅移植羊膜组和对照组比较效果明显，恢复或部分恢复角膜上皮功能。但是，表皮干细胞替代角膜缘上皮细胞用于角膜表面的重建的机制和长期作用有待于进一步深入研究。（该方法已申请了发明专利，申请专利号：200410026031．0）。 6．体外扩增角膜内皮细胞时，在原代培养，以浓度为l×10-5×105个细胞／孔（即5×104个细胞／cm2）的细胞悬液并添加消化后的．Descemt膜，96小时后细胞形成与在体细胞相似的密集单层，快速获取纯化的角膜内皮细胞。传代培养时，以1×10-5×10个细膨孔的浓度传代，72小时生长成密集单层并可继续传代，现已传至第10代。用2～4代的角膜内皮细胞，以1×105个细胞／mI 的浓度接种分别到去上皮的人羊膜和去除Descemt膜的角膜基质上，体外培养构建角膜内皮。结果以羊膜和角膜基质为载体培养角膜内皮细胞，可体外形成?
封吉化,汤苏阳,曹云新,苏红,宣立平,张琳西[9]（2003）在《NGF对体外培养人血管内皮细胞细胞周期和PCNA表达的影响》文中提出目的 研究神经生长因子（Nerve growth factor,NGF）对人血管内皮细胞的细胞周期和对增殖细胞核抗原（Prolifer-ating cell nuclear antigen,PCNA）表达的影响。方法 将NGF作用于体外培养的HUEVC 304细胞,利用流式细胞仪检测其细胞周期、DNA相对含量的变化,利用免疫组织化学的方法检测对PCNA表达的改变。结果 NGF作用组出现G0～G1期细胞数量明显减少,S期细胞、G2-M期细胞明显增加,DNA相对含量无明显变化,PCNA表达明显增加（P<0.05）。结论 NGF能明显促进HEVC增殖。
王心妍[10]（2020）在《孕期叶酸对子代大鼠神经发育及学习记忆能力的作用及机制研究》文中认为目的 围孕期补充叶酸可以有效预防神经管畸形并提高子代认知表现,但孕中晚期是否有必要持续补充叶酸尚无定论。叶酸介导一碳单位代谢参与核酸合成和DNA甲基化,对中枢神经系统发育和功能至关重要。本研究采用大鼠生殖实验探讨孕期叶酸摄入对子代大鼠神经发育及学习记忆能力的影响,对孕中晚期补充叶酸的必要性进行探讨,为育龄女性合理补充叶酸提供理论依据;并初步探索其通过DNA甲基化影响神经发育过程及学习记忆能力的潜在机制。方法 将雌性SD大鼠分为:孕期叶酸缺乏组（FA-D）、孕期叶酸正常组（FA-N）、围孕期叶酸短期补充组（FA-S）和孕期叶酸长期补充组（FA-L）。收集母鼠外周血;子代新生鼠脑组织,同时体外培养海马神经干细胞（neural stem cells,NSCs）;部分子代鼠继续喂养至成年用于神经行为学检测。（1）血清叶酸检测:采用化学发光免疫法;（2）神经行为发育检测:采用触须定位反射、空中翻正反射、听觉惊愕反应、步态反射评价;（3）学习记忆能力检测:采用Morris水迷宫测试;（4）脑组织检测:透射电镜观察脑海马区超微结构;组织免疫荧光法检测神经元和增殖NSCs数量;western blots检测脑源生长因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）、突触小泡蛋白（synaptophysin,SYP）表达;（5）体外培养新生鼠海马NSCs检测:采用Alamar Blue检测细胞活力,Brd U掺入和细胞免疫荧光法检测增殖和神经元分化潜力;（6）DNA甲基化检测:采用高通量Me DIP-chip检测分析筛选雄性子代新生鼠脑组织甲基化差异基因;结合KEGG通路富集分析筛选与神经发育过程和学习记忆能力相关的通路。结果1.大鼠孕期补充叶酸促进幼年子代大鼠触须定位反射、空中翻正反射、听觉惊愕反应、步态反射成熟;改善子代大鼠青少年和成年期的空间学习记忆能力和脑海马区超微结构。孕期长期补充叶酸在促进子代触须定位反射和步态反射成熟,提高子代青少年期和成年期空间学习记忆能力方面优于围孕期短期补充叶酸。2.大鼠孕期补充叶酸促进其子代出生时脑海马神经元产生和NSCs增殖。分离海马NSCs进行体外培养,补充叶酸组体外培养的NSCs活力、增殖能力均较高,诱导分化后神经元比例增高。孕期补充叶酸的子代出生时皮层神经元数量增多,BDNF、SYP表达增加。孕期长期补充叶酸在促进子代新生鼠海马神经元产生、NSCs增殖,提高体外培养的NSCs活力、增殖能力方面优于围孕期短期补充叶酸。3.高通量Me DIP-chip检测分析结果显示,母亲孕期叶酸摄入改变雄性子代新生鼠脑组织DNA甲基化谱,FA-D/FA-N组间调节干细胞多能性信号通络、自噬、紧密连接、钙信号通路、m TOR信号通路、Notch信号通路、神经营养因子信号通路、内质网蛋白加工通路、c GMP-PKG信号通路、缝隙连接、Rap1信号通路和胞吞通路发生差异甲基化。FA-L/FA-N组间调节干细胞多能性信号通络、自噬、紧密连接、钙信号通路、MAPK信号通路、TGF-β信号通路、轴突导向通路、c GMP-PKG信号通路、缝隙连接、Erb B信号通路、谷氨酸能突触、神经活性配体-受体交互作用通路发生差异甲基化。结论 大鼠孕期补充叶酸,尤其是将围孕期补充叶酸的时间延长至整个孕期,促进子代大鼠神经行为发育,并提高其后期学习记忆能力,其机制可能与叶酸对脑海马区NSCs增殖、神经元分化,及皮层突触发育的促进作用有关,研究初步探索了基于DNA甲基化途径孕期叶酸影响子代大鼠神经发育过程及学习记忆能力的潜在机制。本研究为孕期合理补充叶酸提供理论依据,为后续相关机制的深入研究提供新思路。
二、NGF对体外培养人血管内皮细胞细胞周期和PCNA表达的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、NGF对体外培养人血管内皮细胞细胞周期和PCNA表达的影响（论文提纲范文）
（1）绵羊卵泡颗粒细胞中POSTN基因的表达调控及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 FSH调节卵泡发育 |
| 1.1.1 FSH调节卵泡发育功能 |
| 1.1.2 FSH协同信号轴调节卵泡颗粒细胞功能 |
| 1.2 AKT信号通路相关生物学调控机制研究 |
| 1.2.1 PI3K-AKT信号通路的激活及通信过程 |
| 1.2.2 PI3K-AKT信号通路的生物学作用 |
| 1.3 PI3K-AKT信号通路调控卵泡发育机制研究 |
| 1.4 FOXO1转录因子的功能研究进展 |
| 1.4.1 FOXO1在细胞中的生物学调控功能 |
| 1.4.2 FOXO1在卵泡中的细胞生物学调控功能 |
| 1.5 POSTN生物功能研究 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 2 实验一 绵羊POSTN基因的克隆及表达分析 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验样品 |
| 2.1.2 主要试剂与药品 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 不同直径卵泡及黄体分离 |
| 2.2.2 不同直径卵泡中MGCs,TCs,COC和Oocyte的收集 |
| 2.2.3 RNA提取和反转录 |
| 2.2.4 POSTN基因cDNA克隆 |
| 2.2.5 胶回收及转化 |
| 2.2.6 POSTN基因cDNA生物信息学分析 |
| 2.2.7 qRT-PCR方法检测POSTN在绵羊不同组织中的表达 |
| 2.2.8 免疫组化检测绵羊卵巢中POSTN的表达 |
| 2.2.9 Western Blot法检测POSTN蛋白表达 |
| 2.2.10 免疫荧光检测GCs中POSTN的表达 |
| 2.2.11 不同直径腔卵泡液中POSTN和生殖激素浓度检测 |
| 2.2.12 统计分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 绵羊组织及卵泡GCs总RNA提取 |
| 2.3.2 POSTN cDNA序列的克隆及生物信息学分析 |
| 2.3.3 POSTN基因在绵羊不同组织中表达分析 |
| 2.3.4 POSTN在不同直径卵泡及卵泡细胞中的表达分析 |
| 2.3.5 POSTN在GCs的定位及表达 |
| 2.3.6 不同直径卵泡中POSTN和FSH、LH和17β-E_2含量水平 |
| 2.3.7 POSTN与FSH、LH和17β-E_2在不同直径卵泡中相关性分析 |
| 2.3.8 POSTN mRNA与FSHR、LHR和ER表达相关性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 实验二 FSH对绵羊卵泡GCs中POSTN的表达具有调节作用 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 试验样品 |
| 3.1.2 主要试验试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 卵泡GCs收集 |
| 3.2.2 绵羊GCs凋亡检测 |
| 3.2.3 FSH对体外培养的GCs的活性影响 |
| 3.2.4 FSH对体外培养的GCs细胞周期检测 |
| 3.2.5 POSTN siRNA化学合成 |
| 3.2.6 绵羊卵泡中GCs原代培养 |
| 3.2.7 POSTN siRNA细胞转染 |
| 3.2.8 转染POSTN-siRNA后GCs活性检测 |
| 3.2.9 转染POSTN-siRNA后GCs周期检测 |
| 3.2.10 转染POSTN-siRNA后GCs凋亡检测 |
| 3.2.11 GCs复苏及培养 |
| 3.2.12 GCs RNA提取和逆转录 |
| 3.2.13 qRT-PCR检测GCs中POSTN-siRNA转染效率 |
| 3.2.14 qPCR检测GCs中基因表达 |
| 3.2.15 Western Blot法检测蛋白表达 |
| 3.2.16 数据分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 不同浓度FSH对体外培养的GCs生长的影响 |
| 3.3.2 不同浓度FSH对体外培养的GCs凋亡影响 |
| 3.3.3 不同浓度FSH对体外培养的GCs周期影响 |
| 3.3.4 FSH对GCs中POSTN不同时期表达影响 |
| 3.3.5 FSH上调GCs中PCNA,Ccnd-2,Bcl-2和POSTN表达 |
| 3.3.6 POSTN-siRNA干扰效率检测 |
| 3.3.7 转染POSTN-siRNA对GCs活性的影响 |
| 3.3.8 转染POSTN-siRNA对GCs凋亡的影响 |
| 3.3.9 敲减POSTN可增加GCs凋亡 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 实验三 FSH通过AKT-FOXO1信号通路激活转录因子SRF调控POSTN表达 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 试验样品 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 绵羊卵泡中GCs分离和原代培养 |
| 4.2.2 GCs复苏及培养 |
| 4.2.3 蛋白激酶活性测定 |
| 4.2.4 GCs RNA提取和逆转录 |
| 4.2.5 绵羊POSTN启动子克隆及生物信息学分析 |
| 4.2.6 绵羊POSTN启动子5'缺失片段克隆及载体构建 |
| 4.2.7 目段片段与载体连接 |
| 4.2.8 GCs转染及相对荧光素酶活性分析 |
| 4.2.9 POSTN启动子转录因子结合位点突变分析 |
| 4.2.10 染色质免疫沉淀(ChIP) |
| 4.2.11 PCR扩增 |
| 4.2.12 统计学分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 FSH诱导的细胞信号通路对POSTN表达的影响 |
| 4.3.2 GCs中AKT和FOXO1磷酸化激活POSTN表达 |
| 4.3.3 FSH通过AKT/FOXO1信号通路调控GCs中POSTN表达 |
| 4.3.4 POSTN启动子克隆及分析 |
| 4.3.5 POSTN启动子不同大小片段的克隆及载体构建 |
| 4.3.6 POSTN启动子活性分析 |
| 4.3.7 POSTN启动子活性区转录因子结合位点突变分析 |
| 4.3.8 ChIP鉴定转录因子结合 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 全文总体结论、创新点 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 6 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（2）细胞因子bFGF和LIF对雏鸡原始卵泡发育的调节作用及其机理的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 禽类卵泡生长情况和概述 |
| 1.1.1 鸡胚卵巢发育概述 |
| 1.1.2 鸡原始卵泡发生概述 |
| 1.1.3 鸡原始卵泡发育激活概述 |
| 1.1.3.1 PTEN/PI3K/AKT/FOXO3信号通路 |
| 1.1.3.2 抗缪勒氏管激素 |
| 1.2 细胞因子对早期卵泡发育的调控 |
| 1.2.1 成纤维细胞生长因子家族 |
| 1.2.2 白血病抑制因子 |
| 1.2.3 血管内皮生长因子 |
| 1.2.4 骨形态发生蛋白家族 |
| 1.2.4.1 BMPs |
| 1.2.4.2 GDF9 |
| 1.2.5 胰岛素样生长因子家族 |
| 1.2.6 神经生长因子 |
| 1.2.7 激活素、抑制素和卵泡抑素 |
| 1.3 激素对早期卵泡发育的调控 |
| 1.3.1 性腺激素 |
| 1.3.2 促性腺激素 |
| 1.3.3 生长激素 |
| 1.4 miRNA在早期卵巢发育中的作用 |
| 1.4.1 miRNA的作用方式 |
| 1.4.2 miRNA对雌性生殖的作用 |
| 1.5 lncRNA在早期卵巢发育中的作用 |
| 1.5.1 lncRNA的作用方式 |
| 1.5.2 lncRNA对雌性生殖的作用 |
| 1.6 本研究的目的和内容 |
| 1.6.1 研究目的和意义 |
| 1.6.2 研究目标和内容 |
| 1.6.3 技术路线 |
| 第二章 雏鸡卵巢早期卵泡发育中miRNA表达的变化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 主要器材 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 卵巢的获取 |
| 2.2.5 RNA的提取 |
| 2.2.6 RNA质量及浓度的检测 |
| 2.2.7 文库的构建及质量的检测 |
| 2.2.8 cDNA的合成 |
| 2.2.9 qRT-PCR |
| 2.2.10 测序数据的处理分析 |
| 2.2.11 差异表达基因的筛选 |
| 2.2.12 差异表达基因的聚类分析及富集分析 |
| 2.2.13 差异表达基因的靶基因预测 |
| 2.2.14 数据的处理分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 检测结果总表 |
| 2.3.2 RNA质量的鉴定 |
| 2.3.3 测序数据的质量评估及过滤 |
| 2.3.4 sRNA长度的筛选 |
| 2.3.5 与参考序列的比较 |
| 2.3.6 差异表达miRNA的筛选 |
| 2.3.7 RNA-seq结果的验证 |
| 2.3.8 不同发育阶段卵巢中差异表达miRNA的比较 |
| 2.3.9 miRNA及其主要靶基因的时间表达变化 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 雏鸡卵巢早期卵泡发育中lncRNA表达的变化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 主要器材 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.2.4 卵巢的获取 |
| 3.2.5 RNA的提取 |
| 3.2.6 RNA质量及浓度的检测 |
| 3.2.7 文库的构建及质量的检测 |
| 3.2.8 cDNA的合成 |
| 3.2.9 qRT-PCR |
| 3.2.10 测序数据的处理分析 |
| 3.2.11 差异表达基因的筛选 |
| 3.2.12 差异表达基因的聚类分析及富集分析 |
| 3.2.13 差异表达基因的靶基因预测 |
| 3.2.14 数据的处理分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 测序数据的质量评估与比较 |
| 3.3.2 差异表达lncRNA的筛选 |
| 3.3.3 RNA-seq结果的验证 |
| 3.3.4 lncRNA共定位基因的富集分析 |
| 3.3.5 lncRNA共表达基因的富集分析 |
| 3.3.6 不同发育阶段卵巢中差异表达lncRNA的比较 |
| 3.3.7 相关mRNA的差异表达 |
| 3.3.8 lncRNA及其主要靶基因的时间表达变化 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 bFGF对雏鸡原始卵泡发育的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 主要器材 |
| 4.2.3 主要试剂及配制 |
| 4.2.4 卵巢的获取 |
| 4.2.5 卵巢组织的培养和药物处理 |
| 4.2.6 制片及HE染色 |
| 4.2.7 免疫组化 |
| 4.2.8 RNA的提取 |
| 4.2.9 cDNA的合成 |
| 4.2.10 普通PCR及qPCR |
| 4.2.11 BrdU实验 |
| 4.2.12 TUNEL染色 |
| 4.2.13 Westen blot分析 |
| 4.2.14 数据的处理分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 FGFR1在雏鸡卵巢中定位及其表达的变化 |
| 4.3.2 bFGF在雏鸡卵巢中的定位 |
| 4.3.3 bFGF体外处理剂量的筛选 |
| 4.3.4 bFGF对卵泡细胞增殖的影响 |
| 4.3.5 bFGF对卵泡细胞凋亡的影响 |
| 4.3.6 bFGF对原始卵泡激活相关基因表达的影响 |
| 4.3.7 bFGF对原始卵泡激活的影响 |
| 4.3.8 FSHR在雏鸡卵巢中的定位 |
| 4.3.9 bFGF和FSH联合处理对卵泡细胞增殖和凋亡的影响 |
| 4.3.10 FSHR特异性证明 |
| 4.3.11 bFGF和FSH联合处理对细胞增殖相关信号转导蛋白表达的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 LIF对雏鸡原始卵泡发育的影响 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 实验动物 |
| 5.2.2 主要器材 |
| 5.2.3 主要试剂及配制 |
| 5.2.4 卵巢的获取 |
| 5.2.5 卵巢组织的培养和药物处理 |
| 5.2.6 制片及HE染色 |
| 5.2.7 免疫组化 |
| 5.2.8 BrdU实验 |
| 5.2.9 TUNEL染色 |
| 5.2.10 Western blot分析 |
| 5.2.11 透射电镜和细胞超微结构的观察 |
| 5.2.12 数据的处理分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 LIF在雏鸡卵巢中定位及其表达的变化 |
| 5.3.2 LIFR在雏鸡卵巢中定位及其表达的变化 |
| 5.3.3 LIF体外处理剂量的筛选 |
| 5.3.4 LIF对卵泡细胞增殖的影响 |
| 5.3.5 LIF对卵泡细胞凋亡的影响 |
| 5.3.6 LIF对体外培养雏鸡卵巢的缝隙连接的影响 |
| 5.3.7 LIF对原始卵泡激活的影响 |
| 5.3.8 LIF和bFGF联合处理对卵泡细胞发育以及相关信号蛋白表达的影响 |
| 5.3.9 卵泡发育中LIF和Wnt/β-catenin信号通路的交互作用 |
| 5.3.10 卵泡发育中bFGF和Wnt/β-catenin信号通路的交互作用 |
| 5.3.11 LIF体内处理剂量的筛选及其对雏鸡卵巢中增殖相关蛋白表达的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 提示和创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（3）血管重塑性疾病模型中NONO蛋白作用及其基因调控的机制（论文提纲范文）
| 论文Ⅰ 血管重塑性疾病组织NONO蛋白表达及其基因敲除作用机制 |
| 中文摘要Ⅰ |
| 英文摘要Ⅰ |
| 符号说明Ⅰ |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 论文Ⅱ NONO基因敲减ApoE~(-/-)小鼠中控制腹主动脉瘤的调控机制 |
| 中文摘要Ⅱ |
| 英文摘要Ⅱ |
| 符号说明Ⅱ |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 英文论文Ⅰ |
| 英文论文Ⅱ |
| 英文论文Ⅲ |
| 英文论文Ⅳ |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（4）神经生长因子调节牛睾丸支持细胞增殖的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 神经生长因子及其受体TRKA的概述 |
| 1.1 NGF的神经保护功能 |
| 1.2 抗NGF的疼痛抑制作用 |
| 1.3 NGF促进细胞增殖 |
| 第2章 神经生长因子调节雄性动物生殖生理 |
| 2.1 NGF在雄性生殖系统中的表达 |
| 2.2 NGF参与调节雄性动物行为表现 |
| 第3章 雄性动物支持细胞的研究进展 |
| 3.1 睾丸支持细胞参与激素调节 |
| 3.2 睾丸支持细胞形成重要屏障 |
| 3.3 睾丸支持细胞具备增殖能力 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 NGF及其受体TRKA在牛睾丸支持细胞中的表达 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 试验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 NGF对牛睾丸支持细胞增殖的影响 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 NGF调节NBS细胞增殖的机制 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者介绍及在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（5）IGF-1与EGF因子联合使用对毛兔毛囊生长的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 毛兔的介绍 |
| 1.1.1 毛兔产业现状 |
| 1.1.2 毛兔的毛品质类型 |
| 1.1.3 影响毛兔产毛性能的因素 |
| 1.1.3.1 含硫氨基酸对长毛兔产毛性能的影响 |
| 1.1.3.2 激素对毛兔产毛性能的影响 |
| 1.1.3.3 不同季节和养毛期对毛兔产毛性能的影响 |
| 1.2 毛囊的作用 |
| 1.2.1 毛囊的形成 |
| 1.2.2 毛囊的结构 |
| 1.2.3 毛囊的生长发育周期 |
| 1.3 毛囊体外培养研究进展 |
| 1.3.1 不同毛囊培养基 |
| 1.3.2 毛囊体外培养的研究现状 |
| 1.3.3 毛囊体外培养研究的价值及前景 |
| 1.4 生长因子对动物毛发生长的影响 |
| 1.4.1 成纤维生长因子 |
| 1.4.2 胰岛素样生长因子 |
| 1.4.3 表皮生长因子 |
| 1.4.4 生长激素 |
| 1.4.5 淋巴样增强因子-1 |
| 1.4.6 Wnt家族基因2 |
| 1.5 研究的目的与意义 |
| 第2章 不同体外培养条件对毛兔毛囊体外培养的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.1.1 实验动物 |
| 2.1.1.2 实验主要试剂 |
| 2.1.1.3 实验主要仪器 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.2.1 双抗生理盐水 |
| 2.1.2.2 试剂基配置 |
| 2.1.2.3 培养基配置 |
| 2.1.2.4 毛囊分离培养 |
| 2.1.2.5 实验分组 |
| 2.1.2.6 组织形态HE染色 |
| 2.1.2.7 增殖细胞核抗原(PCNA)免疫荧光染色 |
| 2.1.2.8 数据分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 不同培养基对体外培养毛囊生长的影响 |
| 2.2.2 毛干生长速度变化 |
| 2.2.3 不同培养基对体外培养毛囊器官结构的影响 |
| 2.2.4 不同培养基对体外培养毛囊细胞增殖能力的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 IGF-1与EGF因子对毛兔毛囊体外生长的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.1.1 实验试剂 |
| 3.1.1.2 实验仪器 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.2.1 毛兔毛乳头细胞系的培养 |
| 3.1.2.2 毛乳头细胞分组 |
| 3.1.2.3 兔毛乳头细胞生长曲线的测定 |
| 3.1.2.4 毛囊分离培养 |
| 3.1.2.5 体外毛囊培养分组 |
| 3.1.2.6 数据分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 不同浓度IGF-1与EGF因子对毛乳头细胞增殖的影响 |
| 3.2.2 IGF-1与EGF因子联合使用对体外培养毛囊生长的影响 |
| 3.2.3 IGF-1与EGF因子联合使用对体外培养毛囊器官结构的影响 |
| 3.2.4 IGF-1与EGF因子联合使用对体外培养毛囊表达能力的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 IGF-1与EGF因子联用对毛兔毛发生长的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.1.1 实验动物 |
| 4.1.1.2 实验主要试剂和仪器 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.1.2.1 建立毛兔毛发生长模型 |
| 4.1.2.2 毛兔初步观察 |
| 4.1.2.3 毛兔皮肤标本采集 |
| 4.1.2.4 组织病理学检测 |
| 4.1.2.5 增殖细胞核抗原(PCNA)免疫荧光染色 |
| 4.1.2.6 RNA提取 |
| 4.1.2.7 cDNA反转录 |
| 4.1.2.8 荧光定量PCR |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 IGF-1和EGF因子联合使用对毛兔毛发生长的影响 |
| 4.2.2 IGF-1和EGF因子联合使用对毛兔皮肤组织结构的影响 |
| 4.2.3 不同时间毛兔背皮PCNA免疫荧光染色 |
| 4.2.4 IGF-1与EGF因子联合使用对毛囊发育相关基因表达的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表学术论文 |
| 致谢 |
（6）山羊角膜上皮细胞与角膜内皮细胞分离培养研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 角膜的早期胚胎发育、组织结构和生理功能 |
| 1.1 角膜的早期胚胎发育 |
| 1.1.1 胚眼的形成 |
| 1.1.2 角膜的发生与形成 |
| 1.1.3 角膜内皮的胚胎发育 |
| 1.2 角膜的解剖结构 |
| 1.3 角膜的组织结构 |
| 1.3.1 上皮细胞层 |
| 1.3.2 前弹力膜 |
| 1.3.3 基质层 |
| 1.3.4 后弹力膜 |
| 1.3.5 内皮细胞层 |
| 1.4 角膜缘 |
| 1.5 角膜的生理功能 |
| 1.5.1 角膜的透明性 |
| 1.5.2 角膜的渗透性 |
| 1.5.3 角膜的生理免疫功能 |
| 1.5.4 角膜的营养和代谢 |
| 1.5.5 角膜的修复 |
| 1.5.6 角膜的知觉 |
| 第二章 角膜缘干细胞 |
| 2.1 角膜缘干细胞的概念与定位 |
| 2.1.1 干细胞的概念和特点 |
| 2.1.2 角膜缘干细胞及其定位 |
| 2.2 角膜缘干细胞的微环境 |
| 2.3 角膜缘干细胞的特异性标记 |
| 2.4 角膜缘干细胞体外培养 |
| 2.4.1 角膜缘干细胞的分离培养方法 |
| 2.4.2 角膜缘干细胞的培养条件 |
| 2.4.3 体外培养的角膜缘干细胞鉴定方法 |
| 2.5 角膜缘干细胞的临床应用 |
| 2.5.1 自体角膜缘干细胞的移植 |
| 2.5.2 异体角膜缘干细胞移植 |
| 2.5.3 角膜缘干细胞体外培养后移植 |
| 第三章 人羊膜在眼科临床应用的研究进展 |
| 3.1 羊膜的生物学特性 |
| 3.2 人羊膜的制备与保存 |
| 3.2.1 羊膜的制备 |
| 3.2.2 羊膜的保存 |
| 3.3 羊膜在眼科领域的应用 |
| 3.3.1 羊膜在各种眼表疾病治疗中的应用 |
| 3.3.2 作为药物缓释系统 |
| 3.4 问题与展望 |
| 第四章 角膜内皮细胞研究进展 |
| 4.1 角膜内皮细胞的增殖能力 |
| 4.1.1 角膜内皮细胞的结构和功能 |
| 4.1.2 角膜内皮细胞体内不增殖的证据 |
| 4.1.3 体内抑制角膜内皮细胞增殖的机制 |
| 4.1.4 细胞周期与角膜内皮细胞增殖 |
| 4.1.5 年龄与角膜内皮细胞增殖 |
| 4.1.6 促进角膜内皮细胞增殖的因素 |
| 4.2 角膜内皮细胞干细胞 |
| 4.3 角膜内皮细胞的体外培养 |
| 4.3.1 角膜内皮细胞的分离培养研究 |
| 4.3.2 角膜内皮细胞的鉴定 |
| 4.4 培养的角膜内皮细胞移植 |
| 第五章 组织工程化人工角膜的研究 |
| 5.1 人工角膜的研究简史 |
| 5.2 组织工程化人工角膜的构建 |
| 5.2.1 种子细胞 |
| 5.2.2 载体研究 |
| 5.2.3 组织工程全层角膜的构建及移植 |
| 第六章 山羊角膜缘上皮细胞的体外分离培养与鉴定 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 体外培养的角膜缘上皮细胞的生长特性 |
| 6.2.2 生长曲线及群体倍增时间 |
| 6.2.3 贴壁率 |
| 6.2.4 角膜缘上皮细胞的冻存与复苏 |
| 6.2.5 免疫组化染色 |
| 6.2.6 RT-PCR 检测结果 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 山羊角膜缘上皮细胞生长特性 |
| 6.3.2 角膜缘干细胞的鉴定 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 组织工程化人工角膜上皮的构建 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 材料 |
| 7.1.2 羊膜的制备与保存 |
| 7.1.3 角膜缘上皮细胞的培养 |
| 7.1.4 羊膜角膜上皮植片的构建 |
| 7.1.5 不同冻存时间羊膜对角膜缘上皮细胞培养的影响 |
| 7.1.6 羊膜上皮细胞对角膜缘上皮细胞生长的影响 |
| 7.1.7 正常山羊角膜的采集 |
| 7.1.8 石蜡切片的制备和HE 染色 |
| 7.1.9 免疫组化染色观察 |
| 7.1.10 透射电镜观察 |
| 7.1.11 数据统计 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 组织工程人工角膜的构建 |
| 7.2.2 不同冻存时间羊膜对角膜缘上皮细胞生长的影响 |
| 7.2.3 羊膜上皮细胞对角膜缘上皮细胞生长的影响 |
| 7.3 讨论 |
| 7.3.1 组织工程人工角膜的构建 |
| 7.3.2 冻存不同时间去上皮羊膜对角膜缘上皮细胞的影响 |
| 7.3.3 羊膜上皮细胞对角膜缘上皮细胞生长的影响 |
| 7.4 小结 |
| 第八章 山羊角膜内皮细胞的分离培养与鉴定 |
| 8.1 材料和方法 |
| 8.1.1 材料 |
| 8.1.2 方法 |
| 8.2 结果 |
| 8.2.1 GCECs 培养方法的比较 |
| 8.2.2 GCECs 生长特性 |
| 8.2.3 培养体系筛选 |
| 8.2.4 GCECs 的鉴定 |
| 8.2.5 GCECs 在羊膜上的培养 |
| 8.3 讨论 |
| 8.3.1 角膜内皮细胞分离纯化与鉴定 |
| 8.3.2 角膜内皮细胞的生长特性 |
| 8.3.3 培养体系筛选 |
| 8.4 小结 |
| 第九章 山羊角膜内皮细胞人端粒酶逆转录酶基因转染 |
| 9.1 材料与方法 |
| 9.1.1 材料 |
| 9.1.2 方法 |
| 9.2 结果 |
| 9.2.1 pC1-neo-hTERTT 质粒双酶切鉴定 |
| 9.2.2 RT-PCR 检测细胞中外源性hTERT 的表达 |
| 9.2.3 免疫组化染色结果 |
| 9.2.4 细胞形态观察 |
| 9.2.5 细胞生长曲线 |
| 9.3 讨论 |
| 9.4 小结 |
| 结论 |
| 本研究的创新之处和尚需进一步研究的课题 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）针刺对高血脂合并脑缺血大鼠神经干细胞和神经营养因子的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语（abbeviations） |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 针刺治疗高血脂的研究进展 |
| 1 中医对高脂血症认识 |
| 2 高血脂的病因病机 |
| 3 针刺治疗高血脂的临床研究 |
| 4 针刺治疗高血脂的实验研究 |
| 5 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 中医学对中风病的认识 |
| 1 病名 |
| 2 病位 |
| 3 病因 |
| 4 促发因素 |
| 5 临床症状 |
| 6 辨证施治 |
| 7 预后 |
| 8 针灸在治疗中风中的作用 |
| 参考文献 |
| 综述三 针刺对实验性脑缺血作用机制的研究进展 |
| 1 针刺对脑缺血合并症的实验研究 |
| 2 针刺抗脑缺血的作用机制研究 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 综述四 神经干细胞与脑缺血 |
| 1 神经干细胞的发现 |
| 2 神经干细胞的概念 |
| 3 神经干细胞的生物学特性 |
| 4 神经干细胞的定位和标记 |
| 5 脑缺血与NSC 的激活 |
| 6 脑缺血时影响NSC 增殖的因素 |
| 7 针灸与脑缺血后神经干细胞的研究现状 |
| 8 研究展望与科学意义 |
| 参考文献 |
| 综述五 神经营养因子与脑缺血及神经干细胞的关系 |
| 1 神经干细胞分化及其相关因子 |
| 2 NGF 家族与脑缺血及神经干细胞的关系 |
| 2.1 NGF |
| 2.2 BDNF |
| 3 GDNF 家族与脑缺血及神经干细胞的关系 |
| 4 其他生长因子与脑缺血及神经干细胞的关系 |
| 4.1 bFGF |
| 4.2 其他生长因子 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 前言 |
| 实验一 高血脂合并脑缺血大鼠模型的建立 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 电针对实验性高血脂大鼠血脂四项的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验三 电针对高血脂合并脑缺血大鼠血脂四项的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验四 针刺对实验性脑缺血神经行为及脑缺血病理改变的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| HE 染色图 |
| 实验五 针刺对高血脂合并脑缺血大鼠Nestin 的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| Nestin 表达图 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验六 针刺对高血脂合并脑缺血大鼠PCNA 的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| PCNA 表达图 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验七 针刺对高血脂合并脑缺血大鼠vimentin 的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| Vimentin 表达图 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验八 针刺对高血脂合并脑缺血大鼠Tuj-1 的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| Tuj-1 表达图 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验九 针刺对高血脂合并脑缺血大鼠神经元特异性烯醇化酶（NSE）的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验十 针刺对高血脂合并脑缺血大鼠神经营养因子NGF、BDNF、bFGF 的影响.. |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综合讨论 |
| 实验结论 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）组织工程化角膜上皮与内皮的构建和移植（论文提纲范文）
| 中文摘要I |
| 英文摘要V |
| 文献综述部分 |
| 第一章 角膜的解剖组织结构和早期形态发生 |
| 1.1 角膜的大体解剖学 |
| 1.2 角膜缘的组织解剖 |
| 1.3 泪膜 |
| 1.4 角膜的组织学 |
| 1.4.1 角膜上皮层 |
| 1.4.2 前弹力层 |
| 1.4.3 基质层 |
| 1.4.4 后弹力层 |
| 1.4.5 内皮层 |
| 1.4.6 角膜的神经支配和血液供应 |
| 1.5 角膜的早期形态发生 |
| 第二章 角膜缘干细胞 |
| 2.1 角膜缘干细胞概念与定位 |
| 2.2 角膜缘干细胞在其微环境中生物学特性研究 |
| 2.2.1 角膜缘干细胞生存微环境的研究 |
| 2.2.2 微环境中调节干细胞凋亡的因素 |
| 2.3 角膜缘干细胞培养与体外生长特性 |
| 2.3.1 获取和培养原代角膜缘干细胞的一般方法 |
| 2.3.2 角膜缘干细胞的培养条件的选择 |
| 2.3.3 角膜缘干细胞体外培养的载体 |
| 2.3.4 体外培养的角膜缘干细胞的鉴别方法 |
| 2.3.5 角膜缘干细胞体外培养的动力学及形态学研究方法 |
| 2.3.6 角膜缘干细胞增殖分化的机制 |
| 2.3.7 角膜缘干细胞体外培养表现功能性神经元特性 |
| 2.3.8 角膜上皮细胞的可塑性研究 |
| 2.4 展望 |
| 第三章 角膜缘干细胞移植及人工角膜的研究 |
| 3.1 角膜移植发展简史 |
| 3.2 角膜缘干细胞移植 |
| 3.2.1 自体角膜缘干细胞移植 |
| 3.2.2 异体角膜缘干细胞移植 |
| 3.2.3 角膜缘干细胞体外培养后移植 |
| 3.2.4 展望 |
| 3.3 角膜缘干细胞移植免疫生物学 |
| 3.3.1 角膜的免疫生物学特性 |
| 3.3.2 角膜免疫赦免机制 |
| 3.3.3 角膜缘干细胞移植排斥反应的机制及防治策略 |
| 3.4 人工角膜的研究 |
| 3.4.1 人工角膜材料 |
| 3.4.2 人工角膜的分类 |
| 3.4.3 人工角膜的生物学反应 |
| 3.4.4 人工角膜移植手术的适应症及理想的人工角膜 |
| 3.4.5 人工角膜研究的展望 |
| 第四章 组织工程化角膜的研究 |
| 4.1 组织工程的研究概述 |
| 4.1.1 组织工程学概念的提出及其研究意义 |
| 4.1.2 组织工程学研究的核心问题 |
| 4.1.3 组织工程技术的临床应用研究展望 |
| 4.2 组织工程化角膜组织的研究 |
| 4.2.1 种子细胞的来源 |
| 4.2.2 载体及三维角膜构建 |
| 4.2.3 工程化角膜的特征 |
| 4.3 组织工程化羊膜角膜上皮植片的构建 |
| 4.3.1 羊膜作为构建角膜上皮移植片载体的基础研究 |
| 4.3.2 羊膜负载角膜缘干细胞植片的构建 |
| 4.3.3 角膜缘干细胞在羊膜上的生物学特性 |
| 4.3.4 移植羊膜角膜植片手术和术后护理与观察 |
| 4.3.5 问题与展望 |
| 4.4 组织工程角膜内皮细胞增殖培养与移植 |
| 4.4.1 角膜内皮细胞的增殖 |
| 4.4.2 角膜内皮细胞移植的进展 |
| 4.4.3 角膜内皮移植的长处与不足 |
| 4.5 应用与展望 |
| 实验研究部分 |
| 第五章 人胎儿角膜细胞成分的分离与培养 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 细胞培养液 |
| 5.1.2 人胎儿角膜的处理 |
| 5.1.3 角膜上皮细胞的分离与培养 |
| 5.1.4 角膜内皮细胞的分离与培养 |
| 5.1.5 角膜基质细胞分离与培养 |
| 5.1.6 观察 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 角膜上皮细胞 |
| 5.2.2 角膜内皮细胞 |
| 5.2.3 角膜基质细胞 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 角膜缘干细胞的分离与体外保存 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 角膜缘干细胞分离优化的结果 |
| 6.2.2 不同培养液对角膜缘干细胞培养的生长曲线分析 |
| 6.2.3 角膜缘干细胞在体外不同温度下保存的结果 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 角膜缘干细胞完全缺失病理模型的制作 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 主要仪器与药品 |
| 7.1.2 试验动物及各组处理方法 |
| 7.1.3 手术过程 |
| 7.1.4 术后观察与评分标准 |
| 7.1.5 细胞印迹学检查 |
| 7.1.6 病理学检查 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 术后观察 |
| 7.2.2 病理学检查 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 第八章 家兔角膜上皮植片无饲养层构建与自体移植 |
| 8.1 材料与方法 |
| 8.1.1 实验动物及角膜缘干细胞缺失病理模型的制作 |
| 8.1.2 角膜缘干细胞的解冻与培养 |
| 8.1.3 羊膜的制备 |
| 8.1.4 羊膜角膜上皮植片的构建 |
| 8.1.5 羊膜角膜植片的移植手术 |
| 8.1.6 移植效果观察 |
| 8.2 结果 |
| 8.2.1 角膜缘干细胞缺失病理模型的制作 |
| 8.2.2 羊膜角膜上皮植片的构建 |
| 8.2.3 羊膜角膜上皮植片移植后观察与结果 |
| 8.3 讨论 |
| 8.4 小结 |
| 第九章 羊膜负载表皮干细胞重建角膜上皮的研究 |
| 9.1 材料与方法 |
| 9.1.1 实验动物与分组 |
| 9.1.2 角膜缘干细胞缺失模型制作 |
| 9.1.3 人羊膜的制备 |
| 9.1.4 山羊表皮干细胞 |
| 9.1.5 山羊角膜缘干细胞的分离培养与鉴定 |
| 9.1.6 表皮干细胞与角膜缘干细胞羊膜植片构建 |
| 9.1.7 移植 |
| 9.2 结果 |
| 9.2.1 表皮干细胞与角膜缘干细胞羊膜植片培养 |
| 9.2.2 超微结构特征 |
| 9.2.3 移植效果 |
| 9.3 讨论 |
| 9.4 小结 |
| 第十章 组织工程角膜内皮的体外构建 |
| 10.1 材料和方法 |
| 10.1.1 材料 |
| 10.1.2 方法 |
| 10.2 结果 |
| 10.2.1 家兔角膜内皮细胞原代培养 |
| 10.2.2 内皮细胞传代培养的特性 |
| 10.2.3 不同接种浓度对角膜内皮细胞传代的影响 |
| 10.2.4 角膜内皮在羊膜和角膜基质上的体外构建 |
| 10.3 讨论 |
| 10.4 小结 |
| 结论 |
| 进一步研究的设想 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 致 谢 |
| 作者简介 |
（10）孕期叶酸对子代大鼠神经发育及学习记忆能力的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、孕期叶酸对子代大鼠神经行为发育及学习记忆能力的影响 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 实验方法 |
| 1.1.3 统计分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 孕期叶酸对受孕率和产前体重的影响 |
| 1.2.2 孕期叶酸摄入对母鼠孕期血清叶酸水平的影响 |
| 1.2.3 孕期叶酸对子代大鼠神经行为发育的作用 |
| 1.2.4 孕期叶酸对子代大鼠空间学习记忆能力的影响 |
| 1.2.5 孕期叶酸对子代大鼠脑海马区超微结构的影响 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 孕期叶酸干预的剂量选择 |
| 1.3.2 孕期补充叶酸促进子代大鼠幼年神经发育 |
| 1.3.3 孕期补充叶酸对提高子代大鼠学习记忆能力具有长期效应 |
| 1.3.4 孕期全程比围孕期补充叶酸更利于提高子代的神经行为表现 |
| 1.4 小结 |
| 二、孕期叶酸对子代新生大鼠脑海马神经干细胞增殖分化及皮层突触的影响 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.3 统计分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 孕期叶酸对子代新生鼠脑海马区神经元数量及NSCs增殖的影响 |
| 2.2.2 体外培养新生鼠脑海马区NSCs的鉴定 |
| 2.2.3 孕期叶酸对体外培养新生鼠海马NSCs细胞活力的影响 |
| 2.2.4 孕期叶酸对体外培养新生鼠海马NSCs增殖潜力的影响 |
| 2.2.5 孕期叶酸对体外培养新生鼠海马NSCs神经元分化潜力的影响 |
| 2.2.6 孕期叶酸对新生鼠脑皮层神经元数量及BDNF、SYP表达的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 孕期补充叶酸通过提高新生鼠海马区NSCs增殖及神经元分化潜力促进海马神经发育 |
| 2.3.2 孕期补充叶酸促进新生鼠皮层突触发育 |
| 2.3.3 孕期全程比围孕期补充叶酸更利于新生鼠脑海马区神经发育 |
| 2.4 小结 |
| 三、孕期叶酸对雄性子代大鼠神经发育及学习记忆能力相关通路甲基化的影响 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.3 分析研究过程 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 孕期叶酸对雄性子代新生大鼠脑组织DNA甲基化谱的影响 |
| 3.2.2 孕期叶酸对雄性子代神经发育及学习记忆相关基因甲基化的作用 |
| 3.2.3 孕期叶酸对雄性子代神经发育相关通路甲基化的作用 |
| 3.2.4 孕期叶酸对雄性子代学习记忆能力相关通路甲基化的作用 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 孕期叶酸改变雄性子代新生大鼠脑组织DNA甲基化谱 |
| 3.3.2 孕期叶酸通过DNA甲基化影响子代神经发育的潜在机制 |
| 3.3.3 孕期叶酸通过DNA甲基化影响子代学习记忆能力的潜在机制 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 DNA甲基化调控神经发育的研究进展及叶酸的潜在作用 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、NGF对体外培养人血管内皮细胞细胞周期和PCNA表达的影响（论文参考文献）
- [1]绵羊卵泡颗粒细胞中POSTN基因的表达调控及功能研究[D]. 刘春洁. 内蒙古农业大学, 2020(06)
- [2]细胞因子bFGF和LIF对雏鸡原始卵泡发育的调节作用及其机理的研究[D]. 郭长权. 浙江大学, 2020
- [3]血管重塑性疾病模型中NONO蛋白作用及其基因调控的机制[D]. 徐兴丽. 山东大学, 2020(11)
- [4]神经生长因子调节牛睾丸支持细胞增殖的机制研究[D]. 牛巧歌. 吉林大学, 2020(08)
- [5]IGF-1与EGF因子联合使用对毛兔毛囊生长的影响[D]. 陈秋燃. 扬州大学, 2020(05)
- [6]山羊角膜上皮细胞与角膜内皮细胞分离培养研究[D]. 赵清梅. 西北农林科技大学, 2008(12)
- [7]针刺对高血脂合并脑缺血大鼠神经干细胞和神经营养因子的影响[D]. 任秀君. 北京中医药大学, 2007(02)
- [8]组织工程化角膜上皮与内皮的构建和移植[D]. 屈雷. 西北农林科技大学, 2004(04)
- [9]NGF对体外培养人血管内皮细胞细胞周期和PCNA表达的影响[J]. 封吉化,汤苏阳,曹云新,苏红,宣立平,张琳西. 武警医学, 2003(12)
- [10]孕期叶酸对子代大鼠神经发育及学习记忆能力的作用及机制研究[D]. 王心妍. 天津医科大学, 2020(06)