一、Identification of DNA Markers for Cotton Leaf Curl Disease (CLCD) in Cotton (Gossypium hirsutum L. )（论文文献综述）
孙琳[1]（2021）在《CRISPR/Cas9介导的用于高效筛选内源抗虫相关基因的棉花高通量基因编辑突变体库构建》文中研究说明棉花既是一种重要的纤维作物,也是重要的油料作物。由于棉花生育期较长,从播种到收获期间生长发育的各个时期都会受到多种虫害的影响,因此虫害已经成为影响棉花产量和纤维品质的重要因素之一。棉花作为世界上四大转基因作物之一,Bt棉的应用在一定程度上控制了鳞翅目害虫带来的影响,但导致刺吸式等非Bt基因靶标害虫危害的日益加重逐步成为危害棉花的主要害虫,迫使杀虫剂大量喷施,造成多种害虫对农药的抗性随之进化,这不仅增加了棉花种植成本而且破坏生态环境。另一方面随着Bt棉种植区域的扩大和种植时间的不断延长,害虫对Bt棉的抗性也随之增强,其带来的风险也不容忽视。因此目前需要开发新的策略应用于棉花抗虫研究。鉴定棉花内源抗虫基因用于抗虫育种,可以有效补充Bt棉在抗虫应用中的不足。而开发一种高效、可靠的基因功能分析策略是进行棉花功能基因组学研究的重要方向。CRISPR/Cas9系统现已成为一种强大而有效的基因编辑工具。本课题组已经在棉花中成功构建的高效、精确的适用于棉花的CRISPR/Cas9基因组编辑系统使得大规模构建基因编辑突变体材料成为可能。本研究介绍了一种利用CRISPR/Cas9系统的高效筛选棉花内源抗虫相关基因突变体库构建的方法,为棉花功能基因组学和育种方向研究提供了高效的新策略。主要取得了以下研究结果:1.sgRNA设计与载体文库构建本研究从之前的转录组和代谢组学分析中选择了528个差异基因,通过全基因组比对筛选到968个高特异性的sgRNA靶向502个基因。通过混合引物池的方法经一次引物设计、PCR扩增和载体克隆,只需花费构建一个载体的时间就可以快速构建大规模载体文库。2.棉花基因组编辑突变体库创建及目的基因识别利用农杆菌介导的遗传转化和组织培养过程,共获得达5000多个独立的胚性愈伤组织,获得2000多独立的基因编辑T0棉花植株。本研究使用基于条形码的高通量测序技术对T0植株的目的基因进行测序分析。我们对1380个T0植株和576份愈伤组织检测了sgRNAs并鉴定了其序列,共鉴定出555条靶向412个基因的不同sgRNA序列,已检测突变体材料的基因覆盖率达82.07%。3.高效的编辑率和遗传率通过高通量测序,软件分析和人工筛选,共获得369个有效T0代基因组编辑数据。结果显示T0代发生有效编辑比例达97.29%,其中,75.61%材料表现出高效的突变率,编辑率超过80%,编辑类型以短片的插入缺失为主。棉花基因组编辑位点平均遗传力高达84.78%。4.低脱靶风险通过高通量测序对9个潜在的脱靶位点进行了检测,结果中没有发现有任何脱靶效应产生,进一步证实CRISPR/Cas9系统在棉花基因组编辑中发生脱靶概率低,具有很高的特异性。5.高效的表型鉴定率在对200个株系的T1和T2代昆虫生物测定中发现有超过10%的基因突变体材料表现出对虫害的抗性改变。表明针对特定性状（本研究是针对抗虫性状）构建高通量突变体库进行特定性状表型筛选是一种高效的候选基因筛选策略。6.抗虫相关候选基因通过抗虫鉴定发现GhMLP423、GhDML1、GhZAT10等基因的突变材料表现出一致的抗性改变表型。本研究所鉴定得到的候选基因在植物抵抗生物和非生物胁迫方面都发挥了十分重要的作用。通过初步验证发现GhMLP423可能参与棉花抗虫相关JA信号路径传导。本研究利用CRISPR/Cas9系统构建了一个同时使用近千个sgRNA针对植物基因组上数百个基因的混合载体文库,并快速生成一个用于表型筛选的高覆盖度的突变库,并鉴定到一些抗虫相关候选基因。该技术为棉花功能基因组学研究提供了坚实的基础。本研究方法也适用于其他基因组复杂的多倍体植物,对其他作物研究具有一定的参考价值。
李保奇[2]（2020）在《基于田间表型和表型组平台图像指标解析棉花响应干旱的遗传基础》文中认为抗旱性是复杂的数量性状,受到遗传和环境的共同调控。棉花是一种相对耐旱的经济作物,但随着全球气候变暖及我国种植结构的变化,棉花种植区逐渐向西北部干旱地区转移,水资源短缺已成为制约棉花产量和品质的重要因素。开展棉花抗旱机制研究、克隆抗旱基因并应用于棉花育种是解决棉田缺水的有效途径。目前,棉花抗旱基因的发掘进展缓慢,虽有一些调控基因及功能基因的研究报道,但相对于玉米、水稻、小麦等粮食作物的抗旱研究仍有些滞后。由于棉花的生育期长,棉花抗旱性的评价指标一直是研究者们思考和尝试解决的难题。本研究利用陆地棉栽培种组成的自然群体,一方面在新疆大田进行控水处理,获取田间农艺性状、产量和品质等18个性状,另一方面在温室进行干旱处理,通过表型平台采集获取大量数字化表型指标,结合基因组重测序和转录组测序,运用关联分析鉴定棉花抗旱性相关重要位点和重要候选基因。主要研究结果如下:1.大田棉花抗旱性状综合研究及抗旱性状的关联分析本研究利用517份棉花种质组成的自然群体为研究对象,在新疆南北地区进行两年两点的大田控水试验,采用全生育期灌水量为对照组灌水量50%作为水分限制处理,考察了包含农艺性状、纤维品质、产量指标在内的共18个性状,分析了不同性状的广义遗传力和变异系数。根据不同性状与控水处理的关系,描绘了各性状之间的相关性网络。结果表明,群体内不同品种对干旱胁迫的响应差异明显,除铃重和纤维整齐度受水分影响不显着外,其他16个性状在对照和限水处理间表现极显着差异;一方面,50%限水处理使纤维品质降低,表现在纤维长度降低和马克隆值增加;另一个方面,50%限水处理使棉田实收籽棉产量提高8.46%,同时促进相关优良农艺性状的建成,使生育期普遍缩短、株高普遍降低,有利于集中吐絮和合理密植。研究进一步对314个棉花种质进行重测序,结合前期203份种质的重测序结果,我们共获得2564238个SNP用于全基因组关联分析（GWAS）。利用不同表型性状的抗旱系数（DRC）和综合抗旱指数（CIDT）进行关联分析,分别检测到33个和6个与水分胁迫相关的QTL,其中包含两个新的QTL热点区域。结合转录组测序和q RT-PCR,在这两个热点区域内鉴定到6个差异表达基因（DEGs）。本研究不仅为新疆棉田的节水灌溉提供了新思路,也为棉花的抗旱性改良提供了理论基础和候选基因。2.基于表型组学图像指标的关联分析解析棉花苗期响应干旱的遗传基础棉花中开展抗旱鉴定的主要方法是建立旱池、苗期水培实验或盆栽处理,相关指标的采集主要限于株高等人工可采集指标。为了获取抗旱性评价指标,我们利用表型组平台在温室对苗期干旱处理下的200份棉花种质资源进行了动态的RGB图像采集。通过人工测量和无损图像提取进行建模,分析人工采集数据与图像特征数据之间的相关性,共获取了119个基于棉花图像的数字化特征（i-traits）,包括56个形态特征,63个纹理特征。研究验证了株高、株宽、生物量等用于干旱评价的传统指标,并进一步鉴定到了能准确反映棉花苗期响应干旱的多个非人工获得性i-traits:形态特征植株密度（PD）、相对频数（RF）和纹理特征G分量熵值（ET＿G）等。通过综合各棉花形态特征的表现,我们将200个棉花种质的抗旱性分为高抗、中抗、敏感3个等级。本研究表明,表型组学技术突破了人工检测指标少、误差大及通量小的瓶颈,为棉花抗旱性研究提供了优良的技术平台。研究进一步结合基因组重测序数据,通过不同i-traits抗旱系数的GWAS,鉴定到390个与干旱相关的QTL,包括前人在棉花中报道过的抗旱相关基因Gh RD2、Gh NAC4、Gh HAT22和Gh DREB2。结合抗旱种质ZY168和敏旱种质ZY7的转录组数据,我们在一个QTL热点区间内鉴定到此前未报道的两个串联重复基因Gh DNRs（Gh＿A04G0377、Gh＿A04G0378）。病毒介导的基因沉默（VIGS）实验表明,沉默两个基因的表达使棉花植株在干旱处理下表现更抗旱,沉默植株生物量（SA）和株高显着高于对照植株、子叶脱落晚于对照植株、叶片内的可溶性糖含量高于对照植株,证明Gh DNRs是棉花抗旱的负调控因子。本研究结合表型组、基因组和转录组等多组学,不仅为棉花抗旱鉴定提出了新的方法,也为深入解析棉花抗旱机制及棉花抗旱性状的遗传改良提供了强有力的理论和技术支撑。
尹天言[3]（2020）在《烟粉虱与双生病毒互作蛋白的鉴定与功能初探》文中进行了进一步梳理双生病毒是一类重要的植物单链环状DNA病毒。菜豆金黄花叶病毒属病毒是双生病毒科中包含病毒种类最多、危害最大的病毒属,包含440多个独立种,全部由烟粉虱以持久循环的方式传播。近20年来,随着烟粉虱在世界范围内的大暴发,双生病毒病也蔓延成灾。在烟粉虱传播双生病毒的过程中,病毒需克服烟粉虱体内的中肠侵染和逃逸屏障及唾液腺侵染和逃逸屏障后才能在植物间进行传播,在这个过程中,双生病毒外壳蛋白需要与烟粉虱体内的多种蛋白相互作用以突破各个屏障,从而完成传播。然而,介导双生病毒进入烟粉虱细胞的关键蛋白还未明确。本研究从蛋白-蛋白互作的角度初步探索烟粉虱中参与病毒传播的关键因子。1)已筛选出的蛋白在MEAM1烟粉虱获取双生病毒过程中的功能初探从前期实验室对于与番茄黄曲叶病毒（tomato yellow leaf curl virus,TYLCV）外壳蛋白互作的烟粉虱中肠蛋白的质谱分析结果中挑选了在烟粉虱获取病毒过程中可能发挥作用的蛋白Unknown protein（Unpro）和Solute carrier family 2,facilitated glucose transporter member 8（Slc2a8）。通过跨膜结构预测发现这两个蛋白均存在跨膜结构域。沉默相关基因可显着增加烟粉虱对TYLCV的获取,且病毒侵染使Unpro和Slc2a8基因转录水平显着下降,结合蛋白已知功能的报道,我们推测Unpro和Slc2a8可能对病毒获取有抑制作用,猜测TYLCV进入细胞后可能在这两个蛋白的作用下通过囊泡运输至溶酶体,导致病毒的降解,而其具体的机制有待进一步研究。与此同时,在实验室前人的研究中,通过提取未感染病毒烟粉虱和分别感染了TYLCV和Pa LCu CNV的烟粉虱的总蛋白,利用i TRAQ联合LC-MS/MS并进行蛋白组学分析发现,病毒侵染后烟粉虱体内Integrin alpha-PS2（Integrin）和Laminin subunit alpha（Laminin）的蛋白表达量均显着上调,推测Integrin和Laminin可能参与烟粉虱传播双生病毒,因而对其功能进行了初探。通过跨膜结构预测发现这两个蛋白均存在跨膜结构域。沉默Integrin抑制了烟粉虱对TYLCV和Pa LCu CNV的获取,且病毒侵染并不影响Integrin基因转录水平,反而使Laminin基因转录水平显着下调。结合Integrin和Laminin已被报道的功能,推测Integrin有助于烟粉虱获取病毒,但具体机制还有待进一步研究。2)MEAM1烟粉虱中肠和唾液腺中与PaLCuCNV外壳蛋白互作的蛋白筛选验证与功能初探本研究利用分离泛素酵母双杂交系统对MEAM1烟粉虱中肠和唾液腺中与Pa LCu CNV外壳蛋白互作的蛋白进行筛选,共筛选到了10个烟粉虱蛋白。通过全长验证发现protein transport protein Sec61 subunit beta（SEC61β）和eukaryotic translation initiation factor 5A（el F5A）能与Pa LCu CNV外壳蛋白在酵母细胞中发生互作,并通过GST-pull down的方法验证了SEC61β与Pa LCu CNV外壳蛋白在体外条件下也存在互作。通过跨膜结构预测发现SEC61β存在跨膜结构域。沉默SEC61β抑制烟粉虱对Pa LCu CNV的获取,且病毒侵染使SEC61β的基因转录水平显着下调,结合该蛋白已被报道的功能,我们推测SEC61β可能协助烟粉虱对病毒的获取,具体的机制还有待研究。综上所述,双生病毒在烟粉虱体内的运输路径比较复杂,我们初步鉴定并明确了几种蛋白在烟粉虱获取双生病毒过程中的作用。其中,Integrin、SEC61β能够促进烟粉虱对病毒的获取,Unpro、Sl2ca8能够抑制烟粉虱对病毒的获取,Laminin在烟粉虱获取病毒过程中的作用尚未明确。这些结果对我们理解双生病毒与烟粉虱间的复杂互作关系提供一定的参考价值,为深入解析烟粉虱传播双生病毒的机制提供了研究基础。
孙旭静[4]（2019）在《陆地棉背景达尔文氏棉A亚组染色体片段导入系农艺性状QTL定位》文中进行了进一步梳理棉花是世界上重要的天然纤维作物,广泛种植于世界各地。陆地棉产量高、适应性广,生产了世界上95%的原棉,现有陆地棉品种大多纤维偏粗。异源四倍体野生种达尔文氏棉有耐盐碱、耐贫瘠、耐旱、纤维细度好等优点。构建陆地棉遗传背景的达尔文氏棉染色体片段导入系可以挖掘达尔文氏棉基因组中的产量和纤维品质有利基因,拓宽陆地棉遗传背景,培育综合性状优良的陆地棉栽培种。本研究利用陆地棉丰产品种中35作为轮回亲本,达尔文氏棉5-7为供体亲本构建BC3F2染色体片段导入系。利用实验室前期构建的陆地棉和达尔文氏棉种间遗传连锁图谱上均匀分布的SSR标记,对群体内的553个BC3F2染色体片段代换单株进行标记基因型检测。以BC3F2单株和BC3F2:3家系的产量和纤维品质数据进行QTL定位,主要结果如下:1.达尔文氏棉染色体片段导入系构建及基因型检测本研究挑选均匀分布于陆地棉和达尔文氏棉种间遗传连锁图谱的190个SSR标记,检测553个BC3F2群体单株的基因型,发现有3株没有导入达尔文氏棉片段,因此构建了包含550个单株的染色体片段导入系群体。2.A亚组染色体片段导入系各单株导入片段550个单株的平均遗传背景恢复率为91.8%,最大遗传背景恢复率高达99.8%,最小值仅为72%;导入达尔文氏棉片段长度在4.09-568.23cM之间,渗入率在0.2-27.8%之间,平均导入片段长度为163.41cM,占检测长度的8.00%;其中导入达尔文氏棉纯合片段的平均长度为39.61cM,平均渗入率为1.94%,导入长度最大为212.576cM,最小片段长度为0cM,导入片段的渗入率为0-10.4%;导入杂合片段平均长度为123.80cM,平均导入率为6.01%,导入杂合片段的长度最大为523.62cM,最小值为0cM,杂合片段导入率在0-25.6%之间。导入片段数目在1-35个之间。3.A亚组染色体片段导入系各条染色体导入片段达尔文氏棉导入系A亚组13条染色体平均遗传背景恢复率为92.09%,第11条染色体的遗传背景恢复率最高,达95.31%,第9条染色体的恢复率最低为88.07%;总导入片段平均长度、导入纯合片段平均长度和导入杂合片段平均长度最长分别是第5染色体、第1染色体和第5染色体,分别为19.26cM、4.66 cM和14.63cM,总导入片段平均长度、导入纯合片段平均长度和导入杂合片段平均长度最短均为第4染色体,分别为5.13cM、0.79cM和4.24cM。4.棉花产量和纤维品质QTL定位本研究共检测到65个产量和纤维品质性状QTL。其中有9个QTL（qLP1.3、qLP2.1、qLP5.1、qLP5.2、qLP7.1、qLP9.1、qLP9.2、qLP13.1、qFS12.1）在两个环境中均检测到。产量性状QTL 39个,解释表型变异1.7-4.8%。其中,籽指QTL有7个,解释表型变异1.9-3.5%;铃重QTL有12个,解释表型变异1.7-4.7%;衣分QTL有20个,解释表型变异1.8-4.8%;纤维品质QTL有26个,解释表型变异1.9-6.7%。其中,纤维长度QTL有4个,解释表型变异2.3-6.4%;整齐度QTL有4个,解释表型变异2-4.3%;纤维强度QTL有4个,解释表型变异2.1-5.4%;马克隆值QTL有6个,解释表型变异2.3-5.8%;纤维伸长率QTL有8个,解释表型变异2.2-6.7%;25个QTL的有利等位基因来源于达尔文氏棉,40个QTL的有利等位基因来源于中棉所35。
胡广[5]（2018）在《miR319-MYB33-SPL9-DFR途径参与陆地棉对大丽轮枝菌的抗性响应》文中认为MicroRNAs（miRNAs）是一类非编码小分子RNA,在植物响应病原菌入侵过程中起着重要作用。miR319作为发现最早的植物miRNA之一,其功能研究集中于植物叶和花的生长发育,在植物抗病响应机制方面的研究鲜见报道。本研究以陆地棉新的miRNA（ghr-miR319）为试验对象,其在陆地棉响应大丽轮枝菌入侵过程中表达水平上调,利用分子生物学和生物化学等方法研究其在陆地棉抗病响应过程中的分子机制。首先为鉴定棉花miRNA表达丰度建立了一套检测技术,通过分析棉花3个miRNA的表达谱来评析该技术体系的特性,优化了Stem-loop RT-PCR方法。研究设计了茎环特异性反转录、正向和通用反向3条引物,并梯度稀释cDNA和RNA,分析这些引物的扩增效率和检测灵敏度。结果表明,优化的Stem-loop RT-PCR方法具有较高的扩增效率和检测灵敏度,miR156和miR159扩增效率分别为102%和103.6%;总RNA检测灵敏度差异较大,分别为20 ng和2 pg。同时,成功地分析了miR156、miR159和miR5658在棉花根茎叶中的表达量。棉花miRNA表达丰度检测技术的建立为其miRNA相关研究提供了技术保证。接着,在棉花sRNA（small RNA）转录组学和降解组学数据库数据中鉴定了ghr-miR319和其靶基因GhMYB33,通过生物信息方法分析了两者相互作用的靶点和剪切位点。并利用Stem-loop RT-PCR和RT-qPCR方法分别检测了ghr-miR319及其靶基因GhMYB33在接种大丽轮枝菌第10天的相对表达水平,结果表明,它们分别为上调和下调表达,呈相反趋势。然后,利用VIGS技术分析ghr-miR319及其靶基因GhMYB33的抗性功能,培育了过表达和沉默ghr-miR319棉花植株,同时,也培育了沉默GhMYB33和GhSPL9基因植株;在对这些过表达和沉默植株接种大丽轮枝菌V991处理,分析它们的抗病性和抗病机制。结果表明,过表达ghr-miR319以及沉默GhMYB33和GhSPL9基因会促进陆地棉花青素积累,并且可以提高陆地棉对大丽轮枝菌的抗性;然而,沉默ghr-miR319则会抑制陆地棉对大丽轮枝菌的抗性,且陆地棉的花青素含量下降;进而,明确了植株的花青素含量与陆地棉抗病性的相关性。总之,这些研究结果表明miR319-MYB33-SPL9-DFR途径参与棉花对大丽轮枝菌的抗性响应。本研究工作为全面解析棉花miRNA抗黄萎病菌的分子机制和揭示植物先天免疫机理积累了科学数据;同时,也为从miRNA角度探讨棉花黄萎病可能的防治措施提供新的思路和途径。
李海薇[6]（2018）在《海岛棉品种（系）对枯萎病抗性比较及拮抗细菌生防评价》文中指出由尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）引起的棉花枯萎病真菌性病害,是棉花种植期最常见的毁灭性病害。本研究选取20个对枯萎病抗性不同的海岛棉品种和20份06-146与新海14号杂交群体后代材料,采用人工接菌方式进行抗性鉴定和产量性状分析;采集棉花枯萎病病秆,分离筛选强致病菌株,以杂交群体母本抗黄萎病耐枯萎病品种新海14号为靶标材料,进行室内药剂毒力测定;同时,采集抗病棉花材料根围土壤,获得生防效果较好的拮抗细菌,为棉花抗病育种工作和病害防治提供理论基础和科学依据。结果表明:1.选取20个海岛棉品种及20份06-146与新海14号杂交群体后代材料,进行室内、田间抗性鉴定和产量性状分析。海岛棉抗病品种占比35%,包括海岛棉品种06-146、新海13号、新海20号、新海21号、新海29号、N9247和C06015;06-146与新海14号杂交群体后代抗病材料为65%,包括10702、10719、10724、10727、10749、10765、10787、10862、10876、10880、10889、10892和10902。通过产量性状分析可知,20个海岛棉品种相对病情指数与单株结铃数呈极显着负相关关系,相关系数为-0.672。20份06-146与新海14号杂交群体后代材料相对病情指数与单株结铃数呈极显着负相关关系,相关系数为-0.599;与单铃籽数和单铃总重的相关系数为-0.267和-0.265,呈现出显着负相关关系。2.通过分离纯化棉花枯萎病病原菌菌株,选取杀菌剂1000亿/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂、8%宁南霉素水剂、0.3%四霉素水剂和80%代森锰锌可湿性粉剂,分别对编号为DD64、DD89、DD11和DD22的强致病菌株进行室内药剂毒力测定。测定新疆北部地区分离出的DD64和DD89菌株,1000亿/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂抑菌率最高,分别为96.47%和95.29%,0.3%四霉素水剂次之。测定新疆南部地区分离出的DD11和DD22菌株,0.3%四霉素水剂抑菌效果最好,分别为97.91%和99.35%,其次是1000亿/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂。DD64和DD89经毒力测定,8%宁南霉素水剂毒力最强,EC50值为0.044 mg/L和0.046 mg/L。在生产上,0.3%四霉素水剂建议在病害发生初期使用以防止病害的扩展和蔓延,1000亿/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂和8%宁南霉素水剂可作为轮换药剂对该类病害进行有效防治。3.采用平板对峙法,以棉花枯萎病尖孢镰刀菌为靶标菌,从抗病材料土壤中分离到的120株细菌菌株中筛选拮抗菌株,促芽试验和盆栽试验显示,编号KX-33拮抗细菌能明显缩短出芽时间,促进棉苗生长,芽长、根长和芽鲜重分别为8.53 cm、5.40 cm和1.72 g。对病原菌DD64、DD89、DD11和DD22菌株防效分别为75.32%、72.77%、69.48%和68.81%,均显着高于其它药剂处理（P<0.05）。该拮抗菌株在盐碱环境下可正常生长,具一定耐盐碱性。结合菌株形态及生理生化特性、16S r DNA和序列分析显示,拮抗细菌菌株KX-33镜检为革兰氏阳性菌,呈杆状,有芽孢,与Bacillus pumilus（FJ763643.1）同源性最高。
刘玉姣[7]（2017）在《转iaaM基因棉花种质纤维起始发育期的miRNA表达谱分析及其靶基因鉴定》文中指出棉花（Gossypium hirsutum）是重要的纤维作物,棉纤维起始发育源于胚珠表皮细胞向外突起,而棉花纤维起始发育时期对棉纤维的产量和品质起到重要的作用。外源施加生长素能够诱导离体胚珠纤维的产生,说明生长素在棉纤维发育中起到了重要的作用。西南大学将IAA合成途径关键基因iaaM（色氨酸单加氧酶）基因导入冀棉-14,在种皮特异启动子FBP7控制下,iaaM基因在棉花中成功表达,内源IAA上调并显着地增加了种皮单位面积的纤维细胞。本研究以转iaaM基因棉花种质IF11为材料,探究棉纤维起始分化发育阶段miRNAs的表达,以期更深入地探明IAA调控纤维起始分化发育的机理,并为棉花纤维产量与品质的分子改良提供依据。本研究构建了 IF11和IF11（无）两个种质开花前一天（-1DPA）、开花后一天（+1DPA）和开花后三天（+3DPA）共18个小RNA文库（3次生物学重复）,即 CK1（-1-+3DPA）、CK2（-1-+3DPA）、CK3（-1-+3DPA）、IAA1（-1-+3DPA）、IAA2（-1-+3DPA）和IAA3（-1-+3DPA）,对每个文库进行高通量测序（high throughput deep sequencing）。通过生物信息学的方法对sRNA进行分离和鉴定,识别棉纤维发育相关的miRNAs。研究获得的主要结果有:1.以公布的南京农业大学陆地棉基因组序列为参考基因组,共预测到226个miRNAs,其中包括57个已知的miRNAs（属于51个家族）和169个新的miRNAs。2.两个种质间差异显着表达的miRNAs皆为新的miRNA,其中开花前一天有 3 个 miRNAs（GhmiR-novel32,GhmiR-novel155,GhmiR-novel206）上调表达和 3 个 miRNAs（GhmiR-novel 52,GhmiR-novel-294,GhmiR-novel209）下调表达;开花后一天有 5 个 miRNAs（GhmiR-novel<sub>1132,GhmiR-novel<sub>180,GhmiR-novel204,GhmiR-novel 229,GhmiR-novel308）上调表达和 2 个miRNAs（GhmiR-novel119,GhmiR-novel256）下调表达;开花后三天有 1 个miRNAs（GhmiR-novel265）下调表达。3.通过生物信息学分析,发现GhmiR-novel294的预测靶基因为GhA05G1236 和 Gh D05G3838,基因注释皆为 TCP2,GhmiR-novel256 的靶基因为GhA10G0203,功能注释与泛素介导的蛋白质水解相关,GhmiR-novel52的预测靶基因为GhA05G3434、GhD04G0157,功能注释为MYB33,这些靶基因经相关研究证实与纤维发育相关,因此推测GhmiR-novel294、GhmiR-novel256和GhmiR-novel52可能通过调控其靶基因在纤维发育中起作用。研究获得了大量新的miRNA,丰富了棉花核酸数据库,为今后棉纤维发育研究与分子育种奠定了基础。
刘念[8]（2016）在《海岛棉microRNA及其靶标的鉴定和功能分析》文中指出microRNA（miRNA）作为一类长度在21-24 nucleotide（nt）的非编码RNA,在植物的生长发育,形态建成,激素信号转导,逆境胁迫响应方面起着重要的作用。目前,miRNA在棉花领域的研究不多,特别是在棉花纤维发育的功能研究几乎没有,而棉花纤维这种单细胞类型是研究细胞伸长和细胞壁合成的良好模型。故我们利用小RNA测序和降解组测序的手段,鉴定了一批在棉花纤维中表达的miRNAs和大量的miRNA靶标基因,并且我们利用转基因手段对mi RNA157及其靶标在纤维发育和调控花器官大小的功能做了一定的阐述。具体结果简述如下:1.纤维发育相关microRNAs的挖掘与鉴定我们构建了七个纤维发育文库,覆盖纤维的起始,伸长和次生壁加厚期。七个文库一共检测到了78万到209万条序列,注释到47个保守miRNA家族,同时预测了34条保守miRNA前体。此外,还鉴定了七个新的候选miRNAs。这些小RNA的长度主要集中在21nt到24nt之间,miRNA的5’首位碱基更偏好为尿嘧啶。聚类分析和Northern blot的结果显示大部分的mi RNAs在纤维发育的不同时期变化非常剧烈。转基因和组织化学染色的方法进一步证明miR156/157,miR165/166和mi R172在纤维和胚珠中具有生物活性。2.miRNA靶标基因调控纤维发育网络的挖掘和鉴定利用降解组测序的手段,共有140个保守miRNAs靶标和38个新的候选miRNAs靶标被检测到。这些保守靶标中有很多是转录因子,还有一些跟生长素信号,钙离子信号,双氧水信号相关。另外还发现许多靶标和细胞壁、细胞骨架相关或者是能量代谢相关。RLM-RACE技术也证实了microRNA的确能够诱导靶标基因转录本被剪切降解,证明降解组测序的结果是可靠的。我们挑选了七个感兴趣的靶标,分析了靶标和对应miRNAs表达模式的负相关性,据此推测Gb-miR156/157,390,399可能通过参与到信号转导、转录调控来影响纤维发育,而Gb-miR159,164,167和nmiR3可能直接调控细胞骨架的合成、细胞壁的合成与修饰,以及能量代谢来调控纤维的发育。3.miRNA157可能正调控纤维伸长分析野生种和驯化种棉花差异表达基因,发现miR157的靶标SBP转录因子表达水平在棉花野生种纤维细胞整体上要高于驯化种,而Gb-miR157相反地在驯化种中表达量更高。通过转基因手段,降低miR157在纤维细胞的活性,可以提高miR157靶标SBP转录因子的表达量,而转基因材料的纤维长度则变短。由此推测,SBP转录因子可能抑制纤维细胞的发育。推测棉花驯化过程中,通过提高miR157的表达量来间接抑制SBP转录因子,最终达到促进纤维伸长的目的。4.miRNA157参与调控花器官的发育Real-time PCR和Northern blot结果显示miR157的表达量的确在超量表达miRNA157转基因材料中显着提高了,但是转基因材料的纤维长度并没有如预期的变长。转基因材料植株营养生长特别旺盛,叶枝明显增多,而花器官相反却明显变小,子房内胚珠数目明显减少,导致最终棉桃成熟的种子数目减少,收获的单铃籽棉产量显着降低。利用RLM-RACE技术技术在棉花花蕾中鉴定了miR157的靶标基因,它们是5个SBP-like（SPL）转录因子。利用RNA sequencing技术,我们也发现这5个SPLs基因的表达量在超量表达植株里面下调表达,进一步证明miRNA157可能通过负调控这5个SPLs基因来影响花器官的发育。另外,RNA sequencing测序的结果显示和花器官发育相关的两个MADS-box基因,AtAGL6和SITDR8的同源基因也下调表达。把检测生长素信号的DR5::GUS报告基因通过杂交的方式导入到超量表达miR157转基因材料后,发现转基因材料的生长素信号和阴性对照相比明显减弱。这些结果说明,miRNA157可能通过靶标基因SPLs激活MADS-box基因和生长素信号的转导来调控花器官的大小和胚珠的形成。
Wajad Nazeer[9]（2015）在《利用种间杂交技术向陆地棉转育两个二倍体棉的卷叶病抗性特性研究》文中研究说明在世界上的近100个国家中,棉花是主要的经济作物。然而,自上世纪90年代初,棉花卷叶病（CLCuD）成为限制巴基斯坦和印度棉花产量的最主要因素。这种疾病已蔓延到巴基斯坦和印度整个植棉区,最近中国南方也有相关报道,尤其是自2001年以来,生产上一直缺乏高抗的棉花品种,严重影响棉花的产量和品质。野生棉尤其是亚洲棉和司笃克氏棉具有丰富的卷叶病抗性基因资源以及高强纤维等特性,是棉花育种的重要基因来源,但由于栽培的陆地棉与这些棉种间存在种间杂交障碍和种间杂种的高度不育性等,严重制约了这些基因资源的有效利用,有关利用分子标记来转育二倍体野生棉的CLCuD抗性等相关研究报道也鲜有报道。本研究拟利用四倍体栽培种陆地棉分别与两个二倍体棉种（包括A染色体组的亚洲棉和E染色体组的司笃克氏棉）杂交,通过克服种间杂交的不亲和性和杂种的不育性,与栽培品种陆地棉进行回交,创造育种中间材料,并对其杂交后代进行CLCuD抗性评价鉴定,并利用SSR分子标记进行与抗病性状连锁的分子标记发掘,为今后进行抗病分子标记辅助选择奠定基础。1.将二倍体亚洲棉的抗棉花卷叶病性状向陆地棉种转育研究（1）陆地棉与二倍体亚洲棉种间回交群体的培育陆地棉与二倍体亚洲棉种间回交群体的培育包括两种方式:一是以四倍体陆地棉CRSM-38（2n=4x=52）为母本,直接与二倍体亚洲棉 15-Mollisoni（2n=2x=26）杂交,F1染色体加倍得到六倍体,再与四倍体陆地棉回交（六倍体途径）,组合名为[G.hirsutum× G.arboreum]；另一种方式是首先将二倍体亚洲棉染色体加倍,获得人工同源四倍体的亚洲棉（2n=4x=52）（四倍体途径）,以该同源四倍体为母本,与四倍体棉杂交,再与四倍体棉回交,组合名为[2(G.arboreum× G.hirsutum]。为了克服种间杂交的不亲和性,采用植物激素保铃和大量杂交的方法来获得杂交种子和回交后代。在六倍体途径中,培育获得BC1群体是最具挑战性的,共进行了 12890多朵花的杂交才取得了 57粒回交种子,其次是BC2和BC3,分别进行了 1295和980多朵花的杂交。与六倍体途径相比较,四倍体途径培育获得BC1群体则更为艰难。两种途径,随着回交世代的提高,染色体的配对渐趋正常,结铃性提高,种子发芽率上升。后代表型中出现了与二倍体亚洲棉表型相似的性状,表明陆地棉与亚洲棉杂交成功,可以进行回交群体的选择。（2）陆地棉与亚洲棉种间杂种回交群体的CLCuD抗性评价。通过对[2(G.arboeum× G.hirsutum]和[G.hirsutum×G.arboreum]的的 F1 以及BC1～BC群体的CLCuD抗性评价,结果发现,F1均表现高抗,但随着回交世代的增加,其抗性下降,发病指数（DI）提高,具体表现为:群体BC1为1.3～1.6%，BC2为1.8～4.0%,BC3为4.2～7.0%,但远低于陆地棉亲本CIM-496,其CLCuD发病指数为96%。通过嫁接法鉴定,结果表明BC1-BC3群体均表现高抗。杂交组合[2（G.arboreum）× G.hirsutum]复病的潜伏期（天）较杂交组合 G.hirsutum ×G.arboreum 长。结果表明,可以通过种间杂交将二倍体亚洲棉的CLCuD抗性向四倍体陆地棉成功渐渗。2.陆地棉中来自亚洲棉的性状与SSR标记的关联分析（1）利用SSR标记对源于亚洲棉的渐渗片段的鉴定利用GGTV2.0工具来分析亚洲棉染色体片段在陆地棉中的渐渗情况。基因型图形分析结果表明,渐渗系的基因组组成中,受体的基因组恢复率达到平均为76.2%,供体的基因组组成为平均为4.3%,其余为杂合片段。来自供体第9号染色体的片段比例最高,为24.4%,受体仅为55.5%。渐渗系2、8、10和60的基因组中,有超过10%的基因组来自供体,而渐渗系1、2、8、10则表现出良好的CLCuD抗性,以及较理想的农艺性状和纤维品质。这些渐渗材料对于分子标记辅助选择很有益处。这些渐渗片段的鉴定将为今后开展育种研究、基因定位以及棉花改良奠定基础。（2）农艺性状与分子标记之间的关联分析利用单标记分析法开展了性状与标记的关联分析。结果发现有6个SSR位点与棉花卷叶病抗性存在极显着关联（0.1%水平）;20个SSR位点与纤维品质关联,27个SSR位点与农艺性状极显着关联（0.01%）。这些相关位点数多于所发现的QTL数,表明可能存在假的关联。（3）棉花卷叶病抗性QTL利用IciMapping软件对BC4回交群体进行了 CLCuD抗性QTL分析,共发现5个QTL,其中2个为发病指数QTL,另3个为发病率QTL。这5个QTLs可解释的表型变异为7.6-14.6%,其LOD值为2.0-2.9。与它们关联的分子标记分别为BNL3347-140,NAU3695-280,dc40134-370,NAU3317-225 和 JESPR290-125,与单标记分析结果基本一致。（4）农艺性状QTLs利用QTL Ici Mapping软件对BC4群体进行了农艺性状QTL的分析,共发现26个QTL,涉及到12个性状,分别为:5个QTLs为SCW,FBpP和LM各3个,LpB,BS,SpL,SpB 和 SM 各 2 个,MPpP，BpP,SpB，SCpS 和 SCpL 各 1 个。解释的表型变异解释为3.8-29.0%。与QTL相关联的分子标记共13个,它们分别是:BNL3347-140,Gh369-145,Gh594-100,JESPR274-105,NAU1014-185,NAU1246-200,NAU2108-350,NAU2508-150,NAU2887-450,NAU3022-235,NAU3401-400,NAU462-650,NAU6993-130。其中,有5个标记是重迭的,对标记辅助选择有用。如:第5染色体的 BNL3347-140 和 Gh594-100 标记,分别与 LpB 和 BS、SpL,SpB，SCW,LM和SM性状相关联;类似的,标记NAU462-650与MPpP，FBpP,LpB和BS相关联,NAU2508-150 与 SpB,和 SCpL 相关联,NAU3401-400 和 FBpP,SpL,SCW,LM,SM相关联。（5）纤维性状QTL共发现6个纤维性状的QTL 15个。分别为4个衣分QTL,纤维长度整齐度和反射率各3个QTL,纤维强度和短纤维指数各2个,解释的表型变异为4.0-19.6%。涉及的分子标记有 11 个,分别为 NAU2494-215,Gh594-100,NAU2002-600,JESPR290-125,NAU2686-1250,NAU3695-280,NAU1278-270,NAU3401-400,cgr6812-150,BNL1438-120,BNL3479-220。3.利用种间杂交将司笃克氏棉的抗CLCuD性和高强纤维向陆地棉转育（1）陆地棉和司笃克氏棉种间杂交的F1六倍体的培育。利用人工去雄授粉法,在田间自然条件下开展陆地棉与司笃克氏棉的种间杂交,采用植物激素保铃,共做了 438朵花,得铃15个,仅获得28个F1种子。获得的种子利用0.03%的秋水仙素处理6个小时,种子发芽率为42.9%,获得12个苗,其中仅有4株成株,为六倍体（2n=6x=78）,染色体加倍比例为33.3%。对表型（茎、叶、花、铃）为双亲中间型的F1植株进行花粉活性分析,发现51.1%花粉存在活性。花粉母细胞中期Ⅰ染色体配对行为观察表明,染色体数均为78条,其中70.3%的细胞染色体配对成39个二价体。F1花粉的活性较低,导致其F,自交结铃性较低。（2）陆地棉与司笃克氏棉种间杂种双二倍体F1的卷叶病抗性和纤维强度评价通过自然发病和嫁接接种两种方法对六倍体F1杂种进行CLCuD抗性鉴定。结果表明,在野外条件下,所有的4株原六倍体植株均没有表现病症,同时,所有的嫁接的17株也没有出现病症,显示出很强的抗病性。通过对六倍体F1的纤维特性进行了测定分析,结果表明,与推广品种MNH-886相比,F1六倍体具有更大的纤维强度（54.4 g/tex）、纤维伸长（6.7%）,分别增加了34.9%和23.9%,但纤维细度较粗（5.6μg/inch）,增加了 3.6%。
陈煜[10]（2014）在《棉属（Gossypium）种间杂交研究及陆地棉（G. hirsutum）-澳洲棉（G. australe）异附加系的培育》文中认为棉花是世界上重要的经济作物,棉纤维是最主要的天然纤维,为纺织工业提供重要原材料。随着现代生活水平的不断提高和纺织工业的快速发展,人们对棉纤维品质、产量和抗逆性等提出了越来越高的要求。但陆地棉品种遗传基础非常狭窄,育种手段主要依赖于品种间杂交,难以培育出突破性品种,阻碍了育种的进一步发展。棉属（Gossypium）由5个异源四倍体和45个二倍体组成,广泛分布于全球热带及亚热带地区。野生种蕴藏有抗病虫和耐受不良环境等潜在利用价值的有益特性。为了进一步拓宽陆地棉的遗传基因基础,丰富棉花育种的基因资源,通过远缘杂交把野生种有利的基因向栽培种渐渗,创造具有野生种优异基因的陆地棉新种质,为棉花育种提供丰富的种质资源,具有重要意义。澳洲棉（G. australe Mueller）,是原产于澳大利亚的二倍体野生种（2n=2x=26, G2G2）,具有抗黄萎病,抗螨类,抗旱,增加衣分率,种子无腺体植株有腺体等许多优良性状。培育一套陆地棉-澳洲棉染色体异附加系,可以全面、系统挖掘和研究澳洲棉优异基因资源,同时,将澳洲棉的抗黄萎病等优异基因向陆地棉渐渗,为棉花育种提供优异新种质。主要研究结果如下：1.种间杂种F1的获得：采用人工去雄、重复授粉杂交方法,配制了杂交组合,陆地棉×亚洲棉、陆地棉×瑟伯氏棉、陆地棉×克劳茨基棉、陆地棉×旱地棉、陆地棉×雷蒙德氏棉、陆地棉×司笃克氏棉、陆地棉×索马里棉、陆地棉×长萼棉、陆地棉×比克氏棉、陆地棉×澳洲棉,均获得有胚种子,结铃率分别为10.77%、2.13%、36.51%、72.00%、74.60%、0.73%、0.40%、2.85%、1.34%、3.13%；杂交组合亚洲棉×异常棉、亚洲棉×瑟伯氏棉、亚洲棉×戴维逊氏棉、亚洲棉×克劳茨基棉、亚洲棉×旱地棉、亚洲棉×雷蒙德氏棉、亚洲棉×司笃克氏棉、亚洲棉×索马里棉、亚洲棉×长萼棉、亚洲棉×比克氏棉、亚洲棉×澳洲棉也均获得有胚种子,结铃率分别为74.60%、5.00%、48.00%、43.40%、5.41%、40.98%、91.81%、38.06%、7.45%、41.18%、19.57%。通过表型初步鉴定,获得了陆地棉×旱地棉、陆地棉×雷蒙德氏棉、陆地棉×长萼棉、亚洲棉×异常棉、亚洲棉×瑟伯氏棉、亚洲棉×旱地棉、亚洲棉×雷蒙德氏棉、亚洲棉×司笃克氏棉、亚洲棉×索马里棉9个组合的真杂种植株,为进一步研究棉属不同种的亲缘关系提供了基础材料。2.种间杂种F1的染色体加倍：①将收到的种子用0.75%的秋水仙素+5%二甲基亚砜（DMSO）溶液处理已萌发的种子。结果表明,组合陆地棉×雷蒙德氏棉、陆地棉×特纳氏棉杂种F1的种子经处理后植株成活率分别为33.33%和40%,植株染色体加倍比例为50%和33.33%。②对非洲草棉×澳洲棉杂种F1植株用0.1%的秋水仙素+5%二甲基亚砜（DMSO）溶液处理24h,20天后统计了该组合的诱导成活率为33.33%,开花、结铃后利用形态学和生理测定,获得了染色体加倍的枝条1个,并得到了后代种子。3.杂种五倍体获得：以陆地棉-异常棉和陆地棉-雷蒙德氏棉六倍体为母本,分别与陆地棉进行杂交,分别获得2株和1株五倍体,利用形态学标记、SSR分子标记和GISH技术对获得的五倍体进行了确定。4.陆地棉-澳洲棉染色体异附加系的培育利用形态学、分子标记（SSR）和基因组原位杂交（GISH）技术培育了一套陆地棉-澳洲棉外源异附加系：首先根据本实验室构建的异源四倍体棉的分子遗传图谱,每隔10cM选择一个标记,进行陆地棉与澳洲棉多态性筛选,获得了一套澳洲棉特异的SSR分子标记745个。以陆地棉-澳洲棉五倍体为母本,陆地棉遗传标准系TM-1为父本,进行连续回交,对回交后代的种子进行GISH分析,筛选出单体异附加系进行进一步鉴定；每隔5-10 cM选择其中均匀分布在澳洲棉13条染色体上的175个SSR标记对单体异附加系植株进行分子标记鉴定,从而确定每个单体异附加系的身份。经过GISH鉴定和分子标记鉴定,共分离得到了12个单体异附加系,分别为MAAL-1Ga、 MAAL-2Ga、MAAL-3Ga、MAAL-4G2、MAAL-5Ga、MAAL-6Ga、MAAL-8Ga、 MAAL-9Ga、MAAL-10Ga、MAAL-11Ga、MAAL-12Ga、MAAL-13Ga和一个TMAAL-7Ga、8Ga、10Ga三体异附加系。同时,对分离得到的单体异附加系进行形态学比较,结果表明,MAAL-4G3种子较大,MAAL-5Ga则纤维明显变短,MAAL-6G3为棕色纤维,MAAL-8G3则叶色特深,含有7Ga染色体的为红色花瓣基因,MAAL-11Ga则表现高度不育基因。陆地棉-澳洲棉单体异附加系n+l雌、雄配子的传递率：以陆地棉-澳洲棉单体异附加系为父、母本与四倍体陆地棉TM-1进行正反交,然后利用SSR分子标记来鉴定其杂种后代的外源染色体传递。结果表明,陆地棉-澳洲棉单体异附加系n+l雌配子的传递率在14.75%～95.12%,其中,以MAAL-10G3的传递率最高,MAAL-5G3最低；n+l雄配子的传递率很低,只检测到MAAL-6G3和MAAL-10Ga通过了雄配子的传递,传递率分别为14.81%和5.7%。陆地棉-澳洲棉单体异附加系n+l雌、雄配子的传递为我们进一步分离二体异附加系带来了希望。单体异附加系MAAL-10Ga的高频传递：在异附加系回交后代中,利用分子标记鉴定发现,单体异附加系MAAL-10Ga在不同世代传递率不同且很高,即为高频传递的现象,且平均传递率>90%。前人研究发现,目前这种高频传递的机制解释为无融合生殖和杀配子染色体,为了解释这种现象,我们以MAAL-10Ga为母本,具有显性标记的无腺体的海1为父本进行杂交,观察F1种子的腺体,结果显示,F1种子无腺体,说明F1进行了精卵融合的有性生殖而非无融合生殖形成种子。排除了这种高频传递的无融合生殖现象,所以初步判定MAAL-10G3具有杀配子染色体功能,有待进一步研究。单体异附加系抗黄萎病的鉴定：利用V991生理小种对亲本、陆地棉-澳洲棉双二倍体、部分陆地棉-澳洲棉单体异附加系及感病和抗病对照进行黄萎病抗性鉴定。结果表明,三个陆地棉-澳洲棉异附加系MAAL-1Ga、MAAL-4Ga、MAAL-5Ga的相对抗性指数分别为31.11、16.75和55.04,即耐病、抗病和感病,为棉花抗黄萎病育种提供新的可能抗源。
二、Identification of DNA Markers for Cotton Leaf Curl Disease (CLCD) in Cotton (Gossypium hirsutum L. )（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Identification of DNA Markers for Cotton Leaf Curl Disease (CLCD) in Cotton (Gossypium hirsutum L. )（论文提纲范文）
（1）CRISPR/Cas9介导的用于高效筛选内源抗虫相关基因的棉花高通量基因编辑突变体库构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章:文献综述 |
| 1.1 中国棉花生产概况 |
| 1.2 棉花基因组研究进展 |
| 1.3 棉花功能基因组学研究 |
| 1.4 植物应对草食性昆虫的内源防御系统 |
| 1.5 棉花抗虫育种研究进展 |
| 1.5.1 形态抗虫育种阶段 |
| 1.5.2 生化抗虫育种阶段 |
| 1.5.3 棉花抗虫基因工程育种阶段 |
| 1.5.3.1 Bt毒蛋白的发现以及作用机理 |
| 1.5.3.2 Bt转基因棉花研究进展 |
| 1.6 植物突变体创建方法 |
| 1.6.1 自发变异 |
| 1.6.2 物理诱变 |
| 1.6.3 化学诱变 |
| 1.6.4 分子生物学方法 |
| 1.7 基因编辑技术研究进展 |
| 1.7.1 ZFN基因编辑系统 |
| 1.7.2 TALEN基因编辑系统 |
| 1.7.3 CRISPR基因组编辑系统 |
| 1.7.3.1 CRISPR/Cas9 技术原理 |
| 1.7.3.2 CRISPR/Cas9 脱靶效应研究 |
| 1.8 CRISPR/Cas9 系统在作物育种中的应用 |
| 1.8.1 高产育种研究 |
| 1.8.2 品质育种研究 |
| 1.8.3 抗性育种研究 |
| 1.8.4 不育系研究 |
| 1.9 基因编辑检测方法 |
| 1.10 CRISPR/Cas9 技术的局限性 |
| 1.11 植物变体库研究进展 |
| 1.11.1 理化诱变突变体库 |
| 1.11.2 插入突变体库 |
| 1.11.3 基因编辑突变体库 |
| 1.12 本研究的目的意义与技术路线 |
| 1.12.1 本研究的目的与意义 |
| 1.12.2 本研究的技术路线 |
| 第二章:实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料,载体和菌株 |
| 2.1.2 基因编辑载体 |
| 2.1.3 供试的昆虫材料 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 sgRNA及引物设计 |
| 2.2.2 GO靶基因功能富集分析 |
| 2.2.3 混合基因组编辑载体文库构建 |
| 2.2.3.1 载体充分酶切控制空载率 |
| 2.2.3.2 混合载体文库构建 |
| 2.2.4 棉花DNA提取 |
| 2.2.5 棉花遗传转化 |
| 2.2.6 Barcode设计和高通量测序检测分析基因编辑目标序列 |
| 2.2.7 基因组编辑检测 |
| 2.2.8 抗虫鉴定 |
| 2.2.8.1 蚜虫及棉铃虫繁殖培养 |
| 2.2.8.2 武汉温室蚜虫抗性表型筛选 |
| 2.2.8.3 海南温室咀嚼式害虫极端表型筛选 |
| 2.2.8.4 室内棉铃虫抗虫验证 |
| 第三章:结果与分析 |
| 3.1 目的基因sgRNA设计及GO富集分析 |
| 3.2 sgRNAs混合载体文库的构建与评估 |
| 3.3 棉花基因编辑突变体材料的获取 |
| 3.4 基于条形码的高通量测序技术检测T0 植株sgRNA信息 |
| 3.5 利用高通量测序方法检测基因组编辑效率 |
| 3.6 高效的棉花T0 代突变体基因组编辑效率 |
| 3.7 棉花T0 单株的编辑概况 |
| 3.8 棉花基因组编辑在后代中的遗传率 |
| 3.9 棉花基因编辑后代材料抗虫表型鉴定 |
| 3.9.1 温室蚜虫抗性鉴定 |
| 3.9.2 T2 代材料蚜虫抗性鉴定 |
| 3.9.3 海南温室咀嚼时害虫危害表型鉴定 |
| 3.10 GhMLP423 基因虫害表型验证 |
| 3.10.1 超表达和基因编辑材料筛选 |
| 3.10.2 棉铃虫饲喂实验 |
| 3.10.3 棉铃虫取食偏好性验证 |
| 3.10.4 JA-Ile相关检测 |
| 3.11 脱靶分析 |
| 第四章:讨论 |
| 4.1 利用CRISPR/Cas9 基因编辑系统创建陆地棉突变体库的必要性 |
| 4.2 CRISPR/Cas9 系统在棉花基因组中高效的编辑及遗传规律 |
| 4.3 CRISPR/Cas9 在陆地棉基因组编辑系统的高特异性 |
| 4.4 棉花基因编辑工具的优化与展望 |
| 4.5 植物在非生物和生物胁迫的响应中可能涉及复杂而重叠的信号网络 |
| 4.6 CRISPR/Cas9 基因组编辑植物相比于转基因植物在育种上的优越性 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 混合载体文库构建 |
| 附录2 棉花的遗传转化 |
| 附录3 棉花DNA提取(天根试剂盒法DP305) |
| 附录4 棉花RNA提取(天根试剂盒法) |
| 附录5 RNA反转录 |
| 附录6 Real-time |
| 附录7 棉铃虫饲喂 |
| 附表 |
| 附表1 502 个目的基因ID |
| 附表2 968个sgRNA靶标序列 |
| 附表3 barcoded引物序列 |
| 附表4 潜在脱靶位点检测引物序列 |
| 已发表论文 |
| 已申请专利 |
| 致谢 |
（2）基于田间表型和表型组平台图像指标解析棉花响应干旱的遗传基础（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 研究问题的由来 |
| 1.2 文献综述 |
| 1.2.1 植物抗旱性鉴定的主要指标 |
| 1.2.1.1 抗旱性鉴定的形态指标 |
| 1.2.1.2 抗旱性鉴定的生理生化指标 |
| 1.2.1.3 综合指标 |
| 1.2.2 关联分析及其在植物抗旱中的应用 |
| 1.2.2.1 关联分析概念及其优势 |
| 1.2.2.2 关联分析理论基础:连锁不平衡 |
| 1.2.2.3 关联分析在粮食作物抗旱中的研究进展 |
| 1.2.2.4 关联分析在棉花抗旱中的研究进展 |
| 1.2.3 植物表型组学的发展和应用 |
| 1.2.3.1 表型组学的概念及优势 |
| 1.2.3.2 植物表型组学的研究策略 |
| 1.2.3.3 国外表型平台及国际组织的发展 |
| 1.2.3.4 我国植物表型平台的发展及应用 |
| 1.2.3.5 植物表型组学解析遗传基础的研究进展与趋势 |
| 1.3 本研究的目的和意义 |
| 第二章 田间棉花的多指标综合性抗旱研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验设计与干旱处理 |
| 2.1.2 性状考察 |
| 2.1.3 遗传力分析和方差分析 |
| 2.1.4 抗旱系数与综合抗旱指数 |
| 2.1.5 材料重测序及数据分析 |
| 2.1.6 全基因组关联分析及干旱相关(DR)候选基因鉴定 |
| 2.1.7 qRT-PCR验证候选基因 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 表型变异结果分析 |
| 2.2.2 正常给水条件下性状之间的相关性分析 |
| 2.2.3 不同灌水条件下棉花产量、纤维品质及相关性状表现 |
| 2.2.4 基因型数据分析和变异鉴定 |
| 2.2.5 群体结构和主成分分析 |
| 2.2.6 全基因组关联分析和DR位点鉴定 |
| 2.2.7 转录组分析和q RT-PCR检测DR候选基因 |
| 2.3 讨论与结论 |
| 2.3.1 限制给水影响棉花的发育和形态发生 |
| 2.3.2 限制给水影响棉花籽棉产量 |
| 2.3.3 全基因组关联分析有助于棉花DR基因的发掘 |
| 2.3.4 结论 |
| 第三章 表型组学与基因组学联合解析棉花苗期响应干旱的遗传基础 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验设计和干旱处理 |
| 3.1.3 图像数据收集及数字化特征(i-traits)提取 |
| 3.1.3.1 颜色分量提取 |
| 3.1.3.2 i-traits的定义 |
| 3.1.4 i-traits表型数据分析 |
| 3.1.5 材料重测序及全基因组关联分析 |
| 3.1.6 转录组测序 |
| 3.1.7 差异表达基因分析 |
| 3.1.8 病毒介导的基因沉默(VIGS)实验 |
| 3.1.9 VIGS材料的干旱处理及表型考察 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 高通量自动表型平台测定棉花表型数据 |
| 3.2.2 干旱条件下的i-traits变异 |
| 3.2.3 新型的i-traits抗旱指标 |
| 3.2.4 基因型数据分析 |
| 3.2.5 群体结构和主成分分析 |
| 3.2.6 全基因组关联分析和DR位点鉴定 |
| 3.2.7 干旱负调控基因Gh DNRs的鉴定 |
| 3.3 讨论与结论 |
| 3.3.1 表型组学可以为棉花抗旱研究提供新型表型指标 |
| 3.3.2 表型组学结合GWAS有利于鉴定DR基因 |
| 3.3.3 植物表型组学研究展望 |
| 3.3.4 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 I |
| 附录 II |
| 一、攻读学位期间已发表论文 |
| 二、参加国际会议 |
| 致谢 |
（3）烟粉虱与双生病毒互作蛋白的鉴定与功能初探（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文章综述与研究目的 |
| 1.1 烟粉虱 |
| 1.1.1 烟粉虱概述 |
| 1.1.2 烟粉虱的分类和命名 |
| 1.1.3 烟粉虱的危害 |
| 1.2 双生病毒 |
| 1.2.1 双生病毒的分类与传播 |
| 1.2.2 双生病毒基因组结构 |
| 1.2.3 番茄黄曲叶病毒概述 |
| 1.2.4 中国番木瓜曲叶病毒概述 |
| 1.3 双生病毒的传播 |
| 1.3.1 烟粉虱传播双生病毒的类型 |
| 1.3.2 菜豆金黄花叶病毒属病毒的传毒屏障与传播过程 |
| 1.3.3 影响烟粉虱对菜豆金黄花叶病毒属的病毒传播的因素 |
| 1.3.4 菜豆金黄花叶病毒属病毒的外壳蛋白在传毒过程中的作用 |
| 1.3.5 菜豆金黄花叶病毒属病毒穿过烟粉虱中肠肠壁的分子机制 |
| 1.3.6 唾液腺在菜豆金黄花叶病毒属病毒传播中的作用 |
| 1.3.7 烟粉虱血淋巴和内共生菌在病毒传播中的作用 |
| 1.4 酵母双杂交系统及其在植物病毒与昆虫媒介互作研究中的应用 |
| 1.4.1 酵母双杂交系统概述 |
| 1.4.2 酵母双杂交系统的原理 |
| 1.4.3 酵母双杂交系统的局限性 |
| 1.4.4 酵母双杂交技术在研究植物病毒与介体昆虫互作中的应用 |
| 1.5 立题依据及研究内容 |
| 1.5.1 立题依据 |
| 1.5.2 本研究的主要内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 基本材料 |
| 2.1.1 供试烟粉虱及其种群维持方法 |
| 2.1.2 供试植物 |
| 2.1.3 供试病毒与带毒植物的获取 |
| 2.1.4 生态学试验相关的主要仪器设备 |
| 2.1.5 分子生物学试验相关的主要试剂与仪器设备 |
| 2.2 基本实验方法 |
| 2.2.1 带毒植物的获取 |
| 2.2.2 烟粉虱基因组总DNA的粗提取 |
| 2.2.3 植物基因组总DNA的粗提取 |
| 2.2.4 带毒烟粉虱和植物组织中病毒DNA的检测 |
| 2.2.5 烟粉虱隐存种鉴定方法(PCR-RFLP法) |
| 2.2.6 烟粉虱RNA提取方法(TRIzol法) |
| 2.2.7 通过RNA反转录合成c DNA |
| 2.2.8 定量PCR |
| 2.2.9 分子亚克隆 |
| 2.2.10 双链RNA的合成 |
| 2.2.11 烟粉虱总蛋白提取方法 |
| 2.2.12 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳与Western Blot |
| 第三章 已筛选出的蛋白在MEAM1烟粉虱获取双生病毒过程中的功能初探 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 供试植物、病毒和昆虫 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 双链RNA的合成方法 |
| 3.1.4 膜饲喂双链RNA干扰烟粉虱目的基因的表达 |
| 3.1.5 显微注射双链RNA干扰烟粉虱目的基因的表达 |
| 3.1.6 检测双链RNA干扰后目的基因的沉默效率 |
| 3.1.7 烟粉虱获毒能力的检测 |
| 3.1.8 MEAM1烟粉虱获毒后基因转录水平的变化 |
| 3.1.9 数据分析 |
| 3.2 结果分析 |
| 3.2.1 干扰Unpro和 Slc2a8 基因后对MEAM1 烟粉虱获毒的影响 |
| 3.2.2 干扰Integrin和 Laminin基因后对MEAM1 烟粉虱获毒的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 MEAM1烟粉虱中肠和唾液腺中与PaLCuCNV外壳蛋白互作的蛋白筛选验证与功能初探 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 供试植物、病毒和昆虫 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 MEAM1 烟粉虱中肠和唾液腺c DNA文库的构建 |
| 4.1.4 pDHB1-PaLCuCNV-CP诱饵载体的构建 |
| 4.1.5 诱饵载体pDHB1-PaLCuCNV-CP的表达和功能检测 |
| 4.1.6 诱饵pDHB1-PaLCuCNV-CP预筛文库pPR3-N质粒 |
| 4.1.7 诱饵pDHB1-PaLCuCNV-CP筛选烟粉虱中肠和唾液腺cDNA文库 |
| 4.1.8 阳性克隆的质粒提取、转化大肠杆菌与菌落PCR鉴定 |
| 4.1.9 pDHB1-PaLCuCNV-CP与文库质粒进行酵母双杂的再次验证 |
| 4.1.10 验证基因全长与PaLCuCNV-CP互作 |
| 4.1.11 GST Pull down验证PaLCuCNV-CP与筛选出的蛋白间的互作 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 pDHB1-PaLCuCNV-CP诱饵载体的表达与功能检测 |
| 4.2.2 诱饵载体pDHB1-PaLCuCNV-CP预筛库 |
| 4.2.3 诱饵载体pDHB1-PaLCuCNV-CP筛库 |
| 4.2.4 酵母双杂交回转验证 |
| 4.2.5 互作蛋白编码基因全长与PaLCuCNV-CP的互作验证 |
| 4.2.6 蛋白跨膜结构域预测 |
| 4.2.7 蛋白原核表达温度条件的筛选 |
| 4.2.8 通过GST-pull down验证互作蛋白与PaLCuCNV-CP的互作 |
| 4.2.9 沉默SEC61β会抑制MEAM1 烟粉虱获取PaLCuCNV |
| 4.2.10 MEAM1 烟粉虱获毒后SEC61β基因转录水平的差异 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 总讨论 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 本研究的特色与创新之处 |
| 5.3 本研究的不足之处及值得继续研究的问题 |
| 参考文献 |
（4）陆地棉背景达尔文氏棉A亚组染色体片段导入系农艺性状QTL定位（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 棉属的分类 |
| 1.2 棉属的起源 |
| 1.2.1 棉属栽培种的起源 |
| 1.2.2 棉属四倍体的起源 |
| 1.3 棉属的种质资源 |
| 1.3.1 种质资源对育种的意义 |
| 1.3.2 栽培棉种的特性 |
| 1.3.3 野生棉种的特性 |
| 1.3.4 野生棉的利用 |
| 1.4 遗传连锁图谱 |
| 1.4.1 种内遗传连锁图谱 |
| 1.4.2 种间遗传连锁图谱 |
| 1.5 棉花产量和纤维品质QTL定位研究进展 |
| 1.6 染色体片段导入系研究 |
| 1.6.1 染色体片段导入系 |
| 1.6.2 棉花染色体片段导入系研究进展及应用 |
| 1.7 达尔文氏棉及其研究进展 |
| 第2章 引言 |
| 2.1 研究目的与意义 |
| 2.2 技术路线 |
| 第3章 材料和方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 构建BC_3F_2和BC_3F_(2:3) 染色体片段导入系 |
| 3.3 提取DNA |
| 3.3.1 采取嫩叶 |
| 3.3.2 实验药品及试剂的配制 |
| 3.3.3 仪器设备 |
| 3.3.4 CTAB法提取棉花基因组DNA步骤 |
| 3.4 SSR标记基因型检测 |
| 3.4.1 挑选SSR标记 |
| 3.4.2 PCR反应体系 |
| 3.4.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂 |
| 3.4.4 实验仪器 |
| 3.4.5 电泳步骤 |
| 3.4.6 基因型检测 |
| 3.5 产量和纤维品质检测 |
| 3.6 表型性状分析 |
| 3.7 基因型分析 |
| 3.8 QTL定位 |
| 第4章 结果分析 |
| 4.1 产量和纤维品质表型分析 |
| 4.2 产量和纤维品质各性状方差分析 |
| 4.3 产量和纤维品质性状相关性分析 |
| 4.4 A亚组染色体片段导入系基因型检测 |
| 4.5 A亚组染色体片段导入系基因型分析 |
| 4.5.1 BC_3F_2 各单株基因型分析 |
| 4.5.2 A亚组染色体片段导入系各单株导入片段分析 |
| 4.5.3 A亚组染色体片段导入系各条染色体导入片段分析 |
| 4.6 棉花产量和纤维品质QTL定位 |
| 4.6.1 产量性状QTL |
| 4.6.2 纤维品质性状QTL |
| 第5章 讨论 |
| 5.1 染色体片段导入系亲本的选择 |
| 5.2 QTL簇及共连锁现象 |
| 5.3 QTL有利等位基因来源 |
| 5.4 稳定的QTL与前人研究相比共同的QTL |
| 第6章 结论 |
| 6.1 达尔文氏棉染色体片段导入系的构建及基因型检测 |
| 6.2 染色体片段导入系各单株导入片段 |
| 6.3 染色体片段导入系中A亚组各条染色体导入片段 |
| 6.4 棉花产量和纤维品质QTL定位 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 发表论文 |
（5）miR319-MYB33-SPL9-DFR途径参与陆地棉对大丽轮枝菌的抗性响应（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 棉花黄萎病研究进展 |
| 1.1.1 棉花 |
| 1.1.2 棉花黄萎病 |
| 1.1.3 黄萎病菌致病机理研究 |
| 1.1.4 棉花抗黄萎病机制研究 |
| 1.2 植物miR319及其靶基因MYB33功能的研究进展 |
| 1.2.1 植物miRNA简介 |
| 1.2.2 棉花miRNA研究 |
| 1.2.3 miR319功能研究 |
| 1.2.4 MYB转录因子功能研究 |
| 1.3 本研究的目的和意义 |
| 第2章 棉花miRNA表达量检测方法Stem-loopRT-PCR的建立 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 生物材料 |
| 2.1.2 引物序列设计 |
| 2.1.3 TRIzol法提取棉花总RNA |
| 2.1.4 反转录RT-PCR |
| 2.1.5 半定量RT-PCR |
| 2.1.6 实时荧光定量PCR |
| 2.1.7 扩增效率的计算 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 棉花总RNA提取 |
| 2.2.2 引物扩增效率检验 |
| 2.2.3 Stem-loopRT-PCR方法的灵敏度检测 |
| 2.2.4 Stem-loopRT-PCR分析棉花miRNA表达谱 |
| 2.3 小结 |
| 第3章 ghr-miR319及其靶基因的鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 生物材料 |
| 3.1.2 数据库与生物信息分析软件 |
| 3.1.3 陆地棉miR319及其靶基因的生物信息学分析 |
| 3.1.4 CTAB法提取棉花DNA |
| 3.1.5 构建MIR319载体 |
| 3.1.6 构建GhMYB33-GUS载体 |
| 3.1.7 构建GhMYB33突变基因mGhMYB33-GUS载体 |
| 3.1.8 农杆菌介导转化烟草叶片 |
| 3.1.9 GUS组织染色 |
| 3.1.10 TRIzol法提取棉花总RNA |
| 3.1.11 反转录RT-PCR |
| 3.1.12 实时荧光定量PCR |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 陆地棉miR319的鉴定 |
| 3.2.2 GhMYB33的鉴定 |
| 3.2.3 ghr-miR319与其靶基因GhMYB33的识别 |
| 3.2.4 ghr-miR319与其靶基因GhMYB33的相关关系 |
| 3.2.5 在本氏烟叶中瞬时表达ghr-miR319调控其靶基因GhMYB33 |
| 3.3 小结 |
| 第4章 ghr-miR319及其靶基因的功能研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 生物材料 |
| 4.1.2 构建过表达ghr-miR319载体 |
| 4.1.3 构建沉默ghr-miR319载体 |
| 4.1.4 构建沉默GhMYB33载体 |
| 4.1.5 病毒介导的基因沉默 |
| 4.1.6 大丽轮枝菌V991的活化、培养及侵染 |
| 4.1.7 棉花病情指数统计 |
| 4.1.8 反转录RT-PCR |
| 4.1.9 实时荧光定量PCR |
| 4.1.10 半定量RT-PCR |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 过表达ghr-miR319提高了陆地棉对大丽轮枝菌的抗性 |
| 4.2.2 抑制ghr-miR319的表达降低了陆地棉对大丽轮枝菌的抵御能力.. |
| 4.2.3 沉默GhMYB33的表达提高了陆地棉对大丽轮枝菌的抗性 |
| 4.3 小结 |
| 第5章 ghr-miR319参与陆地棉抗黄萎病的分子机制分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 生物材料 |
| 5.1.2 构建沉默GhSPL9载体 |
| 5.1.3 构建GhMYB33::GFP表达载体 |
| 5.1.4 构建GhSPL9pro::LUC载体 |
| 5.1.5 荧光素酶检测 |
| 5.1.6 反转录RT-PCR |
| 5.1.7 半定量RT-PCR |
| 5.1.8 实时荧光定量PCR |
| 5.1.9 提取陆地棉花青素 |
| 5.1.10 VIGS介导的基因沉默 |
| 5.1.11 大丽轮枝菌V991的活化、培养及侵染 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 GhMYB33转录激活下游基因GhSPL9的表达 |
| 5.2.2 沉默GhSPL9的表达提高了陆地棉对大丽轮枝菌的抗性 |
| 5.2.3 过表达ghr-miR319和沉默GhMYB33促进陆地棉花青素积累 |
| 5.2.4 沉默ghr-miR319表达导致陆地棉中花青素积累量减少 |
| 5.2.5 ghr-miR319参与陆地棉抗病响应模型 |
| 5.3 小结 |
| 第6章 结束语 |
| 6.1 优化了一套鉴定棉花miRNA表达丰度系统方法 |
| 6.2 揭示了miR319-MYB33-SPL9-DFR途径抗病响应机制 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 miR319参与陆地棉抗病响应 |
| 6.3.2 GhMYB33参与陆地棉花青素合成途径 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 附录1 MIR319和GhMYB33核苷酸序列 |
（6）海岛棉品种（系）对枯萎病抗性比较及拮抗细菌生防评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 棉花枯萎病概述 |
| 1.1.1 棉花枯萎病的发生及危害 |
| 1.1.2 棉花枯萎病的症状 |
| 1.1.3 棉花枯萎病病原菌特征 |
| 1.1.4 棉花枯萎病的致病机理 |
| 1.2 棉花枯萎病的综合防治 |
| 1.2.1 化学防治 |
| 1.2.2 农业防治 |
| 1.3 棉花枯萎病拮抗微生物防治 |
| 1.3.1 拮抗微生物防治植物病害 |
| 1.3.2 拮抗微生物防治棉花枯萎病发展现状 |
| 1.4 拮抗细菌在棉花枯萎病生物防治中的应用 |
| 1.4.1 拮抗细菌对棉花枯萎病生物防治作用机理 |
| 1.4.2 拮抗细菌对防治棉花枯萎病的应用前景 |
| 1.5 本研究的目的及意义 |
| 1.6 本研究技术路线 |
| 第2章 海岛棉枯萎病抗性鉴定及产量分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.2 结果分析 |
| 2.2.1 室内盆栽抗性分析 |
| 2.2.2 田间种植抗性分析 |
| 2.2.3 室内与田间抗性分析比较 |
| 2.2.4 棉花产量性状分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第3章 棉花枯萎病病原菌分离纯化及室内药剂筛选 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 病原菌形态及分子鉴定 |
| 3.2.2 室内毒力测定 |
| 3.3 讨论 |
| 第4章 棉花枯萎病拮抗细菌筛选鉴定及生防研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 拮抗细菌的分离筛选 |
| 4.2.2 拮抗细菌发酵液抑菌活性测定 |
| 4.2.3 拮抗细菌对棉苗促生作用分析 |
| 4.2.4 拮抗细菌的温室防病效果 |
| 4.2.5 拮抗细菌耐盐碱分析测定 |
| 4.2.6 拮抗细菌KX-33形态学鉴定 |
| 4.2.7 拮抗细菌KX-33生理生化特性 |
| 4.2.8 拮抗细菌KX-33系统发育分析 |
| 4.3 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）转iaaM基因棉花种质纤维起始发育期的miRNA表达谱分析及其靶基因鉴定（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 IAA对棉纤维起始发育的作用 |
| 1.1.1 iaaM基因研究进展 |
| 1.1.2 转iaaM基因在棉花生产上的应用 |
| 1.2 植物miRNA研究 |
| 1.2.1 植物miRNA的发现 |
| 1.2.2 植物miRNA的生物合成 |
| 1.2.3 植物miRNA作用机制 |
| 1.2.4 植物miRNA的鉴定 |
| 1.2.5 植物miRNA靶基因识别 |
| 1.3 棉花miRNA功能研究进展 |
| 1.3.1 棉花miRNA的发现 |
| 1.3.2 棉纤维发育的相关基因 |
| 1.3.3 激素对棉纤维发育的作用 |
| 1.3.4 棉花miRNAs与逆境胁迫 |
| 1.3.4.1 棉花miRNAs对非生物胁迫的应答 |
| 1.3.4.2 棉花miRNA对生物胁迫的应答 |
| 1.3.4.3 棉花miRNAs调控纤维发育 |
| 1.3.4.4 miRNA参与棉花发育调控的其他功能研究 |
| 2 转iaaM基因棉花种质生长素的表达及纤维品质表现 |
| 2.1 供试材料及田间种植 |
| 2.2 GUS鉴定 |
| 2.3 自交 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 所用仪器及试剂 |
| 2.4.2 GUS染色液的配置 |
| 2.4.3 GUS鉴定选择阳性植株 |
| 2.4.4 生长素提取方法 |
| 2.4.5 棉花纤维品质测定 |
| 2.5 结果与分析 |
| 2.5.1 GUS鉴定结果 |
| 2.5.2 棉花叶片和胚珠中生长素含量 |
| 2.5.3 棉纤维品质的测定 |
| 2.6 小结 |
| 3 小RNA高通量测序及生物信息学分析 |
| 3.1 材料与试剂 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 实验试剂和主要仪器 |
| 3.1.3 总RNA的提取与质量检测 |
| 3.1.4 小分子RNA文库构建及solexa测序 |
| 3.1.5 保守的和新的miRNA的识别 |
| 3.1.6 miRNA差异表达分析 |
| 3.1.7 靶基因预测与功能注释 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 总RNA提取质量鉴定 |
| 3.2.2 测序质量评估 |
| 3.2.3 RNA归类 |
| 3.2.4 保守的miRNA鉴定及表达特点 |
| 3.2.4.1 保守miRNA的鉴定 |
| 3.2.4.2 部分miRNAs表达特点 |
| 3.2.5 新miRNA的鉴定 |
| 3.2.5.1 miRNA差异表达分析 |
| 3.2.6 靶基因预测 |
| 3.2.7 靶基因GO富集分析和KEGG富集分析 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
（8）海岛棉microRNA及其靶标的鉴定和功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物microRNA研究背景介绍 |
| 1.1.1 植物miRNA的合成途径及主要关键酶的介绍 |
| 1.1.2 植物microRNA的调控机理 |
| 1.1.3 microRNA基因的产生 |
| 1.1.4 植物microRNA的生物学功能 |
| 1.2 小RNA测序和降解组测序介绍 |
| 1.2.1 小RNA测序研究介绍 |
| 1.2.2 降解组测序研究介绍 |
| 1.2.3 小RNA测序和降解组测序技术在棉花中的运用 |
| 1.3 microRNA157靶标基因功能研究进展 |
| 1.4 棉花纤维发育研究进展 |
| 1.4.1 棉花纤维发育时期介绍 |
| 1.4.2 激素等信号分子对纤维发育的调控 |
| 1.4.3 转录因子对纤维发育的调控 |
| 1.4.4 细胞壁合成修饰相关蛋白以及细胞骨架相关蛋白对纤维发育的影响 |
| 1.4.5 棉花纤维人工驯化的研究进展 |
| 1.5 调控器官大小研究进展 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 海岛棉纤维发育相关microRNA的鉴定与分析 |
| 2.1 实验材料和方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 实验结果与分析 |
| 2.2.1 小RNA的注释与序列分析 |
| 2.2.2 保守和新microRNA的鉴定 |
| 2.2.3 microRNA表达模式分析 |
| 2.2.4 microRNA在胚珠和纤维中生物活性检测 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 调控纤维发育microRNA靶标的挖掘 |
| 3.1 实验材料和方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 实验结果与分析 |
| 3.2.1 microRNA靶标的鉴定与验证 |
| 3.2.2 靶标与对应microRNA的表达模式相关性分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 microRNA157影响棉花纤维发育,形态建成和器官大小 |
| 4.1 实验材料和方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 实验结果与分析 |
| 4.2.1 棉花的驯化改变了microRNA157和其靶标在纤维的表达量 |
| 4.2.2 降低microRNA157在纤维中的活性导致纤维细胞变短 |
| 4.2.3 超量表达microRNA157导致植株丛生，花和棉桃变小 |
| 4.2.4 超量表达microRNA157抑制了花器官的发育 |
| 4.2.5 RNA seqencing分析差异表达基因 |
| 4.2.6 miRNA157及其靶标基因GhSPLs表达模式分析 |
| 4.2.7 超量表达GhmiR157导致生长素信号减弱 |
| 4.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 植物基因组DNA抽提方法 |
| 附录2 Southern blot操作步骤 |
| 附录3 异硫氰酸胍法抽提RNA |
| 附录4 七个文库中保守miRNAs和候选新miRNAs表达量 |
| 附录5 七个纤维发育文库中预测的miRNA前体 |
| 附录6 miRNA保守性分析 |
| 附录7 七个纤维发育文库中保守miRNA家族代表序列 |
| 附录8 纤维起始期鉴定的miRNA靶标 |
| 附录9 纤维伸长期鉴定的miRNA靶标 |
| 附录10 纤维次生壁加厚期鉴定的miRNA靶标 |
| 附录11 引物序列列表 |
| 攻读学位期间已发表和待发表论文 |
| 致谢 |
（9）利用种间杂交技术向陆地棉转育两个二倍体棉的卷叶病抗性特性研究（论文提纲范文）
| ABSTRACT |
| 摘要 |
| LIST OF ABBREVIATIONS |
| PART 1 LITERATURE REVIEW |
| Chapter 1 An overview of cotton leaf curl disease |
| 1.1 Cotton culy leaf disease and geminiviruses |
| 1.2 Characteristics of Geminiviridae |
| 1.3 Classification of Geminiviridae |
| 1.3.1 Mastrevirus |
| 1.3.2 Curtovirus |
| 1.3.3 Topocuvirus |
| 1.3.4 Begomovirus |
| 1.4 Origin of disease and its impacts on production |
| 1.4.1 CLCuD and yield losses |
| 1.4.2 Signs and symptoms |
| 1.4.3 The host range of CLCuD |
| Chapter 2 Valuable resistant resources in diploid cotton species |
| Chapter 3 Strategies to manage CLCuD |
| 3.1 Molecular breeding for disease |
| 3.2 Breeding for virus resistance |
| 3.3 Employment of molecular markers |
| 3.3.1 Microsatellites(SSR) |
| 3.4 Marker assisted selection(MAS) |
| 3.5 Quantitative trait loci mapping of disease resistance |
| 3.5.1 Development of mapping population |
| 3.5.2 Bulk segregant analysis |
| 3.5.3 Statistical approaches for QTL identification |
| Over all objective of study |
| PART Ⅱ ACADEMIC REPORT |
| Chapter 4 Transferrence of resistances to cotton leaf curl disease from Gossypium arboreum into G. hirsutum via interspecific hybridization |
| 4.1 Introduction |
| 4.2 Materials and methods |
| 4.2.1 Plant materials |
| 4.2.2 Development of backcross progenies |
| 4.2.3 Cross fertility studies |
| 4.2.4 Morphological characteristics |
| 4.2.5 Cytological studies |
| 4.2.6 Maintenance of virus inoculum and screening for CLCuD |
| 4.2.7 Phenotypic assessment of BC_1～BC_3 progenies against CLCuD |
| 4.2.8 Inoculation of CLCuD through grafting |
| 4.3 Results |
| 4.3.1 Development of backcross populations from an interspecific cross between G.arboreum and G. hirsutum |
| 4.3.2 Evaluation of cotton leaf curl virus resistance in backcross populations between G.arboreum and G.hirsutum |
| 4.4 Discussion |
| 4.5 Conclusions |
| Chapter 5 Association analysis between SSR markers and traits from G. arboreum in G.hirsutum |
| 5.1 Introduction |
| 5.2 Materials and methods |
| 5.2.1 Plant materials |
| 5.2.2 Molecular marker evaluation |
| 5.2.3 Simple sequence repeats (SSRs) evaluation |
| 5.2.4 PCR reaction mixture and conditions for SSR amplification |
| 5.2.5 Scoring of SSR amplified bands and genotyping |
| 5.2.6 Identification of donor chromosome segments from G. arboreum in G. hirsutum via SSR markers |
| 5.2.7 Association analysis between traits and molecular markers |
| 5.2.8 QTL analysis |
| 5.2.9 Observations and measurements for phenotypic trials |
| 5.2.10 Pearson correlation coefficient (r) |
| 5.2.11 Principal component analysis |
| 5.3 Results |
| 5.3.1 Phenological variation in BC_3～BC_4 populations from an interspecific cross between Gossypium arboreum and Gossypium hirsutum |
| 5.3.2 Screening through SSRs primers |
| 5.3.3 Identification of donor chromosome segments from G. arboreum in G. hirsutum via SSR markers |
| 5.3.4 Association analysis between traits and molecular markers |
| 5.3.5 Quantitative traits loci |
| 5.4 Discussion |
| 5.4.1 Phenological variation in BC_3-BC_4 populations from an interspecific cross between Gossypium arboreum and Gossypium hirsutum |
| 5.4.2 Molecular breeding |
| 5.4.3 Choice of mapping population and size |
| 5.4.4 Parental screening and choice of DNA markers |
| 5.4.5 Identification of donor chromosome segments from G. arboreum in G. hirsutum |
| 5.4.6 Association analysis between traits and molecular markers |
| 5.4.7 QTL mapping |
| 5.5 Conclusions |
| Chapter 6 Transferrence of resistances to cotton leaf curl disease and increased fibre strength from Gossypium stocksii into G. hirsutum via interspecific hybridization |
| 6.1 Introduction |
| 6.2 Materials and methods |
| 6.2.1 Colchicine treatment |
| 6.2.2 Morphological characteristics |
| 6.2.3 Pollen viability estimation |
| 6.2.4 Cytological studies: |
| 6.2.5 Evaluation of F_1 hybrid plants resisitant to CLCuD |
| 6.2.6 Measurement of fiber qualities |
| 6.3 Results |
| 6.3.1 Development of F_1 hexaploid from an interspecific cross between Gossypium hirsutum and Gossypium stocksii |
| 6.3.2 Evaluation of resistance to CLCuD and increased fibre strength in F_1 hexaploid from an interspecific cross between G. hirsutum and G. stocksii |
| 6.4 Discussion |
| 6.5 Conclusions |
| Over all conclusions of the study |
| Innovations of the dissertation |
| List of publications |
| References |
| Appendix |
| Acknowledgement |
（10）棉属（Gossypium）种间杂交研究及陆地棉（G. hirsutum）-澳洲棉（G. australe）异附加系的培育（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 棉花远缘杂交的研究进展及种间杂交的创制 |
| 1 棉属的起源、进化与分布 |
| 2 棉花远缘杂交 |
| 3 棉花远缘杂交研究现状 |
| 4 远缘杂交的障碍及其克服 |
| 4.1 种间杂交的不亲和性 |
| 4.2 种间杂交不亲和性的克服 |
| 4.3 杂种夭亡或杂种F_1不育 |
| 4.4 种间杂种F_1不育性的克服 |
| 4.5 杂种后代的疯狂分离 |
| 4.6 杂种后代疯狂分离的克服 |
| 5 野生棉种质资源的利用途径 |
| 5.1 二倍体野生棉异源四倍体利用途径 |
| 5.2 二倍体野生棉异源六倍体利用途径 |
| 5.3 体细胞杂交途径 |
| 6 秋水仙素在植物加倍处理中的应用 |
| 7 流式细胞在倍性水平的鉴定和分拣染色体中的应用 |
| 第二章 棉花异附加系的培育及其在遗传育种中的应用 |
| 1 作物异附加系的培育方法及其挑战 |
| 1.1 异附加系的培育方法 |
| 1.1.1 常规法 |
| 1.1.2 重单体或多重单体附加法 |
| 1.1.3 单倍体法(组织培养法) |
| 1.1.4 原生质体融合法 |
| 2 异附加系的鉴定与评价 |
| 2.1 形态学鉴定 |
| 2.2 细胞学鉴定 |
| 2.3 同工酶标记鉴定 |
| 2.4 分子标记鉴定 |
| 2.4.1 RFLP标记 |
| 2.4.2 SSR标记 |
| 2.4.3 AFLP标记 |
| 2.5 荧光原位杂交鉴定 |
| 3 异附加系的遗传特性与传递率 |
| 3.1 异附加系的遗传与重组 |
| 3.2 单体异附加系的传递率 |
| 3.3 单体异附加系的保存方法 |
| 4 异附加系在作物遗传育种中的应用 |
| 4.1 渗入应用育种项目的有益基因、拓宽遗传背景 |
| 4.2 创建异代换系或易位系 |
| 4.3 基因定位及其比较基因组学研究 |
| 4.4 构建外源染色体文库 |
| 4.5 研究外源染色体的配对与重组 |
| 5 澳洲棉在棉花遗传育种中的利用 |
| 5.1 澳洲棉的分类及地里分布 |
| 5.2 澳洲棉的研究进展 |
| 6 本研究的目的和意义 |
| 第二篇 研究报告 |
| 第三章 棉花种间杂交及杂种F_1的研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 杂交方法 |
| 1.2.2 染色体加倍 |
| 1.2.3 倍性水平的鉴定方法 |
| 1.2.4 分子标记(SSR)法 |
| 1.2.5 根尖细胞染色体数目统计法 |
| 1.2.6 秋水仙素和流式细胞术溶液的配制 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 陆地棉与野生棉种间杂交的相关研究 |
| 2.1.1 陆地棉与野生棉种间杂种F_1的获得 |
| 2.1.2 陆地棉与野生棉种间部分杂种F_1形态学特征 |
| 2.1.3 陆地棉与野生棉种间杂种F_1染色体的加倍 |
| 2.2 亚洲棉与野生棉种间杂交的相关研究 |
| 2.2.1 亚洲棉与野生棉种间杂种F_1的获得 |
| 2.2.2 亚洲棉与野生棉种间杂种F_1的形态学表型 |
| 2.3 非洲草棉(G. herbaceum L race africanum)与澳洲棉(G.australe)种间杂种F_1的研究 |
| 2.3.1 种间杂种F_1枝条的加倍处理 |
| 2.3.2 种间杂种F_1的形态特征 |
| 2.4 陆地棉与异常棉、雷蒙德氏棉五倍体的获得 |
| 2.4.1 陆地棉与异常棉五倍体的鉴定 |
| 2.4.2 陆地棉与雷蒙德氏棉五倍体的鉴定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 克服种间杂种不育性方法的探讨 |
| 3.2 秋水仙素在诱导棉花种间杂种的作用 |
| 3.3 流式细胞术在倍性水平鉴定中的作用 |
| 第四章 陆地棉-澳洲棉染色体异附加系的培育 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 技术路线 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 基因组原位杂交(GISH)的鉴定 |
| 1.3.2 分子标记(SSR)的鉴定 |
| 1.3.3 陆地棉-澳洲棉单体异附加系(MAAL)与陆地棉(AADD)回交的结实性测定 |
| 1.3.4 陆地棉-澳洲棉单体异附加系的传递 |
| 1.3.5 形态学性状调查分析 |
| 1.3.6 陆地棉-澳洲棉单体异附加系黄萎病的抗性鉴定 |
| 1.3.7 叶片叶绿素含量的测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 澳洲棉特异引物的筛选 |
| 2.2 陆地棉-澳洲棉异附加系的产生 |
| 2.3 陆地棉-澳洲棉异附加系的GISH鉴定 |
| 2.4 陆地棉-澳洲棉单体异附加系身份的确定 |
| 2.5 TMAAL-7G~a、8G~a和10G~a三体异附加系的鉴定 |
| 2.6 陆地棉-澳洲棉单体异附加系与亲本回交的结实性 |
| 2.7 陆地棉-澳洲棉单体异附加系附加外源染色体通过雌、雄配子的传递率 |
| 2.7.1 附加外源染色体通过雌配子的传递率 |
| 2.7.2 附加外源染色体通过雄配子的传递率 |
| 2.7.3 陆地棉-澳洲棉MAAL-10G~a的高频传递 |
| 2.8 单体异附加系的形态学特征 |
| 2.9 陆地棉-澳洲棉单体异附加系黄萎病抗性的鉴定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 培育一套陆地棉-野生种外源染色体异附加系的挑战 |
| 3.2 单体异附加系n+1配子的传递 |
| 3.3 MAAL-10G~a的高频传递研究 |
| 3.4 澳洲棉抗黄萎病和延迟种子腺体发育基因的发掘 |
| 全文总结 |
| 创新点及不足之处 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间已发表及待发表的论文 |
| 致谢 |
四、Identification of DNA Markers for Cotton Leaf Curl Disease (CLCD) in Cotton (Gossypium hirsutum L. )（论文参考文献）
- [1]CRISPR/Cas9介导的用于高效筛选内源抗虫相关基因的棉花高通量基因编辑突变体库构建[D]. 孙琳. 华中农业大学, 2021
- [2]基于田间表型和表型组平台图像指标解析棉花响应干旱的遗传基础[D]. 李保奇. 华中农业大学, 2020
- [3]烟粉虱与双生病毒互作蛋白的鉴定与功能初探[D]. 尹天言. 浙江大学, 2020(01)
- [4]陆地棉背景达尔文氏棉A亚组染色体片段导入系农艺性状QTL定位[D]. 孙旭静. 西南大学, 2019(01)
- [5]miR319-MYB33-SPL9-DFR途径参与陆地棉对大丽轮枝菌的抗性响应[D]. 胡广. 吉首大学, 2018(02)
- [6]海岛棉品种（系）对枯萎病抗性比较及拮抗细菌生防评价[D]. 李海薇. 新疆农业大学, 2018
- [7]转iaaM基因棉花种质纤维起始发育期的miRNA表达谱分析及其靶基因鉴定[D]. 刘玉姣. 浙江大学, 2017(01)
- [8]海岛棉microRNA及其靶标的鉴定和功能分析[D]. 刘念. 华中农业大学, 2016(12)
- [9]利用种间杂交技术向陆地棉转育两个二倍体棉的卷叶病抗性特性研究[D]. Wajad Nazeer. 南京农业大学, 2015(06)
- [10]棉属（Gossypium）种间杂交研究及陆地棉（G. hirsutum）-澳洲棉（G. australe）异附加系的培育[D]. 陈煜. 南京农业大学, 2014(05)