一、Differences in TGFβ signaling in quiescent and activated hepatic stellate cells（论文文献综述）
Christopher Hadjittofi,Michael Feretis,Jack Martin,Simon Harper,Emmanuel Huguet[1]（2021）在《Liver regeneration biology: Implications for liver tumour therapies》文中进行了进一步梳理The liver has remarkable regenerative potential, with the capacity to regenerate after 75% hepatectomy in humans and up to 90% hepatectomy in some rodent models, enabling it to meet the challenge of diverse injury types, including physical trauma, infection, inflammatory processes, direct toxicity, and immunological insults. Current understanding of liver regeneration is based largely on animal research, historically in large animals, and more recently in rodents and zebrafish, which provide powerful genetic manipulation experimental tools. Whilst immensely valuable, these models have limitations in extrapolation to the human situation. In vitro models have evolved from 2-dimensional culture to complex 3 dimensional organoids, but also have shortcomings in replicating the complex hepatic micro-anatomical and physiological milieu. The process of liver regeneration is only partially understood and characterized by layers of complexity. Liver regeneration is triggered and controlled by a multitude of mitogens acting in autocrine, paracrine, and endocrine ways, with much redundancy and cross-talk between biochemical pathways. The regenerative response is variable, involving both hypertrophy and true proliferative hyperplasia, which is itself variable, including both cellular phenotypic fidelity and cellular trans-differentiation, according to the type of injury. Complex interactions occur between parenchymal and non-parenchymal cells, and regeneration is affected by the status of the liver parenchyma, with differences between healthy and diseased liver. Finally, the process of termination of liver regeneration is even less well understood than its triggers. The complexity of liver regeneration biology combined with limited understanding has restricted specific clinical interventions to enhance liver regeneration. Moreover, manipulating the fundamental biochemical pathways involved would require cautious assessment, for fear of unintended consequences. Nevertheless, current knowledge provides guiding principles for strategies to optimise liver regeneration potential.
Ming-Yu Zhou,Ming-Liang Cheng,Tao Huang,Rui-Han Hu,Gao-Liang Zou,Hong Li,Bao-Fang Zhang,Juan-Juan Zhu,Yang Liu,Yong-Mei Liu,Xue-Ke Zhao[2]（2021）在《Transforming growth factor beta-1 upregulates glucose transporter 1 and glycolysis through canonical and noncanonical pathways in hepatic stellate cells》文中进行了进一步梳理BACKGROUND Hepatic stellate cells（HSCs） are the key effector cells mediating the occurrence and development of liver fibrosis, while aerobic glycolysis is an important metabolic characteristic of HSC activation. Transforming growth factor-β1（TGF-β1） induces aerobic glycolysis and is a driving factor for metabolic reprogramming. The occurrence of glycolysis depends on a high glucose uptake level. Glucose transporter 1（GLUT1） is the most widely distributed glucose transporter in the body and mainly participates in the regulation of carbohydrate metabolism, thus affecting cell proliferation and growth. However, little is known about the relationship between TGF-β1 and GLUT1 in the process of liver fibrosis and the molecular mechanism underlying the promotion of aerobic glycolysis in HSCs.AIM To investigate the mechanisms of action of GLUT1, TGF-β1 and aerobic glycolysis in the process of HSC activation during liver fibrosis.METHODS Immunohistochemical staining and immunofluorescence assays were used to examine GLUT1 expression in fibrotic liver tissue. A Seahorse extracellular flux（XF） analyzer was used to examine changes in aerobic glycolytic flux, lactate production levels and glucose consumption levels in HSCs upon TGF-β1 stimulation. The mechanism by which TGF-β1 induces GLUT1 protein expression in HSCs was further explored by inhibiting/promoting the TGF-β1/mothersagainst-decapentaplegic-homolog 2/3（Smad2/3） signaling pathway and inhibiting the p38 and phosphoinositide 3-kinase（PI3 K）/AKT signaling pathways. In addition, GLUT1 expression was silenced to observe changes in the growth and proliferation of HSCs. Finally, a GLUT1 inhibitor was used to verify the in vivo effects of GLUT1 on a mouse model of liver fibrosis.RESULTS GLUT1 protein expression was increased in both mouse and human fibrotic liver tissues. In addition, immunofluorescence staining revealed colocalization of GLUT1 and alpha-smooth muscle actin proteins, indicating that GLUT1 expression was related to the development of liver fibrosis. TGF-β1 caused an increase in aerobic glycolysis in HSCs and induced GLUT1 expression in HSCs by activating the Smad, p38 MAPK and P13 K/AKT signaling pathways. The p38 MAPK and Smad pathways synergistically affected the induction of GLUT1 expression. GLUT1 inhibition eliminated the effect of TGF-β1 on HSC proliferation and migration. A GLUT1 inhibitor was administered in a mouse model of liver fibrosis, and GLUT1 inhibition reduced the degree of liver inflammation and liver fibrosis.CONCLUSION TGF-β1 induces GLUT1 expression in HSCs, a process related to liver fibrosis progression. In vitro experiments revealed that TGF-β1-induced GLUT1 expression might be one of the mechanisms mediating the metabolic reprogramming of HSCs. In addition, in vivo experiments also indicated that the GLUT1 protein promotes the occurrence and development of liver fibrosis.
Devaraj Ezhilarasan[3]（2021）在《Mitochondria: A critical hub for hepatic stellate cells activation during chronic liver diseases》文中指出Background: Upon liver injury, quiescent hepatic stellate cells（q HSCs）, reside in the perisinusoidal space, phenotypically transdifferentiate into myofibroblast-like cells（MFBs）. The q HSCs in the normal liver are less fibrogenic, migratory, and also have less proliferative potential. However, activated HSCs（a HSCs） are more fibrogenic and have a high migratory and proliferative MFBs phenotype. HSCs activation is a highly energetic process that needs abundant intracellular energy in the form of adenosine triphosphate（ATP） for the synthesis of extracellular matrix（ECM） in the injured liver to substantiate the injury. Data sources: The articles were collected through Pub Med and EMBASE using search terms "mitochondria and hepatic stellate cells", "mitochondria and HSCs", "mitochondria and hepatic fibrosis", "mitochondria and liver diseases", and "mitochondria and chronic liver disease", and relevant publications published before September 31, 2020 were included in this review. Results: Mitochondria homeostasis is affected during HSCs activation. Mitochondria in a HSCs are highly energetic and are in a high metabolically active state exhibiting increased activity such as glycolysis and respiration. a HSCs have high glycolytic enzymes expression and glycolytic activity induced by Hedgehog（Hh） signaling from injured hepatocytes. Increased glycolysis and aerobic glycolysis（Warburg effect） endproducts in a HSCs consequently activate the ECM-related gene expressions. Increased Hh signaling from injured hepatocytes downregulates peroxisome proliferator-activated receptor-γ expression and decreases lipogenesis in a HSCs. Glutaminolysis and tricarboxylic acid cycle liberate ATPs that fuel HSCs to proliferate and produce ECM during their activation. Conclusions: Available studies suggest that mitochondria functions can increase in parallel with HSCs activation. Therefore, mitochondrial modulators should be tested in an elaborate manner to control or prevent the HSCs activation during liver injury to subsequently regress hepatic fibrosis.
王晓玲[4]（2021）在《β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1转录因子调控肝星状细胞改善肝脏纤维化的机制研究》文中研究表明肝纤维化是肝脏组织急性或慢性细胞损伤引起的可逆性伤口愈合反应,反映了肝脏修复和瘢痕形成之间的平衡[1]。目前肝脏慢性纤维化疾病的总负担不断增长,全世界每年约有200万人因此死亡[2,3]。然而,尽管对纤维化病理生理机制取得了实质性进展,但在确定抗纤维化靶点并转化为有效治疗方面仍为空白[3,4],因此,减轻或逆转肝纤维化的研究具有直接的临床意义[5]。肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSCs）作为肝纤维化发病机制的主要调节因子,旁分泌或自分泌转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）,调控肝纤维化过程中胶原纤维等细胞外基质的合成、沉积、降解[4,6,7]。近期研究表明,TGF-β/SMAD信号通路中,SMADs需要与其它DNA结合转录因子相互作用,即β-catenin与T细胞因子（T cell factor,TCF）、叉形头转录因子O1（Forkhead box O1,FOXO1）和乏氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1,HIF-1）相互作用,调控TGF-β/SMAD信号通路,其相对活性取决于结合β-catenin的“转录伴侣”[8]。当β-catenin与TCF结合时,促进细胞增殖和纤维化[9],然而在与FOXO1结合后,发挥抗增殖、促凋亡、促进细胞在氧化应激下的存活[10,11]。在人类结肠癌细胞中发现FOXO1与TCF竞争结合β-catenin[12],在肾脏纤维化的研究中发现[8],β-catenin/FOXO1转录复合物形成可以促进TGF-β诱导的调节性T细胞（regulatory T cells,Tregs）foxp3的表达[8,13],发挥抗炎作用,然而β-catenin不同“转录伴侣”在HSCs及其肝脏纤维化中的作用仍不清楚。因此,本研究从细胞、动物、人体多水平,正向、反向多角度探讨TGF-β信号通路转录因子β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1调控HSCs增殖活化的作用机制,并在体内实验中探讨转录因子复合物β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1对HSCs增殖活化、细胞外基质沉积、肝脏组织免疫调节的作用及其机制,发现转录因子复合物TCF、FOXO1竞争结合β-catenin,可以调节TGF-β促纤维化生物学效应开关,导致不同的生物事件结局,为精准靶向抑制肝脏纤维化的临床研究提供基础及思路。目的:1.结合细胞水平和动物水平实验,阐明肝脏纤维化过程中,TGF-β信号通路中β-catenin与不同“转录伴侣”FOXO1、TCF形成的不同转录因子复合物在肝纤维化病程中的作用机制;研究通过调控HSCsβ-catenin转录因子复合物,启动TGF-β多重生物学效应开关,导向不同生物学事件结局的思路在改善肝脏纤维化中的应用。2.在人体肝纤维化组织中分析β-catenin与不同“转录伴侣”FOXO1、TCF形成的不同转录复合物β-catenin/FOXO1、β-catenin/TCF与纤维化进展之间的关系,丰富肝纤维化疾病进展的病理生理基础,为肝纤维化的治疗提供了新的思路和策略,为进一步探索其在肝脏以及其它器官纤维化治疗中的临床应用提供支撑。方法:1.体外实验:人肝星状细胞LX2体外培养,分对照组、TGF-β诱导分化组、TGF-β诱导分化+ICG-001干预组、TGF-β诱导分化+ICG-001+AS1842856组通过Western Blotting、RT-q PCR检测各组细胞外基质α-SMA和COL-I水平以及HSCs细胞周期、氧化应激功能,应用Western Blotting、Co IP、PLA方法分析HSCs活化后,各组β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1转录复合物水平变化。2.体内实验:根据肝纤维化的不同病因,构建四氯化碳（CCl4）和胆总管结扎（BDL）两种肝纤维化小鼠模型,观察小鼠肝脏外观,速率法检测丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶,同时对肝纤维化不同时期进行肝脏组织切片、染色,提取RNA及逆转录、RT-q PCR,分析肝纤维化小鼠模型不同时期的纤维化以及炎症因子水平,判断不同模型的干预时间;采用邻位连接技术（PLA）分析肝纤维化不同时期β-catenin转录复合物变化规律。3.在以上实验的基础上,对两种肝纤维化小鼠模型应用β-catenin/TCF抑制剂ICG-001进行干预,分别设立对照组、模型组、ICG-001干预组,观察小鼠肝脏外观,计算肝重、体重比,应用小鼠肝酶血清学水平检测、组织学染色、免疫组化、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和1型胶原蛋白（COL-1）RNA表达水平检测相结合的方法,评价ICG-001干预后是否抑制小鼠肝脏纤维化,并应用ELISA方法检测了BDL各组肝脏组织炎症因子IL-10、IL-17、TNF-α、IL-6水平。4.为正反两个角度进一步探索TGF-β信号通路转录因子复合物在抑制肝脏纤维化中的作用机制,BDL小鼠肝纤维化动物模型中增加TGF-β组、FOXO1抑制剂干预组,采用免疫组化、Western blotting、RT-q PCR、Co IP、PLA实验,分析以β-catenin为核心的转录复合物β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1之间的转换关系;应用组织免疫荧光共定位、组织HSCs特异细胞PLA实验分析体内TGF-β信号通路转录因子复合物对HSCs细胞的作用,并应用RT-q PCR检测了foxp3、TNF-α、P27kip1表达水平。5.最后在胆道闭锁患者不同肝纤维化分期的肝脏组织中开展免疫组化、RTq PCR、PLA实验,分析人体肝脏组织中TGF-β水平、细胞增殖水平、IL-10、β-catenin/FOXO1、β-catenin/TCF与肝纤维化分期是否相关,为重新定向TGF-β信号通路转录因子复合物β-catenin/FOXO1、β-catenin/TCF治疗肝纤维化的临床策略提供依据。结果:1.体外实验:β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1参与肝星状细胞的增殖活化1.1β-catenin/TCF抑制剂ICG-001干预活化的LX2细胞,WB结果显示,ICG-001组LX2细胞α-SMA蛋白表达水平与TGF-β组相比显着下降;ICG-001+AS1842856组与ICG-001组比较,α-SMA蛋白表达水平显着高于ICG-001组;而ICG-001组与对照组相比,α-SMA蛋白表达水平差异不具有统计学意义,ICG-001+AS1842856组与TGF-β组相比,α-SMA表达水平差异不具有统计学意义。说明ICG-001可以抑制活化的HSCs转分化为肌成纤维细胞。1.2 Mn SOD、p27kip1 RT-q PCR结果显示,ICG-001组LX2细胞Mn SOD、p27kip1表达水平的变化趋势与α-SMA、COL-I WB结果相反。说明ICG-001干预活化的HSCs使HSCs细胞周期阻滞,抗氧化应激水平增强。1.3以β-catenin作为Co IP抗体的免疫共沉淀结果显示,ICG-001组与TGF-β组相比,β-catenin结合的TCF水平显着下降,FOXO1水平显着升高。β-catenin、TCF、FOXO1 PLA结果显示,ICG-001组LX2细胞β-catenin/TCF互作与TGF-β组相比显着下降,β-catenin/FOXO1结果与β-catenin/TCF相反。综合与β-catenin结合的TCF、FOXO1水平,应用TF ratio（β-catenin/TCF versusβ-catenin/FOXO1）指标分析各组之间转录因子水平的差异,结果显示TF ratio水平变化趋势与LX2细胞活化的特异性标记物α-SMA表达水平一致,LX2细胞的活化与TF ratio水平升高密切相关。以上结果说明β-catenin/TCF可以促进TGF-β诱导的HSCs增殖、活化。2.体内实验;小鼠肝纤维化动物模型以及β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1与肝纤维化病程关系初探2.1 CCl4肝纤维化小鼠模型在造模4w时,ALT、AST水平达到最高,随着造模时间延长,6w、8w时点ALT、AST水平呈现下降趋势;小鼠肝脏组织HE染色、网状纤维染色结果显示,在造模4w时纤维组织增生逐渐显着,网状纤维增粗、断裂,纤维间隔初步形成,随着造模时间延长,纤维间隔显着;小鼠肝脏α-SMA免疫组织化学结果显示,随着CCl4注射时间延长至4w,α-SMA表达水平与对照组相比显着升高。小鼠肝脏组织IL-6、TNF-αm RNA表达水平在模型4w时达到高峰,foxp3表达水平在模型初期逐步增加,6w时达到高峰,8w时下降。2.2 BDL肝纤维化小鼠模型BDL术后1w,ALT、AST与Sham相比显着升高,术后2w时达到顶峰,术后3w、4w呈现下降趋势;小鼠肝组织HE染色、网状纤维染色、Masson染色、亮绿-天狼星红染色分别从炎症细胞浸润、网状纤维、胶原纤维增生不同维度检测结果显示,BDL术后1周可见毛细胆管增生,汇管区增大,肝细胞轻度水肿变性,少量中性粒细胞及淋巴细胞浸润,随着术后时间延长,可见局灶性坏死,毛细胆管数量增多,肝细胞空泡样变加重;小鼠肝脏α-SMA免疫组织化学结果显示,BDL术后1w汇管区α-SMA表达水平与对照组相比显着增加,随着BDL术后胆总管结扎时间延长,α-SMA表达水平持续升高,。小鼠肝脏组织TNF-αm RNA表达水平在模型1w、2w、3w时逐步上升,foxp3表达水平在模型初期逐步增加,2w、3w时显着升高。以上结果说明CCL4、BDL两种不同机制导致的小鼠肝纤维化模型分别在造模4w、1w时即出现炎症细胞浸润,纤维组织增生。2.3 CCL4、BDL模型不同时期对小鼠肝脏石蜡组织切片进行原位PLA实验,检测β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1转录复合物在病程不同阶段的变化,结果显示β-catenin/TCF水平在CCl4造模4w时显着增高,β-catenin/FOXO1则在对照组呈现最高水平,在CCl4造模4w时显着下降;β-catenin/TCF水平在BDL手术造模1w时显着增高,β-catenin/FOXO1则在对照组呈现最高水平,术后1w时下降。说明在两种模型中β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1转录复合物水平与肝纤维化病程相关。3.抑制β-catenin/TCF改善CCL4、BDL小鼠模型肝纤维化3.1 CCl4、BDL肝纤维化小鼠模型分别应用ICG-001干预1w、2w,对肝脏外观、肝重/体重比、肝酶、组织学、α-SMA、COL-I m RNA及蛋白水平进行了比较,结果显示,CCl4、BDL模型中ICG-001干预1w时,肝重体重比较模型组无显着差异,干预2w时,肝重体重比与模型组相比显着下降。两种模型1w、2w干预组小鼠血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）与模型组相比均显着下降。CCl4模型肝脏组织HE染色、网染结果显示,ICG-001组与同期CCL4模型组相比,炎性细胞浸润减少,纤维间隔包绕肝细胞团与同期模型组相比减少。BDL模型肝脏组织HE、Masson、网状纤维、天狼星红染色结果显示,ICG-001组与同期BDL模型组相比,毛细胆管增生及纤维化减少,炎性细胞浸润减轻,I型胶原、III型胶原数量显着降低,网状纤维断裂、肝细胞板增厚程度减轻;BDL模型天狼星红染色半定量结果显示,ICG-001组胶原沉积显着低于同期模型组。RT-q PCR结果显示两种模型ICG-001组2w时COL-I、α-SMA阳性比例与同期模型组相比显着下降。免疫组化结果显示CCl4模型ICG-001组COL-I水平显着低于同期模型组,干预2w COL-I水平与干预1w时相比显着下降;BDL模型ICG-001组α-SMA水平显着低于同期模型组,干预2w时α-SMA水平与干预1w相比显着下降。以上结果说明抑制β-catenin/TCF 1w或2w,均可改善肝纤维化。3.2 CCl4、BDL模型在ICG-001干预后foxp3水平与模型组相比显着升高,p27kip1水平与模型组相比显着升高。3.3 BDL模型,ICG-001干预2w时,IL-6水平与同期模型组相比显着下降;TNF-α、IL-17变化趋势与IL-6一致,IL-10则显着增加。4.BDL模型研究β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1调控肝纤维化的分子机制4.1 BDL模型中,腹腔注射AS1842856抑制FOXO1后,免疫组化、WB检测小鼠肝脏组织α-SMA水平,结果显示,应用AS1842856干预后,α-SMA水平显着增加,肝脏纤维化加重;当在ICG-001基础上应用AS1842856干预时,α-SMA阳性细胞数与ICG-001组相比显着增加。α-SMA和COL-I WB及半定量分析结果显示:术后给予ICG-001,α-SMA和COL-I蛋白表达水平与BDL组相比显着下降,在此基础上应用AS1842856,α-SMA和COL-I蛋白表达水平与ICG-001组相比显着增加。4.2各组小鼠肝脏组织核蛋白IP实验结果显示BDL组与Sham组相比,β-catenin/TCF升高、β-catenin/FOXO1降低,ICG-001干预后,与Sham组趋于一致,在此基础上应用AS1842856,β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1与Sham组相比均显着下降。各组小鼠肝脏组织石蜡切片进行PLA实验,结果显示各组TCF、FOXO1与β-catenin互作的变化趋势与肝脏核蛋白Co IP实验结果基本一致,BDL术后以及TGF-β的作用下,β-catenin、TCF互作呈现增长趋势,而β-catenin、FOXO1互作显示下降,与肝脏纤维化进展相关。ICG-001干预后β-catenin、TCF结合减弱,β-catenin、FOXO1结合增强,而在ICG-001+AS1842856组,β-catenin与TCF、FOXO1的互作关系均减弱,与肝脏核蛋白Co IP实验结果一致。4.3组织免疫荧光结果显示BDL模型组HSCs增殖活化水平显着高于Sham组,ICG-001组显着低于模型组,TGF-β组HSCs数量及活化较BDL模型组增强,ICG-001干预TGF-β组HSCs增殖活化水平显着下降,与ICG-001组相比无显着差异。BDL模型组HSCs细胞β-catenin/TCF ligation与Sham组相比显着增加,ICG-001干预后与BDL组比较显着下降;TGF-β组β-catenin/TCF与BDL组相比显着增加,ICG-001干预TGF-β组,β-catenin/TCF ligation较TGF-β组显着下降。β-catenin/FOXO1ligation BDL组显着低于Sham组,ICG-001干预后与BDL组比较显着升高;TGF-β组β-catenin/FOXO1与BDL组相比显着增加,ICG-001干预TGF-β组,β-catenin/FOXO1 ligation较TGF-β组显着升高。TF ratio作为β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1的比值,可以综合评价与β-catenin竞争结合的TCF、FOXO1之间的动态变化,BDL模型组HSCs细胞中TF Ratio与Sham组相比显着增加,ICG-001干预后与BDL组比较显着下降;TGF-β组与BDL组相比无显着差异,ICG-001干预TGF-β组,TF Ratio较TGF-β组显着下降,与ICG-001组无差异。结合本部分2.1结果显示TF ratio下降,肝纤维化程度减轻,反之则加重。4.4 BDL模型组小鼠肝脏组织RT-q PCR结果显示TNF-α、foxp3表达水平与Sham组比较显着升高,ICG-001干预后TNF-α显着下降,foxp3进一步增加,在ICG-001基础上应用AS1842856抑制FOXO1后,TNF-α水平显着升高,foxp3表达下降。4.5 ICG-001干预后p27kip1水平与BDL模型组相比显着升高,在ICG-001基础上应用AS1842856抑制FOXO1后,p27kip1水平发生显着下降。5.人体肝脏组织β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1转录复合物与纤维化进展的关系5.1经过彩色多普勒超声初诊,腹腔镜胆囊插管造影确诊的16例胆道闭锁以及其它患者,依据HE、Masson、天狼星红染色结果进行纤维化程度的Ishak评分分期,其中0期3例,1期4例,2期、3期、4期各3例。5.2不同分期患者肝脏组织Masson染色、IL-10、Ki67半定量分析结果显示,肝脏组织纤维化程度逐渐加重,IL-10水平S0-S2期显着升高,细胞增殖S2-S4期显着增强,这些指标均与TGF-β表达水平逐渐升高相关。5.3患者肝脏组织石蜡切片PLA结果显示,S0、S1、S2、S3期β-catenin/TCF ligation S0-S2期逐渐增多;β-catenin/FOXO1 S0期最高,S0-S2期逐渐下降;TF ratio与患者肝脏纤维化程度变化趋势一致。结论:1.体外人肝星状细胞LX2实验中,TCF、FOXO1竞争结合β-catenin,形成不同转录因子复合物,调控TGF-β诱导的LX2转分化及细胞周期、氧化应激水平。2.体内动物实验中,TGF-β通路下游转录因子TCF、FOXO1同样存在竞争结合β-catenin;β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1作为TGF-β通路不同生物学效应的开关导致促纤维化和抗炎、细胞抑制--不同的生物学事件结局。体内通过调控HSCs TF ratio,可以抑制HSCs细胞的增殖活化,减少细胞外基质沉积,同时调节肝脏组织免疫反应,减轻组织慢性损伤,改善肝纤维化。3.β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1相对水平即TF Ratio水平升高与BA患者肝脏纤维化病程早期进展相关。
于亚男[5]（2021）在《滇产铁皮石斛对CCl4诱导大鼠肝纤维化的保护作用》文中研究指明目的:观察不同剂型的滇产铁皮石斛（Dendrobium candidum from Yunnan,DCY）对CCl4诱导肝纤维化大鼠肝组织病理学、肝功能和肝纤维化生化学指标的影响,同时通过体外观察铁皮石斛多糖（Dendrobium candidum polysaccharide,DCP）对活化肝星状细胞系LX2（Hepatic stellate cell LX2,HSC-LX2）增殖、凋亡的影响,探讨其抗肝纤维化的作用机制。方法:（1）实验一:选取86只SD大鼠,将其随机分为正常组15只、模型组71只,模型组大鼠行CCl4皮下注射诱导肝纤维化,正常组给予等量生理盐水处理,每周3次,同时称体重。连续注射5周后,随机处死正常组和模型组大鼠各5只,行肝组织病理切片,镜下观察各组肝组织的病理学改变。再随机选取8只正常组大鼠为阴性对照组（NG）,剩余MG 64只大鼠随机分为DCY粉剂组（DDG）、鲜榨组（FDG）、秋水仙碱阳性对照组（CG）和模型组（MG）,其中粉剂组和鲜榨组又随机分别分为低浓度组（DGl,0.15g/m L）、中浓度组（DGm,0.45g/m L）、高浓度组（DGh,0.75g/m L）。DCY的粉剂和鲜榨组分别给药浓度由低到高分别为0.15g/m L、0.45g/m L、0.75g/m L,CG给予秋水仙碱浓度为0.002%,同时MG和NG给予等量生理盐水,各组给药剂量均为3 m L/只,每天灌胃1次。连续灌胃4周后,各组大鼠称体重,断头处死,立即在无菌条件下剖腹行腹主动脉采血,然后观察肝的色泽、质地,并取肝称肝重,计算肝脏指数（Liver index,LI）;采用HE染色、Masson染色法,镜下观察各组肝组织的病理学改变;通过免疫组织化学染色法,检测各组肝组织中转化生长因子-β1（TGF-β1）的表达情况;应用血液生化仪检测大鼠血清肝功能指标ALP、AST、GPT的改变,并采用ELISA法检测其血清肝纤维化指标HA、LN、PCIII的变化。（2）实验二:体外传代HSC-LX2,取对数生长期细胞培养,以5×104/孔的细胞密度种入6孔板,分阴性对照组和DCP组进行划痕实验,其中DCP组给予含药浓度为400ug/m L,然后检测HSC-LX2在2 h、6 h、12 h、24 h、48 h的细胞迁移率;另体外培养HSC-LX2,以1×103/孔的细胞密度种入96孔板,分为阴性对照组（NG）、25ug/m L DCP组（DCPG-25）、50ug/m L DCP组（DCPG-50）、100ug/m L DCP组（DCPG-100）、200ug/m L DCP组（DCPG-200）、400ug/m L DCP组（DCPG-400）,分别给予不同浓度的DCP处理24 h后,采用MTT法检测并计算DCP对HSC-LX2的抑制率;同上方法体外培养HSC-LX2,以5×104/孔的细胞密度接种至6孔板内,分为阴性对照组（NG）、100ug/m L DCP组（DCPG-100）、200ug/m L DCP组（DCPG-200）、400ug/m L DCP组（DCPG-400）,细胞培养12h时后,低、中、高浓度组分别加入DCP的浓度为100μg/m L、200μg/m L、400μg/m L,各孔加入同等液量1.5 m L,作用24h后,倒置显微镜下观察细胞形态并进行流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:（1）实验一:（1）一般情况及肝脏外观的变化:模型制备期间MG大鼠一般状态差,体重呈缓慢上升态势,两种剂型的DCY给药干预后,DDG、FDG、CG三组大鼠一般状态好转。NG大鼠肝脏多分为6叶,呈棕红色,表面滑润,质地柔软;MG大鼠肝脏则偏暗红色,肝表面可见弥漫性小结节,质地偏韧;DDG、FDG、CG三组大鼠肝脏质地较韧并有颗粒感,但与MG比较均有较明显改善。（2）LI变化:与NG比较,MG大鼠LI明显升高（P<0.01）;CG、DDG、FDG的LI较NG偏高,但分别与NG比较差异无统计学意义（P>0.05）;与MG比较,DDGl、DDGm、DDGh、FDGl、FDGm、FDGh、CG的LI均明显降低（P<0.05或P<0.01）;与CG比较,DDGl、DDGm、DDGh、FDGl、FDGm、FDGh各组的LI偏高,但差异无统计学意义（P>0.05）;与DDGh比较,DDGl的LI降低不明显,有统计学意义（P<0.05）;与FDGh比较,FDGl和FDGm两组的LI变化无统计学意义（P>0.05）。（3）肝组织病理学改变:HE染色显示,NG大鼠肝脏细胞形态正常,核圆居中,肝细胞索呈放射状排列紧密;MG大鼠肝脏细胞排列紊乱,细胞内广泛形成脂肪空泡,可见大量假小叶形成,汇管区扩大,有炎细胞浸润;CG、DDG、FDG大鼠的肝损伤均有明显改善。Masson染色显示,NG大鼠肝组织中的肝细胞形态正常,肝细胞索排列规则,细胞内未见明显脂肪空泡,汇管区无明显胶原纤维沉积;MG大鼠肝细胞索排列紊乱,可见大量假小叶形成,汇管区有大量胶原纤维沉积;CG、DDG、FDG大鼠的肝损伤明显缓解,假小叶形成减少,汇管区纤维化程度降低。随着DCY各剂型给药浓度的增高,大鼠肝组织的病理变化改善更加明显,可能存在剂量依赖性。（4）免疫组织化学染色结果:与NG相比,MG、DDGl和FDGl大鼠肝组织中TGF-β1的表达明显增多（P<0.01）;与MG相比,DDGm、DDGh、FDGm和FDGh各组的TGF-β1表达明显降低（P<0.01）;与CG比,DDGl、FDGl、DDGm和FDGm各组的TGF-β1表达差异均十分显着（P<0.01）;DDGl、DDGm与DDGh相比,FDGl、FDGm与FDGh相比,TGF-β1的表达差异均有统计学意义（P<0.01）。结果表明,DCY能降低大鼠肝组织TGF-β1的表达水平,且可能有剂量依赖性。（5）肝功能血清生化指标变化:与NG相比,MG大鼠血清ALP、AST、GPT的表达明显升高（P<0.01）;与MG相比,DDGl、DDGm、DDGh、FDGl、FDGm、FDGh各组大鼠血清ALP、AST、GPT的表达均降低（P<0.01）;与CG相比,DDGl、DDGm、DDGh、FDGl、FDGm、FDGh各组大鼠血清ALP、AST、GPT的表达均无统计学意义（P>0.05）;DDGl、DDGm与DDGh相比,FDGl、FDGm和FDGh相比,各组大鼠血清ALP、AST、GPT的表达差异均无统计学意义（P>0.05）。（6）肝纤维化血清生化指标变化:与NG相比,MG大鼠血清HA、LN、PC-III的表达明显升高（P<0.01）;与MG相比,DDGl、DDGm、DDGh、FDGl、FDGm、FDGh各组大鼠血清HA、LN、PC-III的表达均降低（P<0.05）;与CG相比,DDGm、DDGh、FDGm和FDGh各组血清HA、LN、PC-III的表达差异无统计学意义（P>0.05）,而DDGl和FDGl均有显着统计学意义（P<0.01和P<0.05）。但值得注意的是,在不同剂量药物干扰组进行组内比较时,仅LN的表达可能存在剂量依赖性,即DDGl与DDGh相比,FDGl与FDGh相比,LN的表达差异均十分显着（P<0.01）。（2）实验二:（1）一般情况:传代的HSC-LX2贴壁后,光镜下显示细胞生长旺盛,胞质透亮,细胞伸展呈星状,核仁清晰,细胞碎片少。（2）划痕实验:给药组细胞迁移率显着降低,表明DCP可通过抑制HSC-LX2的迁移来起到抗肝纤维化的作用。（3）MTT法检测结果:随着DCP给药浓度的增高,细胞增殖抑制率逐渐增高,各浓度给药组分别与NG比较,差异显着有统计学意义（P<0.01）;DCPG-25、DCPG-50、DCPG-100、DCPG-200和DCPG-400各组进行两两比较,HSC-LX2的增殖抑制率均显着较低,差异有统计学意义（P<0.05）。结果表明,DCP可抑制HSC-LX2的增殖且呈剂量依赖性。（4）流式细胞术结果:随着给药浓度增加,HSC-LX2的生长密度逐渐降低,细胞凋亡率逐渐升高,并与给药浓度呈正相关。各浓度给药组分别与NG比较,差异显着有统计学意义（P<0.01）;与DCPG-400比较,DCPG-100和DCPG-200凋亡率较低,差异显着,有统计学意义（P<0.01）,表明DCP能显着促进HSC-LX2凋亡且呈剂量依赖性。结论:两种剂型DCY均可改善肝纤维化大鼠的一般状态、肝功能、肝纤维化生化指标以及肝组织的病理变化,并降低肝组织中TGF-β1的表达;DCP能抑制活化的HSC-LX2增殖并促进其凋亡;随着给药浓度的升高,体内外检测指标大部分得到明显改善。因此,铁皮石斛具有抗肝纤维化作用,可能存在剂量依赖性。
邓恬[6]（2021）在《TGF-β诱导肝癌细胞分泌IL-11而促进肝星状细胞活化》文中进行了进一步梳理肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是肝癌的主要组织学亚型,占原发性肝癌的75%-85%,是全世界癌症相关死亡的第三大原因。肝癌预后差,主要原因为复发率和转移率高。越来越多的证据表明,微环境在肿瘤的发生发展中起着非常重要的作用;肝星状细胞（Hepatic stellate cell,HSC）是HCC微环境的重要组成部分,HCC周围的HSC可以被癌细胞激活并转变成肌成纤维细胞（Myofibroblast,MFB）,参与微环境重塑并促进肝癌进展,但肝癌细胞与HSC相互作用的方式与分子机制需要更深入的研究。TGF-β在HCC组织中显着上调,能促进肝癌细胞的存活、增殖、EMT和侵袭等。本论文研究发现:IL-11为TGF-β在肝癌细胞中的一个新靶基因,且Smad通路介导TGF-β对IL-11基因的表达调控作用;IL-11能在HCC细胞中激活STAT3信号通路;TGF-β也可以通过Smad信号通路诱导人肝星状细胞株LX-2表达IL-11;肝癌细胞株HCCLM3内源性高表达IL-11,而其条件培养基能刺激LX-2细胞活化。本论文结果表明TGF-β可以同时在肝癌细胞和肝星状细胞中诱导IL-11表达,从而促进肝星状细胞活化;上述结果为深入研究IL-11在HCC-HSC相互作用中的功能与机制奠定了基础。
杨晶晶[7]（2021）在《DNMT3A介导LncRNA ANRIL甲基化促进肝纤维化的分子机制》文中研究说明研究背景肝纤维化（Liver fibrosis）是各种损伤因素引发的持续性损伤修复反应,导致肝组织内细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）的异常沉积,进一步引发肝脏结构和肝功能异常改变的一种病理过程。目前临床上肝纤维化的治疗效果不佳,严重危害人类的生命健康。因此,阐明肝纤维化的发病机制,具有重要临床意义。研究证实,活化的肝星状细胞（Hepatic stellate cells,HSCs）是肝脏合成ECM的主要细胞,肝星状细胞活化增殖是肝纤维化形成的中心环节。在各种损伤刺激下,HSCs由静止的、储存维生素A的细胞向增生的、成纤维的肌成纤维细胞的转分化,并分泌α-平滑肌肌动蛋白（Alpha-smooth muscle actin,α-SMA）、I型胶原（Collagen I,Col1a1）等,产生促纤维化的细胞因子如转化生长因子（Transforming growth factor-β1,TGF-β1）、血小板源性生长因子（Platelet derived growth factor-BB,PDGF-BB）等现已被公认为肝纤维化的主要驱动因素。然而,到目前为止,关于调控HSCs增殖和肝纤维化发病的分子机制不详,因此,探究肝纤维化发病过程中HSCs增殖的分子作用机制对预防和治疗肝纤维化意义重大。各种因素参与调控HSCs增殖,表观遗传修饰DNA甲基化是重要的表观遗传标记,在肝纤维化形成过程中起关键作用。本课题组研究发现DNA甲基化参与调控HSCs增殖,但是作为DNA甲基化转移酶之一的DNMT3A在肝纤维化的发病过程中起着怎样的调控作用,仍不明确。此外,研究表明,表观遗传学修饰长链非编码RNA（Long non-coding RNA,Lnc RNA）具有调控HSCs增殖的作用,INK4基因座中反义非编码RNA（Antisense Non-Coding RNA in the INK4 Locus,ANRIL）是已知的具有调控细胞活化增殖功能的关键分子之一。文献报道Lnc RNA ANRIL可通过介导细胞增殖通路相关蛋白的表达调控细胞增殖活性。但是,关于Lnc RNA ANRIL如何调控HSCs增殖的具体分子机制不清,有待阐明。基于DNMT3A与Lnc RNA ANRIL两种表观遗传修饰方式如何调控HSCs增殖,两者之间相互作用、作用靶点和调控方式,需要深入阐明。本文将探究DNMT3A介导Lnc RNAANRIL甲基化在肝纤维化中的分子机制,以期为临床肝纤维化的治疗提供科学依据、新的分子诊断指标和干预靶点。本研究收集临床肝纤维化患者血清及组织标本,并采用经典的四氯化碳（CCl4）皮下注射建立小鼠肝纤维化模型为体内研究对象,以肝星状细胞HSCs为体外研究对象,应用荧光原位杂交、甲基化特异性PCR（MSP）、5-溴脱氧尿嘧啶核苷（Brd U）荧光染色等技术,进行DNMT3A介导Lnc RNA ANRIL甲基化在肝纤维化中的分子机制研究。全文共分三个部分:第一部分临床肝纤维化患者样本中DNMT3A、ANRIL、α-SMA、Collagen I的差异表达目的:阐明DNMT3A、ANRIL、α-SMA、Collagen I在临床患者肝纤维化样本中的差异表达。方法:选取安徽医科大学第二附属医院肝胆外科慢性肝病患者20例。所有患者均签署剩余标本使用知情同意书。分组:根据肝穿刺活检病理学诊断有无合并纤维化症状分为对照组（无纤维化组）和纤维化组各10例,肝穿刺活检病理学诊断参照《肝纤维化诊断及治疗共识（2019）》。并记录患者的相关信息,如年龄、性别等,严格按照安徽医科大学生物医学伦理委员会要求执行,收集血清及肝组织样本待测。（1）检测肝纤维化患者血清中AST、ALT、HA的含量变化;（2）HE染色观察肝纤维化患者肝脏组织病理学改变;（3）Masson染色及天狼猩红染色观察肝纤维化患者肝脏组织胶原沉积改变;（4）Western blotting及免疫组织化学实验检测DNMT3A、肝纤维化标志蛋白α-SMA、Collagen I在肝纤维化患者肝脏组织中的差异表达;（5）RT-qPCR检测DNMT3A、ANRIL、α-SMA、Collagen I m RNA在肝纤维化患者肝脏组织中的差异表达。结果:1.临床患者肝纤维化组织中DNMT3A表达显着升高,ANRIL表达明显降低（1）肝纤维化组血清中AST/ALT比值、HA的含量与对照组相比明显增加;（2）与对照组相比,肝纤维化组肝组织中胶原沉积明显增多、炎性浸润增加,纤维化改变显着;（3）肝纤维化组肝组织中DNMT3A、α-SMA、Collagen I蛋白的表达较对照组显着增高;（4）肝纤维化组肝组织中DNMT3A、α-SMA、Collagen I m RNA的表达较对照组显着增高,而ANRIL m RNA的表达则显着降低。（5）相关性Preason分析结果显示:肝纤维化患者组织中DNMT3A和α-SMA的相对表达呈现明显正相关,ANRIL和α-SMA的相对表达呈现明显负相关。小结:DNMT3A高表达与ANRIL低表达以及肝脏功能受损,可能与肝纤维化患者纤维化形成有关。第二部分小鼠肝纤维化组织和肝星状细胞中DNMT3A、ANRIL、α-SMA、Collagen I的表达及ANRIL启动子区域甲基化水平目的进一步阐明小鼠肝纤维化组织和肝星状细胞中DNMT3A、ANRIL、α-SMA、Collagen I的表达及ANRIL启动子区域甲基化水平。方法1.30只雄性小鼠（18～22g）随机分为2组:正常组15只、CCl4处理组15只。自处理之日开始,除正常组给予橄榄油（1 ml/kg）皮下注射外,其他各组小鼠皮下注射50%CCl4橄榄油溶液（1 ml/kg）每周2次,共12周;直至第12周结束,建模过程中注意观察并记录小鼠体重变化,于造模满12周时,麻醉后留取肝脏组织和血液标本,检测相关指标。（1）检测肝纤维化小鼠血清中AST、ALT、HA、TGF-β1的含量变化;（2）HE染色观察小鼠肝纤维化组织病理学改变;（3）Masson染色及天狼猩红染色观察小鼠肝纤维化组织胶原沉积改变;（4）Western blotting及免疫组织化学实验检测DNMT3A、α-SMA、Collagen I蛋白在小鼠肝纤维化组织中的表达;（5）RT-qPCR检测DNMT3A、ANRIL、α-SMA、Collagen I m RNA在小鼠肝纤维化组织中的表达;（6）FISH检测ANRIL在小鼠肝纤维化组织中的表达;（7）MSP检测小鼠肝纤维化组织中ANRIL启动子区域甲基化水平。2.体外以肝星状细胞HSCs为研究对象,使用细胞因子TGF-β1（5ng/ml）诱导刺激HSCs增殖,建立体外HSCs增殖模型,进行以下实验:（1）检测TGF-β1处理HSCs后上清液中HA和PIIIP的含量变化;（2）Western blotting及免疫荧光实验检测DNMT3A、α-SMA、Collagen I蛋白在TGF-β1处理HSCs中的差异表达;（3）RT-qPCR检测DNMT3A、ANRIL、α-SMA、Collagen I m RNA在TGF-β1处理HSCs中的差异表达;（4）应用MTT、CCK8以及Brd U荧光染色检测观察TGF-β1处理对HSCs增殖的影响;（5）BSP检测TGF-β1处理HSCs后ANRIL启动子区域甲基化位点变化。结果:1.小鼠肝纤维化组织中DNMT3A表达显着增高,ANRIL表达显着降低,ANRIL表达降低可能与ANRIL基因启动子区域甲基化水平升高有关。（1）肝纤维化小鼠血清中AST/ALT比值、HA、TGF-β1含量水平较对照组明显增高;（2）与对照组相比,小鼠肝纤维化组织中胶原沉积增多、炎性浸润增加、纤维化改变明显;（3）与对照组相比,DNMT3A、α-SMA、Collagen I蛋白和m RNA的表达在小鼠肝纤维化组织中显着增高,而ANRIL m RNA在小鼠肝纤维化组织中的表达显着降低;（4）小鼠肝纤维化组织中ANRIL启动子区域甲基化水平与对照组相比显着升高。2.体外HSCs增殖模型中,DNMT3A高表达,ANRIL低表达,ANRIL的低表达可能与ANRIL启动子区域甲基化水平升高有关（1）TGF-β1处理后HSCs细胞上清液中HA和PIIIP的含量较对照组明显增高;（2）与对照组相比,TGF-β1诱导刺激HSCs（24h、48h）后HSCs增殖活性明显增强;（3）与对照组相比,DNMT3A、α-SMA、Collagen I蛋白和m RNA的表达在TGF-β1诱导刺激HSCs中显着增高,而ANRIL m RNA的表达显着降低;（4）同时,TGF-β1诱导刺激HSCs中ANRIL启动子区域甲基化水平较对照组显着升高。小结:DNMT3A高表达与ANRIL高甲基化修饰导致的ANRIL表达下调,可能与小鼠肝纤维化形成和HSCs增殖有关。但是关于DNMT3A与ANRIL如何调控肝纤维化形成和HSCs增殖,两者之间有何调控作用,仍不清楚,值得进一步研究。第三部分DNMT3A介导ANRIL甲基化在肝纤维化与HSCs增殖中的分子作用机制目的:探究DNMT3A介导ANRIL甲基化调控HSCs细胞增殖及肝纤维化的分子机制。方法:1.60只雄性小鼠（18～22g）随机分为4组:正常组,CCl4处理组,CCl4+LV3慢病毒空载体组,CCl4+LV3-DNMT3A慢病毒组,每组各15只。自处理之日开始,除正常组给予（1 ml/kg）剂量橄榄油皮下注射外,其他各组小鼠皮下注射50%CCl4橄榄油溶液（1 ml/kg）每周2次,共12周;于造模满11周后,LV3慢病毒空载体组小鼠,LV3-DNMT3A慢病毒组小鼠,分别给予30μl慢病毒空载体LV3和30μl慢病毒LV3-DNMT3A尾静脉注射处理（慢病毒颗粒的滴度为1×109TU/ml）,一周后处死小鼠,留取肝脏组织和血液标本,检测相关指标。（1）HE染色观察重组慢病毒DNMT3A干预后小鼠肝纤维化组织病理学改变;（2）Masson染色及天狼猩红染色观察重组慢病毒DNMT3A干预后小鼠肝纤维化组织胶原沉积改变;（3）Western blotting及免疫组织化学实验检测重组慢病毒DNMT3A干预后,DNMT3A、α-SMA、Collagen I蛋白在小鼠肝纤维化组织中的表达变化;（4）RT-qPCR检测重组慢病毒DNMT3A干预后,DNMT3A、ANRIL、α-SMA、Collagen I m RNA在小鼠肝纤维化组织中的表达变化;（5）FISH检测重组慢病毒DNMT3A干预后,ANRIL在小鼠肝纤维化组织中的表达变化。2.细胞实验:应用DNMT3A过表达质粒、DNMT3A小干扰RNA以及DNA甲基转移酶抑制剂2’-脱氧-5-氮杂胞嘧啶（5-aza-2’-deoxycytidine,5-Azad C）1μmol/L分别转染处理TGF-β1（5ng/ml）刺激24h后的HSCs,实验分组:对照组,TGF-β1（5ng/ml）处理组,TGF-β1（5ng/ml）+DNMT3A过表达质粒处理组,TGF-β1（5ng/ml）+DNMT3A小干扰RNA处理组,TGF-β1（5ng/ml）+5-Azad C（1μmol/L）处理组,并进行以下实验:（1）Western blotting检测DNMT3A、α-SMA、Collagen I蛋白在DNMT3A过表达质粒、DNMT3A小干扰RNA以及5-Azad C（1μmol/L）干预处理后HSCs中的表达变化;（2）RT-qPCR检测DNMT3A、ANRIL、α-SMA、Collagen I m RNA在DNMT3A过表达质粒、DNMT3A小干扰RNA以及5-Azad C（1μmol/L）干预处理后HSCs中的表达变化;（3）应用MTT、CCK8以及Brd U荧光染色检测观察DNMT3A过表达质粒、DNMT3A小干扰RNA以及5-Azad C（1μmol/L）处理后对HSCs增殖的影响。3.应用ANRIL过表达质粒、ANRIL小干扰RNA转染处理TGF-β1（5ng/ml）刺激24h后的HSCs,实验分组:对照组,TGF-β1（5ng/ml）处理组,TGF-β1（5ng/ml）+ANRIL过表达质粒处理组、TGF-β1（5ng/ml）+ANRIL小干扰RNA处理组;并进行以下实验:（1）Western blotting检测ANRIL过表达质粒、ANRIL小干扰RNA分别处理活化增殖的HSCs中α-SMA、Collagen I、AMPK、Phospho-AMPK（p-AMPK）蛋白的表达变化;（2）RT-qPCR检测ANRIL过表达质粒、ANRIL小干扰RNA分别处理活化增殖的HSCs中ANRIL、α-SMA、Collagen I m RNA的表达变化;（3）应用MTT、CCK8以及Brd U荧光染色观察ANRIL过表达质粒、ANRIL小干扰RNA对HSCs增殖的影响。结果:1.重组慢病毒DNMT3A干预后,ANRIL的表达明显升高,小鼠肝纤维化程度明显改善（1）与对照组相比,小鼠肝纤维化组织中胶原沉积增多、炎性浸润增加、纤维化改变明显,给予重组慢病毒DNMT3A干预后,与慢病毒空载体组相比,肝脏细胞结构改善、胶原纤维减少,肝组织纤维化病理改善更为明显;（2）与对照组相比,小鼠肝纤维化组织中DNMT3A、α-SMA、Collagen I蛋白和m RNA的表达显着增高,给予重组慢病毒DNMT3A干预后,与慢病毒空载体组相比,小鼠肝纤维化组织中DNMT3A、α-SMA、Collagen I蛋白和m RNA的表达明显减少;（3）然而,与对照组相比,ANRIL m RNA在小鼠肝纤维化组织中的表达显着降低,给予重组慢病毒DNMT3A干预后,与慢病毒空载体组相比,小鼠肝纤维化组织中ANRIL m RNA的表达明显升高。2.体外HSCs增殖模型中,过表达DNMT3A可显着抑制ANRIL表达,促进HSCs增殖;而沉默DNMT3A可明显促进ANRIL表达,抑制HSCs增殖;提示DNMT3A通过负调控ANRIL的表达影响HSCs增殖活性（1）与阴性对照组相比,转染DNMT3A小干扰RNA处理后HSCs中DNMT3A m RNA表达显着降低,而ANRIL m RNA表达显着增高。（2）然而,与空质粒组相比,转染DNMT3A过表达质粒后HSCs中DNMT3A m RNA表达明显增高,而ANRIL m RNA表达明显降低。（3）与TGF-β1刺激组相比,使用DNA甲基化抑制剂5-Azad C处理HSCs后ANRIL表达水平明显升高。（4）与空质粒组相比,转染DNMT3A过表达质粒后HSCs增殖活性明显增强;（5）与阴性对照组相比,转染DNMT3A小干扰RNA后可明显抑制HSCs增殖;此外,与TGF-β1刺激组相比,5-Azad C处理后可明显抑制HSCs增殖。3.过表达ANRIL能明显抑制AMPK蛋白磷酸化水平,同时可显着降低HSCs的增殖活性;沉默ANRIL可显着增加AMPK蛋白磷酸化水平,同时可显着促进HSCs的增殖活性;（1）与空质粒组相比,ANRIL过表达质粒转染HSCs后ANRIL表达显着升高,而α-SMA、Collagen I、p-AMPK表达明显降低;（2）另外,与空质粒组相比,ANRIL过表达质粒转染后明显抑制HSCs增殖。（3）然而,与阴性对照组相比,ANRIL小干扰RNA转染HSCs后ANRIL表达显着降低,而α-SMA、Collagen I、p-AMPK表达明显增高;（4）与阴性对照组相比,ANRIL小干扰RNA转染后明显促进HSCs增殖。小结:Lnc RNAANRIL可能因DNMT3A介导的高水平甲基化修饰而表达下调,使得ANRIL对AMPK信号通路核心蛋白AMPK的抑制作用减弱,AMPK蛋白磷酸化水平升高,激活AMPK信号通路,HSCs增殖活性增强,促进肝纤维化的形成。结论:1.DNMT3A高表达与Lnc RNA ANRIL低表达以及肝脏功能受损,可能与肝纤维化形成有关。2.DNMT3A高表达与Lnc RNA ANRL发生高甲基化修饰导致ANRIL表达下调,可能与肝纤维化形成和HSCs增殖有关。3.LncRNA ANRIL可能因DNMT3A介导的高甲基化修饰而表达下调,使得ANRIL对AMPK信号通路核心蛋白AMPK的抑制作用减弱,AMPK蛋白磷酸化水平升高,激活AMPK信号通路,HSCs增殖活性增强,促进肝纤维化的形成。
刘文婷[8]（2020）在《脂多糖诱导肝前体细胞异常分化参与肝癌微环境形成的机制研究》文中认为【研究背景及目的】肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是常见的恶性肿瘤之一,尤其在我国特别高发,其死亡率居恶性肿瘤第三位。肝癌是一种炎症相关肿瘤,慢性炎症贯穿肝癌发生发展始终,许多慢性病毒肝炎、非酒精性脂肪肝及酒精肝都可能会发展成肝癌。肝癌多在肝纤维化及肝硬化等慢性肝损伤的基础上形成。肝纤维化是许多慢性肝病共同的病理过程,是慢性炎症引起机体对于损伤的一种修复反应。若损伤因素长期存在,肝纤维化则会进一步发展成肝硬化,而将近三分之一的肝硬化患者最终会发展成为肝癌。因此,研究慢性炎症诱发肝纤维化以及肝纤维化如何演变成肝癌对于肝癌的预防具有重要的意义。肌成纤维细胞是肝纤维化形成的主要效应细胞,其主要来源于活化的肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSCs）。最新的研究表明肝前体细胞（hepatic progenitor cells,HPCs）也可以分化为肌成纤维细胞。HPCs是一类具有双向分化潜能的未成熟细胞,其在生理条件下可通过肝向和胆向分化参与肝脏慢性损伤的修复过程。而在病理条件下也被认为是肿瘤起始细胞的重要来源,参与肝癌的发生。然而,慢性炎症微环境中,HPCs参与肝癌发生的机制以及影响HPCs异常分化的因素目前尚不够明确。越来越多研究表明,慢性肝损伤是导致肝癌发生的重要病理过程。脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）是由革兰氏阴性菌死亡后的胞壁崩解自溶释放产生,具有多种生物活性。生理条件下,由肠道细菌产生的LPS通过肠粘膜进入毛细血管后经门静脉进入肝脏后被解毒清除。慢性肝损伤过程中,由于门脉高压及胆汁代谢异常引起肠道的渗透性增加,导致肠道菌群紊乱,从而使肠道中更多的LPS通过门静脉进入肝脏,导致LPS在“肝炎-肝硬化-肝癌”这一所谓“肝癌三部曲”中持续升高。LPS是重要的促炎因子,可以促进炎症因子如白介素-1β（interleukin-1-beta,IL-1β）、白介素-6（interleukin-6,IL-6）、白介素-8（interleukin-8,IL-8）,白介素-12（interleukin-12,IL-12）,干扰素（type I interferons,IFNs）),转化生子因子（tranforming growth factor-beta,TGF-β）以及肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha,TNF-α）的产生。因此,LPS在肝纤维化及肝癌发生中都扮演重要角色。然而LPS对HPCs功能的影响,目前研究较少。探索LPS及HPCs对肝癌发生的作用并研究LPS对HPCs功能的影响及机制,不仅有助于我们认识肿瘤微环境中炎症与HPCs的相互作用对肝癌发生的影响,还可为进一步的微环境干预研究提供理论依据。本课题我们首先利用肝癌临床标本和大鼠原发性肝癌动物模型观察了HPCs的激活、肝纤维化程度与肝癌发生之间的相关性,发现HPCs的激活与肝纤维化的形成及肝癌的发生密切相关。我们在DEN诱导的大鼠原发性肝癌模型中通过外源性输注HPCs,研究HPCs对肝癌发生的影响,发现外源性HPCs的输注促进了肝纤维化的形成及肝癌的发生,LPS在上述过程中发挥了重要作用。此外,实验结果提示LPS并不能直接诱导HPCs形成肿瘤,而是诱导HPCs向肌成纤维细胞转化,在此基础上肌成纤维细胞可进一步诱导HPCs形成肿瘤。相关机制研究发现,LPS诱导的HPCs来源的肌成纤维细胞通过分泌IL-6和TNF-α,进一步诱导HPCs中Ras信号通路的激活和p53信号通路的失活从而最终促进HPCs的增殖和异常转化。此外,通过将肝癌临床样本中IL-6和TNF-α表达水平与激活的HPCs、肝纤维化水平及肝癌复发进行相关性分析后发现,IL-6和TNF-α与上述指标都密切相关。我们的研究结果提示,肝癌微环境中的肌成纤维细胞和肝癌细胞均可能来源于HPCs。HPCs源性肌成纤维细胞参与构成肿瘤微环境,促进HPCs的增殖和异常转化。LPS不仅参与诱导了肝脏慢性炎症微环境形成,同时也在调控HPCs可塑性进而促进肝癌发生中发挥了重要作用。第一部分:肝前体细胞与肝纤维化及肝癌发生的相关性研究首先,我们利用大鼠DEN原发性肝癌模型及肝癌临床组织标本,观察诱癌不同时期肝脏组织纤维化水平与HPCs激活的相关性,并观察肝癌临床标本的癌旁组织中纤维化水平与HPCs激活的相关性。实验结果发现在诱癌过程中,HPCs激活数量越多,纤维化水平越高,并且HPCs激活与纤维化水平存在相关性。此外,在肝脏癌旁组织中,同样存在这一现象,并且纤维化水平及HPCs激活数量都与患者生存期存在相关性,HPCs激活数量越多,肝癌患者预后越差。为了进一步明确HPCs在肝癌发生中的作用,我们利用大鼠DEN原发性肝癌模型,通过外源输注HPCs,观察其对肝癌发生、肝功能及生存期的影响。结果显示,HPCs输注促进了肝脏肿瘤的发生,肝损伤加剧,同时生存期缩短。进一步病理组织检测发现,HPCs输注促进肝脏纤维化水平,表现为纤维结缔组织增多及α-SMA表达升高。为了探讨外源HPCs输注后在肝脏部位的分布,我们利用GFP标记的慢病毒载体转染HPCs细胞,再将GFP标记的HPCs输注到诱癌大鼠体内。结果发现,GFP阳性的HPCs多趋化至肝脏间质部位,并呈现α-SMA表达阳性。上述结果提示:肝癌发生过程中HPCs的数量与肝纤维化水平存在相关性。在肝癌发生中,HPCs可以促进肝脏纤维化及肿瘤的发生,并有可能向肌成纤维细胞分化。第二部分:脂多糖诱导肝前体细胞异常分化参与肝癌微环境形成的作用肝癌发生过程中,外周血LPS浓度持续升高,那么LPS是否参与HPCs对肝纤维化及肝癌发生的作用?我们利用大鼠DEN原发性肝癌模型,通过四联抗生素清除LPS,再观察外源HPCs输注对肝纤维化及肝癌发生,肝功能及生存期的影响。结果发现,清除LPS后,大鼠肝癌发生被抑制,肝功能好转,同时肝癌大鼠的生存期延长。进一步组织病理检测发现,抑制LPS后,肝纤维化水平也随之降低。为了进一步明确LPS对HPCs功能的影响,我们利用LPS处理HPCs细胞系,采用转录组测序技术分析LPS对HPCs基因表达的影响,发现纤维化相关基因的表达被上调,而LPS对HPCs中肿瘤相关基因的表达没有影响。为了进一步证实这一现象,我们输注到诱癌大鼠体内的GFP标记的HPCs分选出来,通过RT-PCR及Western Blot技术检测发现,GFP阳性细胞中肌成纤维细胞相关基因表达上调。这一结果证实了第一部分研究中提出的HPCs可能向肌成纤维细胞分化的假设。此部分结果提示LPS可诱导HPCs向肌成纤维细胞分化从而参与肝纤维化的形成。第三部分:脂多糖诱导肝前体细胞异常分化参与肝癌微环境形成的机制前两部分研究证实了HPCs参与肝纤维化及肝癌发生,LPS在诱导HPCs分化为肌成纤维细胞中发挥重要作用。为了进一步探讨HPCs源性的肌成纤维细胞对肝癌发生的影响,我们将LPS处理后的HPCs与正常HPCs混合后接种裸鼠皮下,结果发现有肿瘤形成,而作为对照组的正常HPCs接种组和LPS预处理HPCs接种组并未见肿瘤形成。这一结果表明HPCs来源的肌成纤维细胞可能参与了肝癌发生相关微环境的构成,导致了HPCs的异常分化,促进了肝癌发生。在进一步的机制研究中,我们分别利用正常HPCs及LPS处理后的HPCs条件培养上清去处理HPCs,细胞增殖实验显示LPS处理后的HPCs条件培养上清可较对照组明显促进正常HPCs的增殖。我们通过Bioplex细胞因子芯片检测,发现LPS处理HPCs分化为肌成纤维细胞之后,炎症因子IL-6及TNF-α的表达升高。进一步通过基因芯片检测发现,LPS诱导的HPCs来源的肌成纤维细胞上清激活了HPCs中肿瘤相关信号通路Ras的表达,同时抑制了抑癌信号通路p53的表达。该结果提示,HPCs来源的肌成纤维细胞分泌了大量IL-6及TNF-α,而IL-6和TNF-α进一步诱导HPCs中Ras和p53信号通路的异常表达,促进HPCs异常分化从而导致肝癌发生。最后,通过将肝癌临床样本中IL-6和TNF-α表达水平与HPCs的激活、肝纤维化水平及肝癌复发进行相关性分析后发现,IL-6和TNF-α与上述指标均密切相关。综上所述,本研究结果证实,LPS在肝脏炎症损伤过程中持续升高并可诱导HPCs分化为肌成纤维细胞,而LPS诱导的HPCs来源的肌成纤维细胞通过分泌IL-6和TNF-α诱导HPCs中Ras和p53信号通路的异常表达,最终通过HPCs的恶性增殖及转化导致了肝癌的发生。
陶科攻[9]（2020）在《LncRNA uc.420-调控肝星状细胞自噬信号通路的体外研究》文中提出【研究背景及目的】肝纤维化（hepatic fibrosis）是一种以细胞外基质（extracellular matrix,ECM）在肝内过度沉积为特征的肝脏慢性损伤过程,是一种多因素调节的过度修复反应。既往观点认为,肝纤维化导致的慢性损伤无法逆转。近年来,多项研究发现,肝纤维化是一个动态变化的可逆性病理过程,通过早期干预,肝纤维化进展可以被抑制甚至逆转。较早研究表明,肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）的活化与增殖是肝纤维化发生发展的中心环节。HSC在正常肝组织中处于静息状态,在受到病毒、寄生虫等病原体感染或CCl4、黄曲霉等理化因素刺激时,可转分化为肌成纤维细胞（myofibroblast,MFS）,合成并分泌ECM。因此,深入挖掘HSC活化的分子机制,寻找调控HSC活化的靶点,是治疗肝纤维化的重要方法之一。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lnc RNA）是一类长度在200bp-100kbp之间、不具有蛋白质编码功能的RNA的统称。lnc RNA不仅可以与转录因子、染色质组蛋白以及其他转录调节蛋白相结合,直接调控基因表达和染色体活性;也参与m RNA翻译、剪切、蛋白质降解和磷酸化修饰、RNA结合蛋白亚细胞定位、细胞骨架构成等机体重要生理过程,还可以作为竞争性内源RNA（competing endogenous RNA,ce RNA）结合其它内源RNA,如微小RNA（micro RNA,mi RNA）等,在转录后水平调控相关基因的表达。自噬（autophagy）是一种溶酶体依赖的降解途径,广泛存在于真核细胞内,通过降解损伤或多余细胞器维持细胞能量平衡。根据被消化底物的不同,自噬分为巨自噬、微自噬和分子伴侣介导自噬。本研究所指自噬为巨自噬。在基础条件下,细胞内自噬发生处于较低水平;但在饥饿、缺氧、内质网应激、病原微生物感染等条件下,自噬水平升高。自噬是真核细胞对抗感染、神经退行性疾病和肿瘤的重要调控机制,自噬途径的异常也与多种疾病的病理过程相关。既往研究发现,自噬可促进HSC活化,导致肝纤维化进展;抑制自噬能够下调Ⅰ型前胶原m RNA表达,削弱HSC活性。其中,自噬相关基因5（ATG5）是重要的自噬相关基因之一。在肝纤维化进展过程中,ATG5表达上调,且这种高表达主要分布在肝小叶间隔及汇管区,与HSC分布一致。因此,通过抑制HSC ATG5表达及其下游自噬相关信号通路活性,进一步调控HSC活性可能为肝纤维化治疗提供新的靶点和手段。前期研究中,我们利用Arraystar Human Lnc RNAArray v2.0 8*60K芯片（涵盖30,215条m RNA和33,045条lnc RNA）分析正常人及肝硬化患者肝组织lnc RNA表达情况,从中筛选出肝硬化患者肝组织中上调的lnc RNA uc.420-,并在4种不同肝纤维化大鼠模型肝组织中进行验证。研究还发现,肝纤维化大鼠肝组织中mi R-194-5p表达下调,ATG5表达上调。沉默HSC-T6细胞株uc.420-,mi R-194-5p表达上调。因此,我们希望通过证实uc.420-、mi R-194-5p和ATG5之间的关系,阐明其对肝纤维化的作用机制,为肝纤维化的治疗提供新的可能方案。【实验方法】一、肝纤维化差异表达lnc RNA uc.420-靶基因的验证和人肝硬化肝组织、肝纤维化大鼠模型肝组织、不同活化状态HSC中uc.420-及其靶mi RNA mi R-194-5p及ATG5等自噬相关基因和纤维化相关基因差异表达1、通过mi Rmap网站进行生物信息学分析,预测mi R-194-5p与ATG5 3’-UTR之间可能存在的结合位点。2、设计携带uc.420-全长序列的野生型（wild type,WT）uc.420-报告基因质粒（WT-uc.420-）和uc.420-与mi R-194-5p预测结合位点序列突变的突变型（mutation type,MUT）uc.420-报告基因质粒（MUT-uc.420-）,合成mi R-194-5p类似物片段（mi R-194-5p mimic）及其阴性对照片段（NC mimic）,将WT-uc.420-、MUT-uc.420-分别与mi R-194-5p mimic或NC mimic共转染HEK-293细胞株,进一步证实mi R-194-5p为uc.420-直接调控靶基因。3、制备野生型ATG5 3’-UTR报告基因质粒（WT-ATG5 3’-UTR）和ATG5 3’-UTR与mi R-194-5p之间预测结合位点序列突变的突变型ATG5 3’-UTR报告基因质粒（MUT-ATG5 3’-UTR）,将WT-ATG5 3’-UTR和MUT-ATG5 3’-UTR分别与mi R-194-5p mimic、NC mimic共转染HEK-293细胞,证实ATG5为mi R-194-5p的直接调控靶基因。4、获得患者知情同意并签署相关同意书后,留取5例正常肝脏组织及5例确诊为肝硬化患者的肝组织标本。5、构建硫代乙酰胺（thioacetamide,TAA）肝纤维化大鼠模型本研究使用TAA法构建大鼠肝纤维化模型。TAA肝纤维化大鼠模型:将雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠随机分为肝纤维化模型组和对照组,每组10只。对照组按1ml/100g的剂量腹腔注射生理盐水3次/周,16W后处死,留取肝组织。肝纤维化模型组按照1ml/100g的剂量腹腔注射20mg/ml TAA溶液3次/周,16W后处死,留取肝组织。6、胶原酶改良原位循环灌流法分离SD大鼠原代HSC,将分离出的细胞分为3组:第1组为静息状态组,第2组用TGF-β1（2ng/ml）刺激3天,第3组用TGF-β1（2ng/ml）刺激7天。7、检测并验证uc.420-、mi R-194-5p、ATG5等自噬通路相关基因（ATG5、ATG7、LC3、Beclin 1和p62）和肝纤维化相关基因（TIMP2、MMP2、MMP9、COLⅠA1、Col-Ⅲ和α-SMA）表达差异。Real time RT-PCR检测肝硬化患者肝组织、肝纤维化大鼠模型肝组织、HSC活化过程中不同时间点（静息状态、第3天、第7天）uc.420-、mi R-194-5p表达差异。real time RT-PCR及western-blot检测肝硬化患者肝组织、肝纤维化大鼠模型肝组织以及HSC活化过程中不同时间点ATG5等自噬通路相关基因和肝纤维化相关基因表达差异。二、下调uc.420-调控ATG5信号通路及纤维化相关基因表达1、前期研究中,我们已经设计出uc.420-的小干扰RNA（small interfering RNA,si RNA）si-uc.420-。以si-uc.420-转染HSC-T6细胞株,沉默uc.420-表达,real time RT-PCR及western-blot检测下调uc.420-表达对mi R-194-5p、ATG5等自噬通路相关基因以及肝纤维化相关基因表达的影响。2、构建含有嘌呤霉素（purinemycin,PURO）抗性基因且沉默uc.420-表达的慢病毒重组质粒mi RZip-shuc.420-和含有PURO抗性基因的对照慢病毒重组质粒mi RZip-sh NC,包装、扩增获得下调uc.420-表达的慢病毒lenti-shuc.420-及对照病毒lenti-sh NC。3、绘制杀灭曲线,明确筛选培养基的PURO浓度。分别用lenti-shuc.420-和lenti-sh NC感染HSC-T6细胞株,用含PURO的筛选培养基筛选稳转株lenti-shuc.420--HSC-T6和lenti-sh NC-HSC-T6并扩增,抽提RNA和蛋白,在转录和蛋白水平检测抑制uc.420-表达对mi R-194-5p、ATG5等自噬通路相关基因以及肝纤维化相关基因表达的影响。4、分离大鼠原代HSC,贴壁后每隔2天换液,2ng/ml浓度的TGF-β1刺激7天后,分别用lenti-shuc.420-和lenti-sh NC感染活化的原代HSC细胞。在RNA水平检测抑制uc.420-表达对mi R-194-5p、ATG5等自噬通路相关基因以及肝纤维化相关基因表达的影响。三、下调uc.420-对活化HSC和HSC-T6细胞生物学活性和自噬活性影响1、扩增lenti-shuc.420--HSC-T6和lenti-sh NC-HSC-T6,对两种稳转株进行以下检测:transwell法检测迁移能力;CCK-8法检测增殖能力;流式细胞仪检测凋亡水平。2、TGF-β1（2ng/ml）刺激7天的大鼠原代HSC,分别以lenti-shuc.420-和lenti-sh NC感染。CCK-8法检测感染后大鼠原代HSC增殖能力;流式细胞仪检测转染后大鼠原代HSC凋亡水平。3、电镜观察lenti-shuc.420--HSC-T6和lenti-sh NC-HSC-T6细胞内自噬小体形成;双荧光腺病毒（Ad-m RFP-GFP-LC3）感染lenti-shuc.420--HSC-T6和lenti-sh NC-HSC-T6,共聚焦显微镜下观察m RFP-GFP-LC3融合蛋白,示踪自噬体形成、降解及分布情况,明确自噬流强弱。4、感染lenti-shuc.420-和lenti-sh NC的大鼠原代活化HSC,电镜观察感染后HSC细胞内自噬小体数量变化;Ad-m RFP-GFP-LC3感染慢病毒感染后的大鼠原代活化HSC,共聚焦显微镜下观察m RFP-GFP-LC3融合蛋白,示踪自噬体形成、降解及分布,明确自噬流强弱。四、统计学分析计量资料中服从正态分布则使用平均数±标准差（—X±SD）表示,不服从正态分布则采用中位数（Q1,Q3）表示。服从正态分布的计量资料（方差齐性）的组间比较采用两组独立样本t检验;非正态分布或方差非齐性的组间比较则采用非参数检验。应用SPSS 21.0软件进行实验数据统计分析,双侧P<0.05则认为组间差异有统计学意义,双侧P<0.01则认为组间差异有显着统计学意义。【实验结果】一、筛选验证uc.420-下游靶基因1、生物信息学分析发现,uc.420-、mi R-194-5p与ATG5之间存在靶向调控关系。2、证实mi R-194-5p是uc.420-靶基因。分别将mi R-194-5p mimic、NC mimic和WT-uc.420-报告基因质粒、MUT-uc.420-报告基因质粒共转染HEK-293细胞,结果显示:与WT-uc.420-+NC mimic组相比,WT-uc.420-+mi R-194-5p mimic组的荧光素酶活性降低44.5%（P<0.01）（此部分重复验证,鉴定前期研究类似结果）;与MUT-uc.420-+NC mimic组相比,MUT-uc.420-+mi R-194-5p mimic组荧光素酶活性无明显变化。3、证实ATG5是mi R-194-5p的靶基因。分别将mi R-194-5p mimic、NC mimic和WT-ATG5 3′-UTR报告基因质粒、MUT-ATG5 3′-UTR报告基因质粒共转染HEK-293细胞,结果显示:与WT-ATG5 3′-UTR+NC mimic组相比,WT-ATG53′-UTR+mi R-194-5p mimic组的荧光素酶活性降低37.6%（P<0.01）;与MUT-ATG53′-UTR+NC mimic组相比,MUT-ATG5 3′-UTR+mi R-194-5p mimic组的荧光素酶活性无明显差异。二、人肝硬化组织、肝纤维化大鼠肝组织、大鼠原代活化HSC中uc.420-、mi R-194-5p、ATG5自噬通路相关基因及纤维化相关基因表达差异与对照组相比较,在人肝硬化肝组织、大鼠肝纤维化模型肝组织、大鼠活化HSC中,uc.420-表达显着上调,mi R-194-5p表达下调,ATG5等自噬通路相关基因在RNA和蛋白水平表达均上调,肝纤维化相关基因在RNA和蛋白水平表达均上调。三、体外下调uc.420-抑制ATG5自噬相关信号通路及纤维化相关基因表达1、Si-uc.420-和NC分别转染HSC-T6细胞株。转染后48h,real time RT-PCR检测发现,与NC组相比,si-uc.420-组uc.420-表达显着下调,mi R-194-5p表达显着上调。Real time RT-PCR和western blot检测发现,与NC组相比,si-uc.420-组ATG5等自噬通路及相关基因表达下调,纤维化相关基因表达受到抑制。2、分别对lenti-shuc.420--HSC-T6和lenti-sh NC-HSC-T6中抽提的RNA和蛋白检测。real time RT-PCR显示,与lenti-sh NC-HSC-T6组相比,lenti-shuc.420--HSC-T6组uc.420-表达较lenti-sh NC-HSC-T6组显着下调,mi R-194-5p表达上调。real time RT-PCR和western-blot法检测发现,与lenti-sh NC-HSC-T6组相比,lenti-shuc.420--HSC-T6组ATG5自噬通路及相关基因表达受到抑制,纤维化相关基因表达受到抑制。四、体外下调uc.420-抑制HSC-T6细胞株和活化大鼠原代HSC细胞生物学活性和自噬活性1、对稳转株lenti-shuc.420--HSC-T6和lenti-sh NC-HSC-T6行细胞活性检测发现:与lenti-sh NC-HSC-T6相比,transwell方法检测lenti-shuc.420--HSC-T6的迁移能力明显受抑制（P<0.05）;CCK-8法检测lenti-shuc.420--HSC-T6的增殖能力降低（P<0.05）;流式细胞仪检测lenti-shuc.420--HSC-T6的凋亡增加（P<0.05）。2、分别对lenti-shuc.420-和lenti-sh NC感染后的大鼠活化原代HSC检测发现:与lenti-sh NC组相比,CCK-8法检测lenti-shuc.420-组细胞增殖能力降低（P<0.05）;流式细胞仪检测lenti-shuc.420-组细胞凋亡增加（P<0.05）。3、分别对稳转株lenti-shuc.420--HSC-T6和lenti-sh NC-HSC-T6进行电镜和共聚焦显微镜观察。电镜观察发现:与lenti-sh NC-HSC-T6组相比,lenti-shuc.420--HSC-T6组细胞内自噬小体数量减少（P<0.05）。共聚焦显微镜观察发现:感染Ad-m RFP-GFP-LC3后,与lenti-sh NC-HSC-T6组相比,lenti-shuc.420--HSC-T6组细胞内自噬流减弱（P<0.05）。4、分别对感染慢病毒lenti-shuc.420-和lenti-sh NC的大鼠活化原代HSC进行电镜和共聚焦显微镜观察。电镜观察发现:与lenti-sh NC组相比,lenti-shuc.420-组细胞内自噬小体数量减少（P<0.05）。共聚焦显微镜观察发现:感染Ad-m RFP-GFP-LC3后,与lenti-sh NC组相比,lenti-shuc.420-组细胞内自噬流明显减弱（P<0.05）。【结论】1、生物信息学分析和体外实验证实mi R-194-5p是uc.420-的靶基因;ATG5是mi R-194-5p的靶基因。2、与对照组相比,人肝硬化肝组织、大鼠纤维化模型肝组织和不同时间点大鼠活化HSC中,uc.420-的表达上调,mi R-194-5p表达下调,ATG5等自噬通路相关基因及纤维化相关基因表达上调。3、沉默uc.420-表达可促进mi R-194-5p表达,进而抑制活化HSC中ATG5自噬信号通路及纤维化相关基因的表达。4、沉默uc.420-表达可抑制HSC活化及其生物学活性和自噬活性。
刘旭[10]（2020）在《肝硬化病人的肝星状细胞转录组学研究》文中认为研究背景及目的:肝纤维化是由慢性肝损害引起的一种动态、失衡的创伤愈合反应,其特征是细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的网状堆积,肝硬化是纤维化晚期的病理状态。全球肝硬化负担严重,抗纤维化研究已成为当前肝病领域的热点与难点。HSCs被认为是产生ECM的主要细胞群,其由静止的且贮存维生素A的状态到活化的且增殖的状态的转变代表了肝脏损伤的持续存在和纤维化的发生,在肝纤维化和肝硬化发生发展中扮演核心角色。增强对HSCs活化机制及纤维形成的理解有助于肝纤维化的早期诊断及潜在治疗靶点的揭示。高通量测序技术的出现为基于转录组学的关键分子的识别带来了前所未有的机遇。除编码RNAs外,nc RNAs亦参与调控HSCs的活化。鉴于肝纤维化的确切机制尚未建立且基于NGS技术的病人来源HSCs的转录组学研究尚无,本研究旨在展现人HSCs分离技术,并利用RNA-seq（RNA sequencing）,对人HSCs的m RNAs及mi RNAs表达情况进行分析,以寻找与肝纤维化诊断与治疗相关的分子靶点。如今,组学研究正着眼于单个细胞的特征描述,为研究者带来潜在且意想不到的生物学发现。本研究旨在利用单细胞测序技术研究HBV相关肝硬化中细胞亚群的改变及潜在调控机制,揭示疾病本质。材料与方法:本研究采用IV型胶原酶循环灌流法从手术切除的肝组织中分离人HSCs,并利用维生素A的自发荧光特性、免疫荧光染色对HSCs进行鉴定。收集9例肝硬化及6例非肝硬化患者的HSCs,构成肝硬化-非肝硬化HSCs比较方案（非肝硬化HSCs作为对照）,比较肝硬化与非肝硬化状态HSCs的m RNA组学差异。另外,将状态较好的新鲜分离的HSCs体外培养14天,获取7对初始及充分活化状态的HSCs,构成培养活化-新分离HSCs比较方案,以模拟肝纤维化过程,对比HSCs培养前后的基因表达差异。具体步骤如下:收集研究对象的人口学和临床特征,记录组织热缺血时间及细胞产率。对上述两个方案的HSCs进行RNAs提取、c DNAs文库建立及测序。对测序数据的基因表达水平进行计算并得到样本之间m RNAs的相关性及差异表达m RNAs（differentially expressed m RNAs,DEm RNAs）,通过层次聚类分析确定不同样本中DEm RNAs的表达模式。对两个方案的差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）进行GO、KEGG、Reactome及Dis Ge NET等多种富集分析及数据一致性检验。利用蛋白质交互作用（proteinprotein interaction,PPI）网络寻找肝纤维化相关的关键基因（hub genes）并进行实时定量PCR（quantitative real time PCR,q RT-PCR）验证。选取4对体外培养前后的HSCs,收集患者及肝组织的基本信息。对HSCs进行RNAs提取、c DNAs文库建立及测序。计算mi RNAs表达水平及样本的相关性。对mi RNAs进行差异表达分析与层次聚类分析,并将本研究数据与公开发表的肝组织mi RNA-seq数据进行对比。利用q RT-PCR对肝病相关mi RNAs进行验证。预测差异表达mi RNAs（differentially expressed micro RNAs,DEmi RNAs）的靶m RNAs构建共表达网络并利用GO及KEGG分析对靶DEGs进行富集分析。初步分析mi R-1268a、mi R-665对肝纤维化的影响。采用循环灌流法及单细胞测序样本制备流程获取单细胞悬液。纳入4例HBV相关肝硬化肝组织及3例正常肝组织,在10x Genomics平台中形成单细胞Gel Bead in Emulsions（GEMs）结构。随后构建测序文库、测序、评估单细胞测序质量并生成细胞基因表达矩阵。经历细胞过滤后,对多个样本的表达矩阵进行校正、降维及聚类。利用细胞标志对不同群（cluster）的细胞进行定义。结果:本研究成功对人肝组织中的HSCs进行分离,细胞产率为105-106个/g。在mRNA-seq中,肝硬化与非肝硬化患者的性别及年龄分布、肝功能指标均衡可比。分析过程中1例肝硬化样本因聚类不符而被去除。最终,在硬化组织的HSCs中筛选到3,828个DEGs,分别有2,251、1,577个基因的表达水平出现了显着性上调和下调。培养活化-新分离HSCs比较方案纳入7对配对样本,排除了疾病基础及其他指标的干扰。HSCs被激活后m RNAs表达情况发生明显的改变,共鉴定出2,262个DEGs,包含1,032个显着上调的基因及1,230个显着下调的基因。两种比较方案的层次聚类分析均显示相同处理条件下基因的表达模式相近,且经典的肝纤维化相关基因可在差异表达谱中被验证。综合两种方案的生物信息学分析结果,DEGs参与ECM组成、小分子代谢等多种进程,并在粘着斑、视黄醇的新陈代谢、胶原或ECM生成、组装或降解等通路显着富集。PPI分析显示肝硬化-非肝硬化HSCs比较方案及培养激活-新分离HSCs比较方案的DEGs分别存在9,960、8,042对互作关系,COL1A1、COL1A2、VIM、MMP2、ITGB4、ITGA2、CDK1、HGF、CAV1、GSTP1、GNAI2、APP、SHC1、LPL、BCR、ESR1、CXCR4等17个基因被识别为肝纤维化的关键基因,包括与肝纤维化关系明确的基因（如COL1A1、MMP2、HGF等）及作用尚待明确的基因。q RT-PCR结果提示,在肝硬化发生时或HSCs被体外激活时,上述基因在转录水平发生改变,反映了HSCs在肝纤维化进展中的反应。根据mi RNA-seq分析可知,随着HSCs的激活,共鉴定到230个DEmi RNAs,包含118个上调的mi RNAs及112个下调的mi RNAs。从表达差异最为显着的mi RNAs中发现,mi R-758-3p、mi R-493-5p、mi R-409-3p、mi R-31-5p、mi R-1268a和mi R-381-3p等肝病相关mi RNAs亦可能在肝纤维化中扮演角色。其中,mi R-1268a拥有最丰富的靶DEm RNAs,在调控HSC活化过程中至关重要。将本研究的HSCs测序数据与公开的肝组织测序数据进行比较,let-7g-5p、mi R-101-3p、mi R-107、mi R-122-5p、mi R-127-3p、mi R-139-5p、mi R-148a-3p、mi R-192-5p、mi R-194-5p、mi R-215-5p、mi R-24-3p、mi R-26a-5p、mi R-340-5p、mi R-451a及mi R-99a-5p被证实在两组之间重叠。对表达模式矛盾的mi R-101-3p、mi R-192-5p和mi R-24-3p进行检测,结果与我们的数据基本一致。同时,mi RNAs-m RNAs共表达网络（|pearson相关系数|≥0.7,p<0.05）被描述,其由1,891对匹配的mi RNA-m RNA组成,代表了138个DEmi RNAs和1,414个DEm RNAs（mi R-665展现最强的联系性）。靶DEGs的集合参与胶原代谢、ECM结构组成、细胞骨架蛋白结合、细胞粘附等过程。在肝星状细胞系LX-2细胞中,沉默mi R-1268a或导入mi R-665模拟物可上调COL1A1的表达。基于单细胞内基因表达情况的差异,来自7例人肝组织的64,990个细胞被聚集成14个clusters,任一cluster均包肝硬化及正常对照肝组织的细胞。参考数据库对细胞初步分类及定义,肝细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核巨噬细胞、胆管上皮细胞、内皮细胞、间充质细胞、固有淋巴细胞（innate lymphoid cells,ILCs）及树突细胞（dendritic cells,DCs）等有9种细胞类型被鉴定。聚类热图显示clusters之间的基因表达情况呈阶梯状,差异清晰,在乙肝相关肝硬化中行使相应功能。结论:本研究建立的循环灌流法可充分消化肝组织并成功分离出人HSCs,为肝纤维化的机制研究奠定了基础。利用RNA-seq,本研究从m RNAs及mi RNAs水平揭示了人HSCs在疾病进程中或体外活化时的变化特点,为肝纤维化的诊断与治疗靶点的筛选提供依据及参考。本研究提及的hub基因及mi RNAs与HSCs激活或纤维化发生密切相关,可能成为候选生物标志物。此外,基于肝内不同细胞群体,本研究建立了HBV相关肝硬化的单细胞图谱。未来的研究将着眼于利用单细胞测序结果及相关分析以剖析肝纤维化的细胞和分子基础的未知领域,并提供研究肝纤维化治疗靶点所需的概念框架。
二、Differences in TGFβ signaling in quiescent and activated hepatic stellate cells（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Differences in TGFβ signaling in quiescent and activated hepatic stellate cells（论文提纲范文）
（1）Liver regeneration biology: Implications for liver tumour therapies（论文提纲范文）
| INTRODUCTION |
| SECTION 1:MODELS OF LIVER REGENERATION |
| Historical evolution of liver regeneration research |
| Current predominant animal models:rat,mouse,and zebrafish |
| In vitro models |
| Human models |
| SECTION 2:EARLY EVENTS POST LIVER INJURY AND TRIGGERS TO LIVER REGENERATION |
| Vascular events |
| Hypoxia |
| Haemostasis related factors |
| ECM changes |
| SECTION 3:HEPATIC MITOGENS |
| Priming of hepatocytes |
| Complete mitogens |
| Auxiliary mitogens |
| Complex mitogens |
| Intracellular signalling pathways |
| SECTION 4:THE CONTRIBUTION OF NON-PARENCHYMAL CELLS TO LIVER REGENERATION |
| Liver sinusoidal endothelial cells |
| Stellate cells |
| Kupffer cells |
| SECTION 5:THE‘ALTERNATIVE PATHWAYS’OF LIVER REGENERATION |
| Hepatocyte response heterogeneity after PH |
| Facultative stem cells and transdifferentiation pathways |
| SECTION 6:THE INFLUENCE OF UNDERLYING LIVER DISEASE ON LIVER REGENERATION |
| Age-related liver impairment |
| Acute liver injury |
| Hepatic steatosis |
| Hepatic fibrosis and cirrhosis |
| SECTION 7:MECHANISMS UNDERLYING CESSATION OF LIVER REGENERATION |
| TGFβ |
| Activins |
| ECM and integrin linked kinase |
| GPC3 |
| C/EBP |
| Cyclin E1 and E2 |
| Hippo/YAP pathway |
| Micro RNAs |
| SECTION 8:LIVER REGENERATION:IMPLICATIONS FOR THERAPY OF LIVER TUMOURS |
| Chemotherapy and liver regeneration |
| Liver volume manipulation |
| Liver disease limitations to liver resection |
| The role of the gut |
| Multivisceral resections |
| Bile metabolism considerations |
| Management of post-hepatectomy portal hypertension |
| Hypoxia |
| Adrenergic stimulation |
| The role of platelets and fibrinogen |
| Non parenchymal cell modulation |
| Modifying the proliferative response. |
| CONCLUSION |
（2）Transforming growth factor beta-1 upregulates glucose transporter 1 and glycolysis through canonical and noncanonical pathways in hepatic stellate cells（论文提纲范文）
| INTRODUCTION |
| MATERIALS AND METHODS |
| Reagents and antibodies |
| Generation of a mouse model of liver fibrosis |
| Patient liver samples |
| Western blot analysis |
| Cells and cell culture |
| Histological and immunohistochemical studies |
| RNA interference |
| Glycolytic function assay and lactate measurements |
| Cell counting kit-8 assay |
| Biochemical function analysis |
| RNA extraction and real-time polymerase chain reaction |
| Transwell migration assay |
| Tissue immunofluorescence staining |
| Statistical analysis |
| RESULTS |
| GLUT1 expression is correlated with liver fibrosis progression |
| TGF-β1 stimulates HSC activation by inducing GLUT1 expression and promoting aerobic glycolysis |
| TGF-β1 induces GLUT1 expression through the Smad pathway |
| The noncanonical p38 MAPK and PI3K/AKT signaling pathways are also involved in TGF-β1-mediated GLUT1 induction |
| The effect of GLUT1 on HSC migration and proliferation |
| GLUT1 inhibition delays the development of liver fibrosis in a mouse model of liver fibrosis |
| DISCUSSION |
| CONCLUSION |
| ARTICLE HIGHLIGHTS |
| Research background |
| Research motivation |
| Research objectives |
| Research methods |
| Research results |
| Research conclusions |
| Research perspectives |
（3）Mitochondria: A critical hub for hepatic stellate cells activation during chronic liver diseases（论文提纲范文）
| Introduction |
| Hepatic stellate cells (HSCs) |
| Mitochondria in fibrogenic HSCs |
| HSCs activation associated changes in mitochondrial respiration |
| HSCs activation associated metabolic changes in mitochondria |
| Other signaling molecules involved in mitochondria-mediated HSCs activation |
| Modulators of HSCs activation via mitochondrial functions |
| Future prospective |
| Conclusion |
| CRedi T authorship contribution statement |
| Ethical approval |
| Competing interest |
（4）β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1转录因子调控肝星状细胞改善肝脏纤维化的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1 参与肝星状细胞的增殖活化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要仪器及试剂盒 |
| 1.2 实验试剂配制 |
| 1.3 LX2 细胞培养及细胞传代 |
| 1.4 rhTGF-β诱导LX2 细胞活化增殖 |
| 1.5 ICG-001、AS1842856 干预活化的LX2 细胞 |
| 1.6 实验方法 |
| 1.7 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1 调控LX2 增殖活化表型 |
| 2.2 β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1 调控LX2 细胞增殖活化的作用机制 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 小鼠肝纤维化动物模型构建以及β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1 与肝纤维化病程关系初探 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要仪器及试剂盒 |
| 1.2 实验试剂配制 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 动物模型建立及实验分组 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.6 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 CCl_4、BDL模型不同时点的小鼠一般状况 |
| 2.2 CCl_4、BDL模型不同时点的肝脏外观改变 |
| 2.3 CCl_4、BDL模型不同时点的肝功能变化 |
| 2.4 CCl_4、BDL模型不同时点的组织学改变 |
| 2.5 CCl_4、BDL模型不同时点α-SMA免疫组织化学结果 |
| 2.6 CCl_4、BDL模型不同时点炎症因子表达水平 |
| 2.7 CCl_4、BDL模型不同时点β-catenin/FOXO1、β-catenin/TCF转录复合物变化. |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 抑制β-catenin/TCF改善CCL4、BDL小鼠模型肝纤维化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要仪器及试剂盒 |
| 1.2 实验试剂配制 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 动物模型建立及实验分组 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.6 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 抑制CCl_4、BDL模型β-catenin/TCF1 w、2 w时小鼠一般状况 |
| 2.2 抑制CCl_4、BDL模型β-catenin/TCF1 w、2 w时肝脏外观及肝重体重比 |
| 2.3 抑制CCl_4、BDL模型β-catenin/TCF1 w、2 w时血清肝功能水平 |
| 2.4 抑制CCl_4、BDL模型β-catenin/TCF1 w、2 wS时肝脏组织学变化 |
| 2.5 抑制CCl_4、BDL模型β-catenin/TCF1 w、2 w时 COL-I、α-SMA水平 |
| 2.6 抑制CCl_4、BDL模型β-catenin/TCF2 w促进FOXO1 靶基因foxp3、p27~(kip1)表达 |
| 2.7 抑制BDL模型β-catenin/TCF时肝脏组织炎症因子水平 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第四部分 BDL模型研究β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1 调控肝纤维化的分子机制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要仪器及试剂盒 |
| 1.2 实验试剂配制 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 动物模型建立及实验分组 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.6 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 β-catenin/TCF、FOXO1 共同调控肝纤维化进展 |
| 2.2 肝脏核蛋白中TCF、FOXO1与β-catenin竞争结合形成不同转录复合物 |
| 2.3 体内HSCs中 TCF、FOXO1与β-catenin形成不同转录复合物调控肝纤维化进展 |
| 2.4 β-catenin/TCF、FOXO1 调节肝脏组织炎症因子水平 |
| 2.5 β-catenin/TCF、FOXO1 调节肝脏组织细胞周期抑制蛋白p27~(kip1) |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第五部分 探讨人体肝脏组织β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1 转录复合物与纤维化进展的关系 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要仪器及试剂盒 |
| 1.2 临床组织标本收集 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 胆道闭锁导致胆汁淤积性肝纤维化患者基本信息统计 |
| 2.2 患者肝脏组织石蜡切片HE、Masson、天狼星红染色结果及纤维化分期 |
| 2.3 不同分期患者肝脏组织TGF-β、IL-10、Ki67 水平 |
| 2.4 不同分期患者肝脏组织β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1 水平 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 全文总结 |
| 创新点与不足之处 |
| 1.本研究的特色与创新点 |
| 2.本研究不足之处及进一步的研究设想 |
| 参考文献 |
| 综述 转化生长因子-β信号通路与纤维化 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（5）滇产铁皮石斛对CCl4诱导大鼠肝纤维化的保护作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词中英对照表 |
| 前言 |
| 实验技术路线 |
| 第一章 不同剂型铁皮石斛对CCl_4诱导肝纤维化大鼠的影响 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 药物与试剂 |
| 1.1.3 主要仪器及器械 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 分组与模型制备 |
| 1.2.2 大鼠死亡率 |
| 1.2.3 标本采集和留取 |
| 1.2.4 指标检测 |
| 1.2.5 统计学处理 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 大鼠肝纤维化模型建立的分析 |
| 1.3.2 两种剂型药物干扰后肝脏指数的变化 |
| 1.3.3 肝组织形态学变化 |
| 1.3.4 TGF-β1表达水平 |
| 1.3.5 大鼠肝功能和肝纤维指标的变化 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 CCl_4诱导的肝纤维化模型可成功复制 |
| 1.4.2 铁皮石斛干预SD大鼠肝纤维化的疗效分析 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 铁皮石斛多糖对活化肝星状细胞LX2的影响 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞种类 |
| 2.1.2 药物与试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 细胞实验耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 DCP溶液制备 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 采用细胞划痕实验检测DCP对HSC-LX2迁移率的影响 |
| 2.2.4 采用MTT法检测DCP对HSC-LX2增殖抑制率的影响 |
| 2.2.5 采用流式细胞术检测DCP对HSC-LX2细胞凋亡率的影响 |
| 2.2.6 统计学处理 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 HSC-LX-2一般情况 |
| 2.3.2 DCP对细胞迁徙率的影响 |
| 2.3.3 DCP对HSC-LX2增殖的影响 |
| 2.3.4 DCP对HSC-LX2凋亡率的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 Hedgehog信号通路与肝纤维化研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（6）TGF-β诱导肝癌细胞分泌IL-11而促进肝星状细胞活化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 肝细胞癌 |
| 1.2 肝星状细胞在肝癌发展中的功能 |
| 1.3 TGF-β在HSC以及肝癌发展中的作用 |
| 1.4 IL-11细胞因子及其与肿瘤之间的关系 |
| 1.5 TGF-β与IL-11的研究进展 |
| 1.6 科学假说 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要仪器设备 |
| 2.1.2 主要试剂材料 |
| 2.1.3 主要细胞株 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 主要试剂配制 |
| 2.2.2 细胞复苏 |
| 2.2.3 细胞换液 |
| 2.2.4 细胞传代 |
| 2.2.5 细胞冻存 |
| 2.2.6 RNA的提取、逆转录、实时荧光定量PCR(q PCR) |
| 2.2.7 RNA-Seq |
| 2.2.8 Western blot |
| 2.2.9 统计学分析 |
| 第三章TGF-β刺激肝癌细胞表达IL-11 |
| 3.1 TGF-β诱导肝癌细胞中IL-11的表达 |
| 3.2 TGF-β通过Smad通路刺激IL-11表达 |
| 3.3 IL-11激活肝癌细胞中的STAT3信号通路 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 IL-11 促进肝星状细胞活化 |
| 4.1 TGF-β诱导肝星状细胞中IL-11的表达 |
| 4.2 肝癌细胞分泌IL-11促进肝星状细胞活化 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 进一步工作方向 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 IL-11在肿瘤发生发展中的作用 |
| 参考文献 |
（7）DNMT3A介导LncRNA ANRIL甲基化促进肝纤维化的分子机制（论文提纲范文）
| 英文缩略词表(Abbreviation) |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 第一部分 临床肝纤维化患者样本中DNMT3A、ANRIL、α-SMA、Collagen I的差异表达 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 小结 |
| 第二部分 小鼠肝纤维化组织和肝星状细胞中DNMT3A、ANRIL、α-SMA、Collagen I的表达及ANRIL启动子区域甲基化水平 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三部分 DNMT3A 介导 ANRIL 甲基化在肝纤维化与 HSCs增殖中的分子作用机制 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 全文总结 |
| 本论文的创新性及特色 |
| 有待进一步研究的问题 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
| 综述 表观遗传调控肝纤维化中炎症与HSCs激活:聚焦DNA甲基化和组蛋白修饰 |
| 参考文献 |
（8）脂多糖诱导肝前体细胞异常分化参与肝癌微环境形成的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 肝前体细胞与肝纤维化及肝癌发生的相关性研究 |
| 一、引言 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 脂多糖诱导肝前体细胞异常分化参与肝癌微环境形成的作用 |
| 一、引言 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 脂多糖诱导肝前体细胞异常分化参与肝癌微环境形成的机制研究 |
| 一、引言 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 总结 |
| 综述-1 Toll 样受体 4 在肝纤维化及肝癌发生发展中的作用 |
| 参考文献 |
| 综述-2 The role of hepatic progenitor cells in liver diseases |
| References |
| 在读期间已发表的论文 |
| 致谢 |
（9）LncRNA uc.420-调控肝星状细胞自噬信号通路的体外研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第一部分 肝硬化组织、活化HSCUC.420-及下游自噬相关通路基因的筛选及鉴定 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 下调UC.420-表达对ATG5等自噬通路相关基因和纤维化相关基因表达的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 下调UC.420-表达对活化HSC细胞生物学活性和自噬活性的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 长链非编码 RNA 调控肝纤维化信号通路研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（10）肝硬化病人的肝星状细胞转录组学研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩写词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 肝纤维化或硬化的病因学及流行病学 |
| 1.2 肝纤维化或硬化的诊断与监测 |
| 1.3 肝星状细胞与肝纤维化相关机制的讨论 |
| 1.3.1 肝星状细胞的基本特征 |
| 1.3.2 肝星状细胞活化的调控 |
| 1.3.3 肝星状细胞活化的不同阶段 |
| 1.4 肝纤维化的治疗与逆转 |
| 1.5 转录组学研究进展 |
| 1.5.1 测序技术的发展与现状 |
| 1.5.2 全转录组测序的意义 |
| 1.5.3 RNAs的互作 |
| 1.5.4 基因功能富集分析 |
| 1.6 本研究的技术路线 |
| 第2章 人肝星状细胞的分离与鉴定 |
| 2.1 实验材料与方法 |
| 2.1.1 肝组织 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 实验方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 细胞形态及脂滴的变化 |
| 2.2.2 肝组织分离所得的人肝星状细胞的验证 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 基于mRNA测序的肝硬化病人肝星状细胞的转录组学研究 |
| 3.1 实验材料和方法 |
| 3.1.1 细胞 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 实验方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 研究对象的基线特征 |
| 3.2.2 测序样本的RNAs纯度及完整性检测 |
| 3.2.3 RNA-seq数据的质量控制 |
| 3.2.4 基于两种比较方案的mRNAs相关分析 |
| 3.2.5 差异表达基因的功能富集分析及数据一致性检验 |
| 3.2.6 肝纤维化相关hub基因的筛选 |
| 3.2.7 Hub基因的qRT-PCR验证 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 人原代肝星状细胞体外培养前后的micro RNA组学比较 |
| 4.1 实验材料和方法 |
| 4.1.1 细胞 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 实验方法 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 研究对象的人口学和临床特征 |
| 4.2.2 测序样本的RNAs纯度及完整度检测 |
| 4.2.3 MicroRNA测序数据的质量控制 |
| 4.2.4 MicroRNAs表达量相关性 |
| 4.2.5 MicroRNAs差异表达分析 |
| 4.2.6 差异表达microRNAs的qRT-PCR验证 |
| 4.2.7 差异 表达microRNAs的 靶基 因预 测及micro RNAs-mRNAs共表达分析 |
| 4.2.8 靶mRNAs的富集分析 |
| 4.2.9 MiR-1268a及miR-665 对肝纤维化的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 HBV相关肝硬化肝组织的单细胞测序结果初步分析 |
| 5.1 实验材料和方法 |
| 5.1.1 细胞 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.1.4 实验方法 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 用于肝组织单细胞测序的研究对象人口学和临床特征 |
| 5.2.2 单细胞测序的质量控制 |
| 5.2.3 肝组织单细胞测序后的细胞聚类及细胞定义 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 本实验创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
四、Differences in TGFβ signaling in quiescent and activated hepatic stellate cells（论文参考文献）
- [1]Liver regeneration biology: Implications for liver tumour therapies[J]. Christopher Hadjittofi,Michael Feretis,Jack Martin,Simon Harper,Emmanuel Huguet. World Journal of Clinical Oncology, 2021(12)
- [2]Transforming growth factor beta-1 upregulates glucose transporter 1 and glycolysis through canonical and noncanonical pathways in hepatic stellate cells[J]. Ming-Yu Zhou,Ming-Liang Cheng,Tao Huang,Rui-Han Hu,Gao-Liang Zou,Hong Li,Bao-Fang Zhang,Juan-Juan Zhu,Yang Liu,Yong-Mei Liu,Xue-Ke Zhao. World Journal of Gastroenterology, 2021(40)
- [3]Mitochondria: A critical hub for hepatic stellate cells activation during chronic liver diseases[J]. Devaraj Ezhilarasan. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International, 2021(04)
- [4]β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1转录因子调控肝星状细胞改善肝脏纤维化的机制研究[D]. 王晓玲. 山西医科大学, 2021(01)
- [5]滇产铁皮石斛对CCl4诱导大鼠肝纤维化的保护作用[D]. 于亚男. 大理大学, 2021(09)
- [6]TGF-β诱导肝癌细胞分泌IL-11而促进肝星状细胞活化[D]. 邓恬. 南昌大学, 2021(01)
- [7]DNMT3A介导LncRNA ANRIL甲基化促进肝纤维化的分子机制[D]. 杨晶晶. 安徽医科大学, 2021(01)
- [8]脂多糖诱导肝前体细胞异常分化参与肝癌微环境形成的机制研究[D]. 刘文婷. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(05)
- [9]LncRNA uc.420-调控肝星状细胞自噬信号通路的体外研究[D]. 陶科攻. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(02)
- [10]肝硬化病人的肝星状细胞转录组学研究[D]. 刘旭. 吉林大学, 2020(08)