一、脑缺血相关蛋白质的鉴定和功能研究（论文文献综述）
其布日[1]（2021）在《额尔敦-乌日勒的活性成分分析及其对小胶质细胞基因调控作用的研究》文中指出脑卒中是我国第一大死亡原因,是全球仅次于缺血性心脏病的第二大死亡原因。因此,研发新型抗脑卒中药物意义重大。额尔敦-乌日勒（EW）是蒙医治疗神经系统疾病的经典方剂,具有良好的神经保护作用,对脑卒中引起的半身不遂等症状疗效显着,因而得到广泛的临床应用。然而,EW化学成分复杂,作用机制不明确。因此,必需明确EW的生物活性成分,并阐明其神经保护作用机制。本论文中分析了EW的部分有效成分,并发现了EW对大脑中动脉阻塞/再灌注损伤（MCAO/R）模型大鼠脑内小胶质细胞的基因调控作用、极化作用以及从抗神经性炎症作用。【研究目的】（1）验证EW对MCAO/R模型大鼠病变部位组织内基因表达的调控作用,并分析EW中所含有的神经活性化合物;（2）确定EW在脑卒中恢复期间通过调节小胶质细胞极化来抑制神经炎症的主要化合物;（3）确定EW的分级分离组分中的关键抗炎分子及作用机理以及对神经细胞保护及突触生长的影响;（4）EW中关键活性分子的协同作用对小胶质细胞基因表达谱的影响。【研究方法】（1）建立大鼠MCAO/R模型,连续给药两周。第15天,提取大鼠大脑皮质病变区组织的总RNA,并进行转录组测序（RNA-seq）分析。筛选未处理组、MCAO模型组和EW给药组之间显着差异表达的基因,并分析各个基因的功能以及在缺血性脑卒中恢复过程中的可能作用。（2）根据文献报道收集EW药材中与神经相关的生物活性化学分子信息,采用Chem Draw软件画出结构式并建立数据库,命名为“EW神经活性化合物数据库”;其次,采用五种不同溶剂提取EW可溶解组分,并使用UPLC-QTof-MS分析其活性化合物。（3）以调控小鼠小胶质细胞（BV2细胞株）M1表型表达的细胞因子Cxcl10为筛选标准,利用RT-q PCR法对EW的5种溶剂提物进行快速筛选,选出了调控作用最为显着的提取物,通过两次HPLC半制备分离,得到优化的生物活性小分子组,并利用UPLC-QTof-MS鉴定了其生物活性分子。（4）采用UPLC-QTof-MS鉴定EW的分离组分（命名为F4-6）的关键抗炎分子;利用蛋白免疫印迹分析了F4-6对脂多糖（LPS）刺激的BV2小胶质细胞NF-κB信号通路相关蛋白水平的影响;以及分析F4-6处理的小胶质细胞培养液对神经元（N2a细胞）的增值和突触生长的影响。（5）利用RNA-seq分析讨论EW所含关键活性分子土木香内酯（Ala）和去氢二异丁香酚（Deh）单分子以及混合物对LPS刺激的BV2小胶质细胞基因表达谱（Gene expression pattern profile）的影响,并采用RT-q PCR法对RNA-seq结果进行了验证。【研究结果】（1）Bederson评分显示,给药14天后,EW给药组MCAO/R模型大鼠的评分从治疗前的2.07降至治疗后的0.21（P<0.01）,说明EW显着降低了神经系统损伤。与NT组相比,MCAO模型组大鼠大脑皮质区病变组织内有63个差异表达的基因;而与MCAO模型组相比,EW治疗后有186个差异表达的基因;其中生长因子（Igf1、Igf2和Tgfβ）和颗粒蛋白编码基因Grn等的表达在EW治疗后显着上调（P<0.05）;同时也检测到小胶质细胞标记物的表达大幅增强,以及补成分和分泌蛋白酶的表达。（2）五种不同溶剂提取的EW组分的UPLC-QTof-MS分析发现,在我们建库的11种蒙药的32个小分子化合物中,除决明子外其他10种蒙药（红花、肉豆蔻、甘草、草果、川楝子、栀子、土木香、木香、荜茇和黑种草等）中已报道的16个神经活性相关小分子化合物分别出现在五种溶剂提取物中。（3）快速筛选结果表明,EW石油醚提取物（命名为EW-5）对Cxcl10基因表达的抑制作用最强（P<0.05）。采用HPLC半制备法,对EW进行2次分级分离后最终得到12个组分。其中,组分F4-6对促炎细胞因子（Cxcl10、Tnfα、Il1β和Nos2）表达的抑制作用最显着（P<0.05）。通过UPLC-QTof-MS对F4-6进行了分析,共鉴定出20种化合物,其中包括木香烃内酯、肉豆蔻醚、土木香内酯和亚麻酸;这些小分子在LPS刺激的BV2细胞和小鼠原代小胶质细胞中,显着下调关键促炎细胞因子的表达。（4）土木香内酯（Ala）和去氢二异丁香酚（Deh）是F4-6的关键抗炎活性分子。F4-6、Ala和Deh均下调LPS刺激的小胶质细胞中Ccl2、Cox2和Il6等促炎基因的表达;同时上调Hmox1、Tgfβ、Igf1和Creb1等抗炎基因的表达。此外,F4-6处理的小胶质细胞条件培养液能显着促进N2a细胞的增殖,并可能通过上调Nefh和Dlg4来促进突起的生长。从机理上讲,F4-6显着降低了NF-κB p65蛋白的表达,同时抑制了p65的核转位,导致NF-κB启动的促炎基因转录受到抑制。（5）RNA-seq发现,Ala、Deh和Mix均下调促炎基因和上调抗氧化基因。Mix组的作用比Ala组和Deh组的作用更显着（P<0.05）,其作用不仅仅是简单的Ala和Deh作用的加和。【研究结论】综上所示,本论文首次利用RNA-seq技术,系统的分析了蒙药EW对MCAO/R模型大鼠脑卒中病变区周围细胞的基因表达的调控作用,发现EW显着改善缺血性脑卒中后神经损伤的恢复,并促使小胶质细胞从M1表型极化至M2表型;同时利用UPLC-QTof-MS系统的分析了EW中神经炎症及神经保护等相关的生物活性化合物,发现EW中多种活性化合物组分的协同作用可能是平衡小胶质细胞极化和缺血性脑卒中后的恢复,也验证了EW治疗白脉病（神经系统疾病）的传统功效,为进一步研究EW甚至其他传统药物的治疗机理提供了重要的证据。
王哲义[2]（2021）在《丹参酮ⅡA磺酸钠调控HIF1α/mTOR介导细胞自噬干预缺血性脑卒中的机制研究》文中研究说明目的:缺血性脑卒中（cerebral ischemic stroke,CIS）具有高患病率、高复发率、高致残率和致死率的特点。丹参酮ⅡA磺酸钠是丹参脂溶性成分丹参酮ⅡA经磺化后的水溶性物质,治疗缺血性脑卒中疗效确切,但作用机制尚未完全阐明。本研究运用网状Meta分析系统评价丹参类中药注射剂治疗急性缺血性脑卒中的有效性和安全性。通过网络药理、蛋白组学技术探究丹参酮ⅡA可能作用机制,并在大鼠缺血/再灌注模型和PC12神经细胞氧糖剥夺/复氧模型中对可能的靶点和机制进行验证。方法:（1）计算机检索中国期刊全文数据库（CNKI）、维普数据库（VIP）、万方数据库、PubMed、Cochrane Library,检索起止时间为建库至2021年2月。由两位研究员独立筛选文献、提取资料并按照Jadad量表对文献进行质量评价,采用Stata 16.0进行统计分析。（2）使用TCMSP数据库检索丹参的活性成分及作用靶点,在GeneCards、NCBI和OMIM数据库中获取缺血性卒中的靶点,并将药物和疾病交集后的靶点输入STRING数据库,构建蛋白质相互作用网络,利用Cytoscape3.8.2软件构建药物-化合物-作用靶点-疾病网络。通过Bioconductor进行GO功能富集和KEGG通路分析。（3）采用改良的线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞再灌注损伤（MCAO/R）模型,将SD大鼠随机分为假手术组、模型组、丹参酮ⅡA磺酸钠组。根据神经功能评分（Z-Longa）、TTC染色及HE染色评价MCAO/R模型及药物疗效。（4）使用DIA定量蛋白组学分析各组大鼠脑缺血半影区蛋白表达的情况,根据|log2FC|≥0.58且p<0.05的标准筛选差异蛋白;利用R软件绘制火山图和差异蛋白聚类分析热图;运用STRING数据库,构建差异蛋白的互作（PPI）网络;利用DAVID、ClueGO等工具对差异蛋白进行GO富集分析和KEGG信号通路分析,并用平行反应监测技术（PRM）的方法验证蛋白表达。（5）利用嗜铬细胞瘤PC12细胞系构建氧糖剥夺复氧（OGD/R）模型,同时给予不同浓度（1μM、5μM、10μM、20μM、40μM）丹参酮ⅡA磺酸钠干预3h、6h、12h,使用CCK-8法检测细胞活力,确定给药剂量和时间,运用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术检测蛋白组学预测的可能靶点。结果:（1）共纳入160项研究,总样本量18079例,共纳入7种中药注射剂和8种治疗措施,包括丹红注射剂联合常规治疗（DH+CT）、丹参注射剂联合常规治疗（DS+CT）、丹参川芎嗪注射剂联合常规治疗（DSCXQ+CT）、注射用丹参多酚酸联合常规治疗（DSDFS+CT）、复方丹参注射剂联合常规治疗（FFDS+CT）、注射用丹参多酚酸盐联合常规治疗（SI+CT）、丹参酮ⅡA磺酸钠注射剂联合常规治疗（STS+CT）和常规治疗（CT）。网状Meta分析结果显示,在总有效率方面,累积概率排序为:DSDFS+CT（93.0%）>DH+CT（80.5%）>STS+CT（66.7%）>DSCXQ+CT（66.4%）>SI+CT（50.0%）>DS+CT（26.7%）>FFDS+CT（16.7%）>CT（0.1%）。在 NIHSS评分方面,累积概率排序为:STS+CT（95.5%）>DH+CT（80.9%）>DSCXQ+CT（70.1%）>SI+CT（64.7%）>DSDFS+CT（42.0%）>FFDS+CT（24.4%）>DS+CT（20.1%）>CT（2.4%）。在 Barthel 指数方面,DH+CT（76.2%）>DSCXQ+CT（74.3%）>STS+CT（64.1%）>DSDFS+CT（62.2%）>FFDS+CT（51.8%）>SI+CT（46.0%）>DS+CT（21.7%）>CT（3.8%）。（2）从丹参中共筛选出65个活性成分和108个对应靶点,以及缺血性卒中相关靶点2558个,取交集后获得靶点87个,其中度值大于50的靶点有6个,包括AKT1、IL6、FOS、VEGFA、MAPK1、EGFR,即本研究的核心靶点。GO功能富集分析得到GO条目124个（p<0.05）,KEGG通路富集分析筛出134条信号通路（p<0.05）,以PI3K/AKT、HIF-1信号通路所占靶点数目最多。构建的药物-化合物-作用靶点-疾病网络显示,丹参酮ⅡA等活性化合物在整个网络中发挥着关键作用。（3）与假手术组相比,MCAO/R模型大鼠神经功能评分显着升高,TTC染色显示梗死范围扩大,HE染色显示大脑皮层及纹状体区域组织变性明显。丹参酮ⅡA磺酸钠治疗可降低神经功能评分,缩小梗死面积,减轻空泡样改变及胞核皱缩等病变。（4）蛋白组学在大鼠脑组织中共鉴定出5880个蛋白,其中模型组与假手术组差异蛋白为423个。经丹参酮ⅡA磺酸钠干预后,与模型组相比,共有285个差异蛋白。将三个组别进行整合分析,共有127个有表达趋势的差异蛋白,这些差异蛋白GO富集主要参与缺氧反应、神经元凋亡过程、钙离子转运等生物学过程;KEGG通路主要富集在PI3K/AKT信号通路、HIF-1信号通路等通路。PPI网络获得Alb、mTOR、Dync1h1、Stxbp1、Cltc、Sptan1等核心差异蛋白。mTOR、PI3K/AKT信号通路、HIF-1信号通路是调控自噬的上游信号,将上述通路的关键靶点及自噬相关蛋白进行PRM验证,结果显示与正常组比较,模型组的mTOR和p62蛋白表达显着下降（p<0.05）,HIF-1α、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、PI3K和AKT1蛋白表达无统计学意义（p>0.05）。经过丹参酮ⅡA磺酸钠治疗后,HIF1α和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达量明显下降（p<0.05）,p62蛋白表达显着升高（p<0.05）,mTOR、PI3K和AKT1表达差异无统计学意义（p>0.05）。（5）体外研究中CCK-8结果显示,与OGD/R模型组相比,丹参酮ⅡA磺酸钠1μM、5μM的给药浓度在3h、6h、12h等不同给药时间对细胞活力均无显着影响;而10μM、20μM和40μM的丹参酮ⅡA磺酸钠在各个给药时间均表现出对PC12细胞的保护作用,且依赖给药时间和药物浓度呈梯度增强,差异具有统计学意义（p<0.05）。RT-qPCR显示,与对照组相比,OGD/R模型组HIF1α、Beclin1、LC3的mRNA相对表达量显着增多（p<0.01）,而mTOR的mRNA相对表达量显着减少（p<0.01）;与OGD/R组相比,丹参酮ⅡA磺酸钠干预后HIF1α、Beclin1、LC3的mRNA相对表达量显着减少（p<0.01）,而mTOR的mRNA相对表达量显着增加（p<0.01）。结论:根据网状Meta分析结果,丹参酮ⅡA磺酸钠注射液在改善患者NIHSS评分方面有优势;网络药理学筛选出丹参酮ⅡA可能是丹参主要活性化合物,并且经蛋白组学预测其磺化后可能作用于mTOR等核心靶点,参与调节PI3K/AKT、HIF-1等信号通路,发挥抑制细胞凋亡、抗炎、调节自噬等作用;体内研究发现丹参酮ⅡA磺酸钠可能通过HIF-1信号通路,作用于mTOR等靶点,抑制细胞自噬,改善MCAO/R模型大鼠神经功能缺损,减小脑梗死面积,减轻脑组织损伤;体外研究显示丹参酮ⅡA磺酸钠可能通过HIF-1途径上调mTOR表达,抑制细胞自噬,发挥神经细胞的保护作用。
化涵毅[3]（2021）在《芫根对局灶性脑缺血缺氧损伤的保护作用及其机制研究》文中研究指明芫根（Brassica rapa L.,Turnip）,十字花科芸薹属植物,是一类生长在青藏高原的食、药、饲多用途植物。据藏医药领域公认的经典名着《医方四续》中记载,芫根具有味甘性温、清热解毒和滋补增氧之功效。现代科技的进步和生活水平的提高延长了人类的平均寿命,但却没有改善脑卒中引起的致死率和致残率,人口的增长和老龄化反而跃升为全球脑卒中病人增加的主要原因。由于一直缺乏有效的脑卒中治疗措施,目前认为预防是最好的保护办法,因此各类膳食指南或功能性食品应运而生,旨在降低脑卒中的发生率。本文以芫根抗缺氧为研究依据,建立体内大脑中动脉栓塞再灌注模型（Middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R）和体外糖氧剥夺再灌注模型（Oxygen and glucose deprivation/reperfusion,OGD/R）,初探芫根对缺血缺氧损伤的保护作用,通过逐级分离,首次获得一种功能性单体,并对其糖氧剥夺损伤的保护能力及作用机理进行了系统性研究。研究结果如下:1.利用小鼠MCAO/R模型,初步证实芫根有助于恢复脑损伤小鼠的行为学能力,并有效减少脑萎缩体积;进一步通过体外实验证明,芫根显着提高神经元OGD/R损伤后的细胞活力,有效抑制乳酸脱氢酶（LDH）和活性氧（ROS）的表达,同时增强内源性抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）和过氧化氢酶（CAT）的酶活力。2.为有效识别芫根中抗缺血缺氧功能性成分,利用四种极性不同的有机试剂,依次对芫根进行逐级萃取,共获得石油醚（萃取）相、氯仿（萃取）相、乙酸乙酯（萃取）相、正丁醇（萃取）相和水相（正丁醇萃余相）。通过OGD/R模型,以细胞活力、LDH、ROS和内源性抗氧化酶等为评价指标,分别验证五种萃取物对神经元细胞的保护能力,发现芫根水相对糖氧剥夺损伤具有最佳抗氧化效果。3.利用小鼠MCAO/R模型和OGD/R模型,进一步验证芫根水相对缺血缺氧损伤的保护能力及作用机理。结果显示,芫根水相预处理可有效提高小鼠行为学的恢复能力,并减小脑萎缩体积;同时显着恢复细胞色素c氧化酶IV亚型（COXIV）的表达,提高呼吸链的功能状态以及细胞的能量生成;此外,芫根水相预处理可调控OGD/R损伤时信号转导因子胞内磷脂酰肌醇激酶（Phosphoinositide 3-kinase,PI3K）的表达,继而进一步引起蛋白激酶B（Protein kinase B,Akt）以及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin,m TOR）的激活,抑制神经元细胞的死亡。4.在明确芫根水相对缺血缺氧损伤的保护效果及可能的作用机理后,进一步缩小研究范围,利用MCI分离柱、HW-40分离柱、ODS-A和ODS-AQ分离柱,借助薄层层析法和细胞ROS检测,对芫根水相进行逐级分离,新发现一种功能性单体（AET-1）,利用1H-NMR、13C-NMR和135DEPT-NMR检测方法,以此解析其化学结构为（2-甲氧基-5-甲基-1,4二氧六环）乙酸甲酯。5.利用体外OGD/R模型发现,AET-1可增强OGD/R损伤后神经元细胞的抗氧化应激能力、提高COXIV的表达活力,并通过激活PI3K/Akt/m TOR信号通路降低糖氧剥夺对神经元细胞的进一步损伤,促进抗凋亡因子/抑制促凋亡因子的表达。综上所述,芫根具有良好的抗缺血缺氧保护作用。本论文为芫根的综合开发和利用提供了科学依据和理论支撑,无论是依托芫根水相开发为功能性产品,或是利用芫根单体AET-1作为联合疗法的添加成分之一,都可提高芫根的经济价值和药用价值。未来的研究须继续阐明AET-1与PI3K、Akt和m TOR在神经系统以及细胞凋亡过程中的作用,才能成功地将功能性单体和激酶靶点转化为神经退行性疾病中有效且安全的预防/治疗策略。
刘博文[4]（2021）在《三七皂苷R1对局灶性脑缺血损伤大鼠急性期保护作用的研究》文中研究指明目的:通过动物及细胞实验探讨三七皂苷R1对局灶性脑缺血大鼠急性期的保护作用与主要机制。方法:1.健康清洁级雄性SD大鼠（260-280g）随机分为6组,即假手术组,模型组,低、中、高剂量三七皂苷R1干预组及正丁基苯酞阳性对照组。模型组、三七皂苷R1干预组及阳性药对照组大鼠行永久性大脑中动脉闭塞模型（MCAo）的制备,假手术组大鼠只行切口并分离动脉后缝合。所有大鼠回笼饲养,假手术组不予治疗,三七皂苷R1干预组及阳性药对照组大鼠在插线后立即分别给予低（10mg/kg/d）、中（20mg/kg/d）、高（40mg/kg/d）剂量的三七皂苷R1及20mg/kg/d正丁基苯酞腹腔注射,模型组大鼠术后给予等量PBS腹腔注射,术后24小时前（包括24小时）每6小时给药一次,24小时后每天给药两次。2.术后12、24及72小时,大鼠分别进行如下处理:12小时后,各组大鼠测评Bederson神经功能,而后,经颈静脉注射4%Evans Blue溶液并循环1小时后取脑,借助小动物活体成像系统检测大鼠血脑屏障的渗漏情况;脑冰冻切片原位酶谱检测脑内MMPs活性及分布;脑缺血半暗带组织蛋白质免疫印迹检测MMP2/9及紧密连接蛋白的表达。术后24小时,大鼠脑切片TTC染色观察梗死体积变化;同时在各组脑组织中检测葡萄糖转运体、乳酸转运体、柠檬酸合成酶的表达以及ATP含量,以评估脑内能量代谢水平。术后72小时,通过Garcia JH大鼠神经功能评分详细了解各组大鼠的运动和感觉功能变化;脑冰冻切片免疫荧光染色观察缺血侧海马区神经再生;并将假手术组,模型组,高剂量三七皂苷R1干预组和正丁基苯酞阳性药对照组的大鼠脑组织送检蛋白质组学。3.体外以氧糖剥夺刺激的脑内皮bEnd.3细胞及神经元N2a细胞模型为研究对象,分别用三七皂苷R1及正丁基苯酞进行干预。bEnd.3细胞体外构建内皮屏障transwell模型,以葡聚糖渗漏程度确定氧糖剥夺的干预时间及药物的起效浓度。干预结束后,各组细胞分离提取亚细胞组分蛋白,并通过蛋白质免疫印迹检测各组分紧密连接蛋白和小窝蛋白的表达;以提高细胞活力为参考,筛选N2a细胞在氧糖剥夺刺激下三七皂苷R1和正丁基苯酞的干预浓度,通过活细胞成像观察其线粒体形态,流式细胞术检测线粒体荧光表达及膜电位。分别提取N2a细胞DNA和RNA,应用Real-Time PCR检测细胞线粒体DNA拷贝数及与线粒体能量代谢相关的mRNA阵列表达,找到差异基因并回归脑组织验证。4.对脑组织蛋白质组学结果进行归纳分析,重点解读蛋白功能注释、蛋白差异分析、以及差异蛋白的功能分析,找到缺血性脑损伤发生后,以及三七皂苷R1和正丁基苯酞抗脑缺血可能涉及到的通路机制。结果:1.三七皂苷R1显着降低脑缺血损伤急性期大鼠Bederson神经功能评分及血脑屏障渗漏,减少梗死侧纹状体及皮质区MMPs的激活,降低缺血半暗带MMP2/9并提高紧密连接蛋白Zo1、Claudin5的表达。体外实验表明,三七皂苷R1降低氧糖剥夺处理的脑内皮细胞渗漏,增加Zo1、Claudin5表达,同时激活由小窝蛋白cav1介导的Occludin胞膜再分布。2.三七皂苷R1显着缩小缺血性脑损伤大鼠的梗死体积,上调半暗带的葡萄糖转运体1、3,乳酸转运体1及柠檬酸合成酶的表达,并提高脑组织ATP含量。体外实验证明,三七皂苷R1增加氧糖剥夺刺激的N2a细胞活力,改善其线粒体形态,增加线粒体表达和线粒体DNA拷贝数,并提升线粒体膜电位。对线粒体能量代谢相关mRNA阵列表达进行分析,与氧糖剥夺组相比,三七皂苷R1组有3个显着性上调基因和11个显着性下调基因,并在缺血半暗带脑组织中回归验证了atp12a及atp6v1g3两个显着性上调基因的表达。3.三七皂苷R1显着改善脑缺血损伤72小时后大鼠的运动和感觉功能,增加梗死侧海马区GFAP+/Nestin+神经干细胞的表达,并促进DCX+神经前体细胞向NeuN+成熟细胞转化。4.脑组织蛋白组学分析结果表明,永久性MCAo模型72小时后可激活凝血级联反应,可能发挥促凝血和抗纤溶的作用,并通过铁死亡通路诱导细胞产生ROS参与铁死亡;三七皂苷R1可能通过松弛素信号,抑制PI3K/AKT/Erk级联反应,从而降低缺血性中风后MMP2/9及NO的产生,同时激活JNK发挥一定的神经调节作用;正丁基苯酞干预的靶点通路较多,其抗脑缺血的机制还可能涉及提升细胞无氧糖酵解能力,和IL-4、COX2参与的抗炎抗凋亡作用。结论:本研究证实了三七皂苷R1对局灶性脑缺血损伤大鼠急性期有较好的保护作用,其机理可能通过Cav1/MMP2/9途径干预了紧密连接蛋白的再分布与降解,从而降低血脑屏障渗漏;同时促进脑内葡萄糖代谢以及线粒体能量代谢相关基因atp12a和atp6v1g3的表达,增进能量代谢,并提高海马区神经再生。
汤宇燕[5]（2020）在《TIPARP在转录组和蛋白组水平上对星形胶质细胞的调控》文中研究指明目的:脑卒中,已经成为仅次于缺血性心脏病的第二大死因,也是首要的致残原因。已有研究表明,在小鼠脑缺血/再灌注模型中鉴定出多种环状RNA（circ RNA）在病灶区域含量发生变化。其中circ HECTD1及circ TLK1在病灶区上调,分别通过circ HECTD1/mi R142/TIPARP轴及circ TLK1/mi R-335-3p/TIPARP轴,均使得TIPARP（TCDD-inducible poly-ADP-ribose polymerase）蛋白表达量升高[1,2]。该研究也在星形胶质细胞氧糖剥夺（Oxygen and glucose deprivation,OGD）模型中验证了TIPARP表达升高的现象,并证实抑制TIPARP表达可以降低OGD诱导的星形胶质细胞活化。由于目前对TIPARP在神经系统中功能的研究还十分有限,特别是被其调控的下游基因尚不明了。为了阐明星形胶质细胞对脑卒中损伤的反应及功能恢复的可能机制,本课题初步研究了TIPARP相互结合的蛋白和TIPARP引起的转录组表达差异,以期为将来进一步研究TIPARP脑卒中过程中的功能和寻找治疗脑卒中的新靶点提供重要线索。方法:根据对于TIPARP功能的已有认识,特别是借鉴PARP-1的研究结果,以及星形胶质细胞活化在脑卒中恢复过程中的重要作用,所以假设:TIPARP通过调节星形胶质细胞活化,影响缺血性脑卒中的恢复。本课题利用蛋白质组学和转录组学的技术研究了TIPARP修饰的目标蛋白、相互结合的蛋白和TIPARP诱导的转录本的变化等。我们采用TIPARP高表达慢病毒感染星形胶质细胞模拟脑卒中过程中TIPARP表达增高的现象,利用无标记定量（Label-free）对实验组和对照组进行TIPARP共沉淀的蛋白质进行高通量质谱分析。通过对蛋白质谱测序结果的分析,对和TIPARP共沉淀的蛋白进行差异分析、筛选及验证。另一方面,使用相同模型,利用高通量二代测序（NGS）研究TIPARP诱导的转录组的变化。然后运用实时荧光定量PCR（q RT-PCR）对转录组高通量测序（RNA-seq）筛选出的差异表达基因进行验证。结果:本课题着重研究了体外培养的星形胶质细胞中的TIPARP结合的蛋白以及TIPARP诱导的差异基因。通过对与TIPARP结合的蛋白质谱测序结果进行分析,实验共鉴定到的样品间差异蛋白59个,筛选了白介素增强子结合因子2（Interleukin enhancer-binding factor 2,ILF2）作为候选结合蛋白并进一步进行了结合实验的验证。通过对转录组测序进行分析,最初鉴定到的差异基因为5252个,进一步选择了12个显着性表达的差异性基因并进行了实时荧光定量PCR验证。结论:我们的研究筛选并验证了培养的星形胶质细胞中TIPARP结合的蛋白以及TIPARP的诱导基因。进一步的研究表明TIPARP与ILF2之间的没有直接的相互关系,后续需要继续筛选其他的候选蛋白进行验证。通过q RT PCR验证,我们确认了9个与RNA-Seq结果一致的基因,它们有可能参与了TIPARP对星形胶质细胞的的调节过程,可以对这些基因进一步研究,未来有可能成为对研究脑卒中有价值的候选基因。综上,对TIPARP的组学研究,将揭示脑卒中损伤过程中可能的恢复机制,可能为临床治疗提供新的理论依据,药物靶标及干预手段。
文美玲[6]（2020）在《基于1DE-LC-MS系统化分析的差异蛋白质组学研究策略的建立与应用》文中认为蛋白质组学是对器官、组织或细胞内所有蛋白质进行大规模研究,其终极目标为全面理解并重构目标蛋白质组的构成、功能及生物过程。其中,差异蛋白质组学通过比较特定蛋白质组在不同状态下的差异来探究生理和病理机制,对于理解疾病发展、治疗方法开发和临床生物标志物的发现具有重要意义。蛋白质的功能不仅与具体蛋白质的表达水平和含量密切相关,还与蛋白质间的相互作用和具体结构形式直接相关。目前,差异蛋白质组学研究多采用shotgun（鸟枪法）分析策略,该策略在定性定量方面表现出极高的性能,但在完整蛋白质到肽段的处理过程中不可避免会造成大量蛋白质结构和相互作用的破坏且难以追溯,而这些信息对于全面理解蛋白质组的功能具有重要意义。基于此现状,本文建立了基于一维凝胶电泳-液相色谱-质谱（1DE-LC-MS）系统化分析的差异蛋白质组学研究策略,利用1DE对蛋白结构信息的保留和分离的高效性,及LC-MS/MS在大规模鉴定和定量上的高性能,实现对蛋白组学样品的大规模差异分析,同时获取与蛋白质相互作用及蛋白质降解等结构相关的信息。该策略主要由五步构成:1)非变性PAGE或SDS-PAGE分离样品;2)针对每个样品泳道平行切胶;3)对所有胶粒进行胶内酶解,接以定量LC-MS/MS分析;4)数据分析,得到蛋白质鉴定及定量结果,进行蛋白质含量差异分析;5)重构蛋白质在1DE凝胶泳道上的含量分布谱图（1DE-MS blots）,并进行与相互作用和亚基组成相关联的差异分析。本文分别在非变性1DE和SDS-PAGE情况下,将1DE-LC-MS系统化分析方法应用于人血浆/血清差异和不同时期脑缺血复灌损伤的研究中,在蛋白质含量差异分析的同时挖掘蛋白质结构信息。本文具体的研究内容及结果如下:1.1DE-LC-MS系统化分析方法中关键步骤的建立和优化。首先,通过自制的装置实现了批量梯度PAGE胶制备和平行电泳;其次,根据实际的凝胶尺寸设计平行切胶工具,将凝胶沿电泳方向切成大小均一的小胶粒,并将胶内酶解流程进行了标准化;然后,通过实验明确了凝胶电泳后CBB染色对于1DE-LC-MS系统化分析的有利作用;最后,建立“native 1DE-MS blots”（非变性1DE情况）或“SDS-PAGE-MS blots”（SDS-PAGE情况）进行蛋白质结构信息挖掘。2.结合非变性1DE、平行切胶和定量LC-MS/MS,本文建立了非变性1DE-LC-MS系统化分析方法,并应用于人血浆和血清的差异分析中。在不去除高丰度蛋白质的情况下,成功鉴定了315个蛋白质,其中33个在血浆/血清中的含量存在显着差异（变化倍数?2或?0.5,p?0.05）。除含量差异外,通过比较蛋白质的native 1DE MS-blots,我们还发现许多蛋白质在血浆/血清中结构也不同,这与凝血、补体激活中的多种酶促反应直接相关。3.结合SDS-PAGE、平行切胶和定量LC-MS/MS,本文建立了SDS-PAGE-LC-MS系统化分析方法,并应用于不同时期脑缺血复灌损伤（I/R）大鼠脑皮质蛋白质组的差异研究。此研究设置了I/R模型组（缺血2小时+复灌1天、7天和14天）以及对应假手术对照组,共6个研究组（n=4）,大鼠脑皮质蛋白质经SDS-PAGE分离后,进行全泳道切胶接以定量LC-MS/MS分析。最终鉴定到5621个蛋白质,三个时间点的模型组与对应的假手术组相比较分别有568、755和492个蛋白质发生显着的含量变化（变化倍数?1.5或?0.67,p?0.05）。生物信息学分析提示在缺血复灌损伤的不同时期最突出的改变集中在细胞骨架、突触可塑性、能量代谢、炎症反应和溶酶体五大方面。此外,通过分析蛋白质的SDSPAGE-MS blots,我们发现许多蛋白质存在降解现象,对于理解缺血复灌损伤机理和治疗方法的开发具有重要意义。这是常规差异蛋白质组学方法无法获取的,表明本策略在大规模组学分析上的独特优势。综上所述,本研究建立了基于1DE-LC-MS系统化分析的差异蛋白质组学研究策略并开展了实际应用。常规的shotgun差异蛋白质策略只能获得蛋白质含量差异信息,相比之下我们建立的1DE-LC-MS系统化分析方法不仅可以分析蛋白质的含量差异还能根据1DE-MS blots追溯相关结构信息,如亚基组成、切割或降解、或相互作用等,为全面理解蛋白质的功能及生理病理机制提供更丰富的信息。
胡玲[7]（2020）在《探讨生物信息学筛选的miR216/124靶向CADM2对小鼠再灌注脑损伤细胞凋亡的作用》文中提出背景:缺血性脑卒中是最常见的死亡和致残原因之一,作为严重威胁人们生命安全和生活质量的疾病,该疾病不仅给家庭带来沉重的负担,社会医疗资源也面临严峻的考验。流行病学的调查研究发现该疾病不仅发病率越来越高,而且呈现越来越低龄化的趋势。临床上对于错过溶栓治疗时间窗的该类疾病患者尚无有效精准的治疗策略。因此,深入研究脑卒中发生发展的机制解决临床问题已经成为神经学科亟待解决的重要课题。近年来,随着对该疾病研究的不断深入,miRNA与脑卒中疾病的相关性逐渐被人们认识。在人类基因中,三分之一的基因表达均受到各物种间具有高度保守性miRNA的调控而参与人体重要的生物调节过程如增殖分化,自噬凋亡等。并且,miRNA在脊椎动物中有一半与其他物种还具有同源性。这些特点为挖掘miRNA与疾病之间的关联性提供了基础,而且快速发展的高通量芯片技术为我们在基因组水平研究与疾病相关的分子机制提供了可能性。鉴于此,我们推断（1）鉴于miRNA在细胞内具有广泛的生物学功能,建模的多条miRNAs共同作用在脑卒中损伤级联中必有重要作用,通过研究缺血性脑卒中多条miRNAs的联合功能,开启了研究脑卒中损伤机制的新方式;（2）筛选小鼠脑缺血模型组中半影区与对照组大脑相同部位miRNA的表达谱,借助生物信息学技术进行数据建模并挖掘出脑缺血相关的特异性表达的miRNAs具有可行性;（3）通过构建miRNAs/mRNA共表达网络、基因位点GO分析和KEGG通路分析及双荧光素酶报告实验系统探讨脑组织缺血区差异表达的基因在脑卒中的机制为发现新的治疗靶点奠定理论基础。目的:本研究利用芯片大数据和先进的数据处理分析方法来建立可靠的脑卒中相关的miRNAs（miR-124/miR-216）关联模型,在此基础上利用生物信息学技术进行系统分析并探讨miRNAs联合体和靶基因的功能定位及与脑卒中发生发展的关联意义;同时运用分子生物学、细胞生物学等技术手段在分子水平、细胞水平、动物水平上揭示mi R-216、miR-124与CADM2之间的相互作用及分子机制,并探索两者之间的相互关系在脑卒中发生发展中的调控作用,进一步完善脑卒中发生发展的分子机制,为临床上脑卒中的防治提供新的治疗靶标。方法:1.第一部分下载GEO数据库中脑缺血再灌注损伤小鼠的miRNAs的芯片数据并对数据进行分析整理;运用Weka软件筛选获得的差异表达基因并构建意义miRNAs协同调控脑卒中进展相关的数据模型;应用生物信息软件挖掘miRNAs的靶基因并采用荧光素酶报告实验验证miRNAs与靶基因的关系。2.第二部分体外构建OGD模型;转染miRNAs的激动剂和抑制剂至各实验组并用CCK-8实验、流式细胞分析技术、基质胶成管实验、PCR法及Western blot检测并分析生物学效应。3.第三部分构建小鼠的MCAO模型获取最佳造模时间;构建慢病毒;利用miRNAs的慢病毒处理各实验组同时进行神经功能评分,TTC,Tunel法,PCR法及Western blot法分别检测及分析细胞凋亡率及基因和蛋白表达等相关生物学效应。结果:1.通过基因芯片数据分析处理获得包括miR-216和miR-124在内的30条与小鼠缺血再灌注损伤相关的差异表达miRNAs;通过体外建模挖掘与脑卒中疾病相关的目标miRNAs（miR-124/miR-216）及潜在作用的共同靶基因CADM2,并且进行了潜在的作用通路和功能分析发现目标miRNAs（miR-124/miR-216）调控靶基因CADM2可能影响脑卒中的进展过程。2.采用小鼠N2a细胞行氧糖剥夺（OGD）处理,在此基础上分别转染和共转染外源性miR-216与miR-124的激动剂和抑制剂予各组检测细胞存活率、细胞凋亡率、成管能力以及相关凋亡通路蛋白表达的表达情况。我们发现mi R-216与miR-124的高表达能增加细胞的存活率,抑制细胞凋亡的发生;当共转染miR-216与miR-124的激动剂后能更显着抑制与脑卒中模型细胞关系密切细胞的凋亡。3.成功构建慢病毒后,基于MCAO模型并转染过表达miR-216/miR-124的慢病毒载体,我们发现转染过表达病毒的小鼠神经功能评分较好,凋亡较少,过表达miR-216/124的小鼠靶基因CADM2降低明显,差异有统计学意义。结论:通过公共数据库的数据挖掘和分析获知30条miRNAs与小鼠缺血再灌注损伤相关的差异表达miRNAs。在此基础上用生物软件建模获悉到意义模型miR-124/miR-216协同调控脑卒中的进展过程,其调控的机制可能与共同靶基因CADM2启动凋亡信号通路相关。从细胞实验和动物实验我们进一步论证发现miR-216/miR-124联合体协同参与调控缺血再灌注小鼠的神经细胞功能,其机制为miR-216/miR-124协同负性调控CADM2使其激活PI3K-Akt信号通路,启动了内源性保护机制改善神经细胞的凋亡,从而达到保护神经细胞的作用。在这里,我们首次利用大数据挖掘和建模发现miRNA-216与miRNA-124能作为脑卒中进展相关的分子标志物模型协同调控其病理过程,并揭示了miRNA-216与miRNA-124以及CADM2之间构成的新的调控脑卒中的分子网络。通过三者的相互作用激活PI3K-Akt信号通路进而启动内源性的脑保护作用,miR-216/miR-124/CADM2/PI3K-Akt信号通路的揭示均是本研究的创新。
蒋伟[8]（2020）在《ENO1和Syt1在缺血性脑神经损伤的作用及其调控机制》文中认为脑卒中是目前致残率第一、致死率第三的神经疾病,但是脑卒中神经元死亡的分子机制并不完全清楚。本论文具体研究内容如下:（1）论文第2章提取局部脑缺血3 h的小鼠脑匀浆,与对照组小鼠脑匀浆做SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色,在蛋白分子大小48 k Da左右,缺血组蛋白条带与对照组蛋白条带相比较明显减弱,结合质谱分析仪对切下来的特异条带进行质谱分析,Enolase 1（ENO1）蛋白在缺血组相比较对照组显着降低。为进一步验证ENO1在脑缺血过程中的变化,构建脑缺血1-3 h的小鼠,提取缺血区域脑匀浆用ENO1抗体进行免疫印迹杂交,在缺血早期1 h,ENO1蛋白表达水平明显上调,在脑缺血2-3 h,ENO1蛋白表达水平逐渐下调,在缺血3 h时间点,ENO1蛋白相对于对照组蛋白下降了50%左右。ENO家族有4个基因成员,提取成年C57小鼠脑、肾及肝的m RNA,反转录为CDNA,针对ENO1-4成员基因设计引物进行PCR扩增,数据显示ENO1在脑、肾及肝等组织广泛表达。为鉴定ENO1在小鼠脑不同区域及不同发育阶段的表达模式,提取成年C57小鼠的溴球、皮层、海马、脑干和小脑的m RNA和蛋白质,分别用RT-PCR和免疫印迹检测,ENO1在脑的溴球、皮层、海马、脑干和小脑都表达。提取0天、7天、14天、28天、56天小鼠的m RNA和蛋白质,用RT-PCR和免疫印迹检测,ENO1在小鼠脑发育过程中表达水平逐渐升高。小鼠脑除了神经元还有胶质细胞等其他类型细胞,为鉴定ENO1在神经元中的表达及定位,原代培养的海马神经元培养至第14天提取总蛋白质,用ENO1抗体进行免疫印迹,数据显示ENO1蛋白在神经元中表达,同时培养的海马神经元第10天,磷酸钙转染GFP质粒标记神经元,第14天用ENO1抗体免疫染色,数据表明ENO1定位神经元胞体及树突。（2）论文第3章为体外验证ENO1蛋白在脑缺血中发挥的功能,原代培养的海马神经元进行缺氧缺糖刺激（Oxgen-Glucose Deprivation,OGD）,在细胞水平模拟脑卒中。原代培养的小鼠海马神经元第14天缺氧缺糖处理1-3 h,提取蛋白质用ENO1抗体进行免疫印迹,在海马神经元缺氧缺糖刺激1 h或2 h,ENO1蛋白表达水平上调,在海马神经元缺氧缺糖刺激3 h,ENO1蛋白表达水平下调,体外数据显示ENO1呈现出动态变化,与体内数据趋势一致。为确认ENO1在缺氧缺糖刺激过程中的定位变化,海马神经元缺氧缺糖刺激2-6 h后用ENO1抗体免疫染色,数据显示ENO1在缺氧缺糖刺激过程中,胞浆中的ENO1也呈现出动态变化。在神经元中过表达PLX304-ENO1-V5质粒,缺氧缺糖刺激观察过表达ENO1蛋白的神经元与对照组神经元的损伤情况,在原代培养的海马神经元第10天用磷酸钙转染GFP质粒或GFP质粒和ENO1质粒,第14天过表达GFP或过表达ENO1组均未改变神经元的形态,缺氧缺糖刺激1 h或2 h,对照组神经元树突的长度比过表达ENO1的神经元树突长度短,对照组神经元树突棘的密度比过表达ENO1的神经元树突棘密度更低,这些数据显示,在缺氧缺糖进程中ENO1缓解神经元树突及树突棘损伤。ENO1催化产物PEP含量在小鼠脑缺血模型中呈现动态变化。培养的海马神经元添加PEP化学物质可缓解缺氧缺糖神经元损伤,立体注射PEP化学物质可降低脑缺血导致的神经元死亡。ENO1基因敲除的秀丽隐杆线虫缺氧饥饿存活率与野生型N2线虫缺氧饥饿存活率相比较没有差异。（3）论文第4章构建小鼠局部脑缺血2 h,对海马组织进行蛋白质组学和磷酸化组学分析,蛋白质组学鉴定28个蛋白发生显着性表达水平变化,磷酸化组学鉴定873个肽段磷酸化修饰显着变化,磷酸化修饰上调为135个蛋白的184个肽段,磷酸化修饰下调为420个蛋白的689个肽段。转录组学鉴定415个基因显着上调,222个基因显着下调。磷酸化组学数据进行KEGG信号通路分析,主要富集在谷氨酸突触、多巴胺突触、胞吞和突触囊泡循环。突触前囊泡调控关键蛋白synaptotagmin-1（syt1）的T112位点磷酸化修饰促进神经元缺氧缺糖损伤。小鼠syt1的秀丽隐杆线虫同源蛋白SNT-1缺失突变体表现出缺氧饥饿耐受性。（4）论文第5章用核酸适体筛选脑缺血标记蛋白,构建脑缺血早期4h小鼠模型,以缺血同侧脑片为阳性筛选脑片,以脑缺血对侧脑片为阴性筛选脑片,经过十轮筛选富集,鉴定得到核酸适体LCW17可以稳定结合脑缺血同侧脑片。（5）论文第6章用核酸适体LCW17与脑匀浆免疫共沉淀、考马斯亮蓝染色和质谱分析,核酸适体LCW17的靶蛋白是Vigilin蛋白,核酸适体LCW17与重组蛋白Vigilin-his直接相互作用,亲和力分析实验显示核酸适体LCW17与重组蛋白Vigilin-his的结合Kd数值为25 n M左右。构建脑缺血早期梯度时间点,脑缺血时间越长,核酸适体LCW17结合脑缺血同侧脑片的数量越多,核酸适体LCW17可以用于评估脑缺血程度。原代培养的海马神经元缺氧缺糖处理,随着缺氧缺糖时间的增加,神经元分泌的Vigilin蛋白增多。立体注射核酸适体LCW17到脑缺血脑内,核酸适体LCW17在脑缺血同侧结合能力显着高于脑缺血对侧,核酸适体LCW17可以进行小鼠脑缺血体内应用。综上,本论文用小鼠构建脑缺血动物模型,蛋白质组学鉴定ENO1蛋白参与脑缺血进程,用脑卒中体外细胞模型系统,发现ENO1在缺氧缺糖的病理发生过程中,降低神经元树突及树突棘损伤,从而为理解和治疗脑卒中疾病提供了一种新的途径。磷酸化组学鉴定突触前囊泡调控关键蛋白syt1的T112位点磷酸化修饰促进神经元缺氧缺糖损伤。小鼠syt1的秀丽隐杆线虫同源蛋白SNT-1缺失突变体表现出缺氧饥饿耐受性。基于缺血脑切片的核酸适配体筛选技术能够有效用于脑缺血疾病靶标与探针的发现,核酸适配体LCW17和Vigilin蛋白对于脑卒中疾病发生机制的研究以及疾病的诊断具有重要的意义。
赵旭[9]（2016）在《食蟹猴局灶性脑缺血的组织及血浆蛋白质组学分析》文中提出缺血性脑卒中是死亡率最高的第三大疾病。目前,关于脑卒中的大多数研究还在大鼠模型上进行;而啮齿类动物和人类的生理、病理差别较大,并且大部分组学研究都没有单独分析细胞核及线粒体蛋白质组。本文采用基于n LC-MS/MS的鸟枪法蛋白组学研究方法,对灵长类动物疾病模型——局灶性脑缺血食蟹猴的脑组织和血浆中的蛋白进行测定,并对涉及不同生物学进程的相关蛋白进行了鉴定和分析。研究内容主要如下:使用灵长类动物食蟹猴构建局灶性脑缺血疾病模型,于缺血4 h收集梗死区、半影区及正常区的脑组织以及缺血4 h和再灌注0.5 h的血浆。建立基于阳离子交换的蛋白分级方法和基于LC-MS/MS的蛋白鉴定方法。1)分析比较了梗死区及正常区组织细胞线粒体及细胞核蛋白质组。对线粒体中有关有氧呼吸、产能代谢及细胞调控的蛋白进行分类;对细胞核中有关炎症、细胞凋亡的蛋白进行了分类比较。2)分析梗死区、半影区、正常区脑组织细胞浆中的蛋白。通过对物质代谢相关蛋白的分类比较,寻找不同缺血状态下物质代谢的差异;通过对炎症、凋亡相关蛋白及转录调节因子的比较,寻找不同区域的差异。3)分析了缺血4 h及再灌注0.5 h的血浆样本,寻找其中的脑特异性蛋白,并与临床的发现进行比较。结果:1)在梗死区线粒体及细胞核中分别鉴定到19、21个蛋白,而在正常区中的线粒体和细胞核中各鉴定到21、16个蛋白;2)梗死区、半影区、正常区的胞浆中分别鉴定到178、133、282个蛋白,梗死区中有关糖代谢的蛋白鉴定数量下降,而脂质代谢的蛋白数量上升,梗死区中有关炎症、凋亡的蛋白数量最高,半影区中转录调节因子的鉴定数量最高;3)缺血4 h血浆样品中鉴定到4个脑特异蛋白（LanC-like蛋白2、NELL-蛋白激酶C结合蛋白、微管蛋白β-2A、β-突触核蛋白）,再灌注0.5 h血浆样品中鉴定到6个脑特异蛋白（神经分泌蛋白VGF、G protein regulated inducer of neurite outgrowth3、Synembryn B蛋白、小脑退行相关蛋白1、髓鞘脂碱性蛋白、Tau微管蛋白激酶）。结论:通过使用灵长类动物模型,研究了缺血性脑卒中疾病的分子机制,初步发现了在不同生理、病理状态下,脑组织物质能量代谢、免疫炎症反应及细胞凋亡过程的差异。通过对血浆蛋白质组学的分析研究,发现了多个蛋白可以作为脑缺血疾病的生物标志物。本研究为后续实验建立了方法,但其结果尚需要进一步实验进行验证。
陈谨[10]（2016）在《大鼠大脑局灶性缺血再灌注损伤病理机制及STV保护作用的研究》文中指出脑缺血再灌注损伤是一种极为复杂的病理生理过程,涉及到很多种机制,如自由基的生成、兴奋性氨基酸的毒性作用、细胞内钙离子浓度超载等,彼此构成一个互相促进的复杂网络。尽管对脑缺血再灌注损伤机制的研究在不断深入和发展,但是脑缺血再灌注损伤各种机制的枢纽点/交汇点尚不明确,有待于更深入地研究。为了探究缺血/再灌注损伤早中晚期所涉及的级联发病机制及探讨STV对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及其相关的保护机制。我们运用改良Longa线栓法建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤（middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R）模型。采用无创伤的激光多普勒血流仪实施实时的检测,分析大鼠造模前后血流变化值,确保模型构建的可靠性。实时监控大鼠的心率、呼吸频率、血氧饱和度及体温等各项生理指标,排除手术之外的其他因素对动物模型构建造成的影响。对各分组大鼠进行行为学评分。应用脑切片氯化三苯基四氮唑（TTC）染色,最直观的评判脑梗死模型构建的成功与否,同时利用Image J软件来计算梗死面积,表观的衡量STV对脑梗死面积的改善作用。为了探究脑组织蛋白合理有效的分离体系,我们利用不同浓度（10%T,2.6%C或12%T,2.6%C或15%T,2.6%C）十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶和4.2%-17.85%T（线性梯度）,5%C（交联度）十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）为分离系统。利用Western blot蛋白印迹技术检测Thioredoxin 1（Trx1）蛋白、Peroxiredoxin 2（Prx2）蛋白和Heat shock protein 60 kDa（Hsp60）蛋白分别在各组相对应的缺血2 hours/再灌注0 hour/6 hours/22hours/168 hours时间点的表达量,探究STV是否具有神经保护作用及其相关的可能机制。我们成功构建了大鼠脑缺血/再灌注模型,应用脑组织切片的氯化三苯基四氮唑（TTC）染色来评估脑梗死面积,发现STV组跟阳性对照组大鼠的脑梗死面积比手术组减小,同时对于缺血2 hours/再灌注22 hours这个时间点的模型,STV组大鼠比阳性对照大鼠的脑梗死面积大,但是对于缺血2 hours/再灌注168 hours这个时间的模型,STV组大鼠比较阳性对照大鼠的脑梗死面积有所减小。这从一定的程度上说明了,STV对脑缺血组织具有一定的保护作用,且它的长期保护作用更为明显,作用效果强于阳性对照药依达拉奉。我们试验了几种不同浓度（10%T,2.6%C或12%T,2.6%C或15%T,2.6%C）的SDS-PAGE和4.2%-17.85%T（线性梯度）,5%C（交联度）SDS-PAGE,最终发现4.2%-17.85%T,5%C的SDS-PAGE对大鼠脑组织蛋白有较好的分离效果。免疫印迹结果表明在缺血2 hours/再灌注0 hour及6 hours时,STV给药组Hsp60表达量减少,说明STV在脑缺血早期能减少脑组织的应激反应。在缺血2 hours/再灌注22 hours,STV组Prx2的表达量明显升高和缺血2 hours/再灌注168 hours模型,Trx1的表达量明显升高,且其表达量也高于阳性对照组。说明Prx2在脑缺血中后期发挥良好的抗氧化作用,防止自由基对脑组织的损害。Trx1在脑缺血后期发挥良好的抗氧化和抗凋亡作用,防止神经元细胞的死亡。在缺血2 hours/再灌注22 hours时,STV组的Prx2的表达量高于同一时期Trx1的表达,说明在缺血2 hours/再灌注22 hours时,STV主要是通过上调Prx2的表达来发挥抗氧化作用。在缺血2 hours/再灌注168 hours时,STV主要是通过上调Trx1的表达来发挥抗凋亡作用。实验结果表明,在脑缺血再灌注损伤的不同时期,STV启动不同的信号通路来保护脑组织。除了上述的工作外,我们还进行了以下的工作。我们结合非变性微型二维凝胶电泳,网格凝胶切取以及定量液相色谱串联质谱（获取数据非依赖型模式,MSE）,用来构建数字化非变性蛋白质谱图,同时,为了改进此研究模式,我们采用了新的质谱串联模式,采用了增强离子淌度分离的数据非依赖模式串联质谱（HDMSE模式）,并将此模式运用到人类血浆蛋白质分析的工作中。即人类血浆样品经过非变性微型二维凝胶电泳分离,将得到的低密度脂蛋白（LDL）所在的长方形区域（18 mm×4.8 mm）切割成72块方形胶粒并将胶粒经过一系列处理后进行定量的液相色谱串联质谱分析（LC-MS/MS）。所得的结果显示,与MSE相比,HDMSE表现出更好的分析性能,鉴定所得蛋白质种类数目提高了约50%,并且每种蛋白质在更多的胶粒中被检测到,即对每种蛋白质得到了更全面的谱图。运用LC-HDMSE,共检测出253种蛋白质,根据每种蛋白质的含量分布信息我们重构了非变性蛋白质谱图。从谱图中,我们可以看到,载脂蛋白B-100（Apo B-100）在凝胶切取区域是含量最丰富的蛋白质,主要分布区域在pI 5.1-6.1,表观分子量在约1000 kDa,即其所在的位置在编号为39-42相对应的四块胶粒中。用我们编写的Excel宏程序去检索蛋白质谱图,结果表明蛋白质的含量峰值落在Apo B-100的集中区域。在252个蛋白质中有22个蛋白质符合此标准,且这22个蛋白质中有19个蛋白质被报道跟LDL相关。这个方法仅仅需要几微升的血浆样品,且蛋白质的分离原理与常用的超速离心法完全不同。这个方法所得到的结果将会使我们对LDL的结构和功能有更深程度的理解。
二、脑缺血相关蛋白质的鉴定和功能研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、脑缺血相关蛋白质的鉴定和功能研究（论文提纲范文）
（1）额尔敦-乌日勒的活性成分分析及其对小胶质细胞基因调控作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 额尔敦-乌日勒的简介 |
| 1.1.1 额尔敦-乌日勒历史沿革 |
| 1.1.2 额尔敦-乌日勒研究进展 |
| 1.1.3 额尔敦-乌日勒所含单药化学成分的国内外研究进展 |
| 1.2 脑卒中简介 |
| 1.2.1 脑卒中分类及病因 |
| 1.2.2 缺血性脑卒中的主要病理生理机制 |
| 1.2.3 治疗脑卒中的策略 |
| 1.3 小胶质细胞简介 |
| 1.3.1 小胶质细胞简介 |
| 1.3.2 小胶质细胞的极化 |
| 1.3.3 小胶质细胞极化与信号通路 |
| 1.3.4 小胶质细胞与其它神经细胞的相互作用 |
| 1.3.5 作用于小胶质细胞的药物 |
| 1.4 中草药的研究方法及进展 |
| 1.5 立题依据及主要研究内容 |
| 1.5.1 立题依据 |
| 1.5.2 主要研究内容 |
| 1.5.3 创新性 |
| 第二章 额尔敦-乌日勒对大鼠大脑中基因表达调控作用及其活性成分的分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 主要试剂与耗材 |
| 2.2.3 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 动物饲养 |
| 2.3.2 MCAO模型 |
| 2.3.3 治疗组 |
| 2.3.4 收集样品,提取RNA和 RNA-seq |
| 2.3.5 序列过滤、比对和组装(Assembly) |
| 2.3.6 差异表达分析 |
| 2.3.7 EW的提取方法 |
| 2.3.8 建立数据库 |
| 2.3.9 UPLC-QTof-MS分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 治疗后MCAO/R模型大鼠的神经功能评估 |
| 2.4.2 Illumina测序和参考基因组比对 |
| 2.4.3 EW处理后差异基因表达 |
| 2.4.4 EW-1 中神经活性成分分析 |
| 2.4.5 EW-2 中神经活性成分分析 |
| 2.4.6 EW-3 中神经活性成分分析 |
| 2.4.7 EW-4 中神经活性成分分析 |
| 2.4.8 EW-5 中神经活性成分分析 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 额尔敦-乌日勒中活性小分子对小胶质细胞分泌的促炎型细胞因子的转录调控作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 细胞品系 |
| 3.2.3 主要试剂耗材 |
| 3.2.4 仪器设备 |
| 3.2.5 引物 |
| 3.2.6 主要试剂的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 样品的提取制备 |
| 3.3.2 HPLC半制备分离 |
| 3.3.3 UPLC-QTof-MS分析 |
| 3.3.4 小鼠原代小胶质细胞的分离及培养 |
| 3.3.5 BV2 小胶质细胞培养 |
| 3.3.6 EW对小胶质细胞表达的促炎因子的影响 |
| 3.3.7 实时荧光定量PCR |
| 3.3.8 统计学分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 EW不同溶剂提取物对Cxcl10 表达的下调作用 |
| 3.4.2 EW-5 半制备馏分的UPLC分析及其对促炎因子表达的下调作用 |
| 3.4.3 F4 半制备馏分的UPLC分析及其对促炎因子表达的下调作用 |
| 3.4.4 F4-6 中生物活性化学物质的分析及鉴定 |
| 3.4.5 木香烃内酯对小胶质细胞释放的促炎因子表达的影响 |
| 3.4.6 肉豆蔻醚对小胶质细胞释放的促炎因子表达的影响 |
| 3.4.7 土木香内酯对小胶质细胞中促炎因子表达的影响 |
| 3.4.8 亚麻酸对小胶质细胞中促炎因子表达的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 额尔敦-乌日勒中活性小分子土木香内酯和去氢二异丁香酚抑制小胶质细胞NF-κB信号通路 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 细胞品系 |
| 4.2.2 主要试剂与耗材 |
| 4.2.3 主要仪器 |
| 4.2.4 引物 |
| 4.2.5 抗体 |
| 4.2.6 主要试剂的配置 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 样品的提取制备 |
| 4.3.2 UPLC-QTof-MS法对F4-6 定性分析 |
| 4.3.3 UPLC-QTof-MS法对F4-6中Ala和 Deh进行定量分析 |
| 4.3.4 细胞培养 |
| 4.3.5 细胞毒性测定 |
| 4.3.6 N2a细胞的细胞增值活力和神经突触生长测定 |
| 4.3.7 提取总RNA和 RT-q PCR |
| 4.3.8 蛋白免疫印迹(Western blot) |
| 4.3.9 统计学分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 EW提取物中活性分子的Ala和 Deh的定性 |
| 4.4.2 F4-6 抑制LPS刺激的BV2 细胞促炎因子的表达 |
| 4.4.3 F4-6 促进BV2 细胞LPS刺激后抗炎基因表达 |
| 4.4.4 F4-6 的神经保护作用 |
| 4.4.5 F4-6对LPS诱导的BV2 细胞中NF-κB信号通路激活的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 天然产物小分子土木香内酯和去氢二异丁香酚对小胶质细胞基因表达的联合调控作用 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 细胞品系 |
| 5.2.2 主要试剂与耗材 |
| 5.2.3 主要仪器 |
| 5.2.4 引物 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 细胞培养 |
| 5.3.2 提取RNA和文库构建 |
| 5.3.3 序列过滤、比对和组装 |
| 5.3.4 差异表达分析 |
| 5.3.5 差异表达基因的GO和 KEGG富集分析 |
| 5.3.6 实时荧光定量PCR |
| 5.3.7 统计学分析 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 Illumina测序和参考基因组比对 |
| 5.4.2 Ala、Deh和 Mix处理后的差异表达基因 |
| 5.4.3 DEG的GO富集分析 |
| 5.4.4 DEG的 KEGG代谢通路富集分析 |
| 5.4.5 通过RT-qPCR验证DEG数据 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录一 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表的学术论文 |
（2）丹参酮ⅡA磺酸钠调控HIF1α/mTOR介导细胞自噬干预缺血性脑卒中的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 缺血性脑卒中和自噬的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 丹参脂溶性成分及其干预缺血性脑卒中的机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第二部分 临床文献研究 |
| 研究一 丹参类中药注射液治疗急性缺血性脑卒中的网状Meta分析 |
| 1 资料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 实验研究 |
| 研究二 基于网络药理学探讨丹参治疗缺血性脑卒中的作用机制 |
| 1 资料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究三 丹参酮ⅡA磺酸钠注射液治疗脑缺血再灌注的药效研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究四 基于DIA和PRM技术丹参酮ⅡA磺酸钠干预MCAO/R模型大鼠缺血半影区蛋白组学分析 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究五 丹参酮ⅡA磺酸钠对PC12细胞氧糖剥夺/复氧模型的效应及机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（3）芫根对局灶性脑缺血缺氧损伤的保护作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 脑卒中 |
| 1.1.1 脑卒中概述 |
| 1.1.2 脑卒中发病机制 |
| 1.1.3 缺血性脑卒中的治疗现状 |
| 1.1.4 缺血性脑卒中的膳食预防 |
| 1.2 芫根 |
| 1.2.1 芫根概述 |
| 1.2.2 芫根的药理功效 |
| 1.3 研究目的及意义 |
| 1.4 研究框架及内容 |
| 1.4.1 研究框架 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 第二章 芫根对脑缺血小鼠的神经保护作用初探 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与仪器 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 试剂与材料 |
| 2.2.3 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 芫根液的提取 |
| 2.3.2 MCAO/R模型 |
| 2.3.3 行为学测试 |
| 2.3.4 脑损伤评估 |
| 2.3.5 细胞培养 |
| 2.3.6 糖氧剥夺/再灌注模型 |
| 2.3.7 细胞存活率测定 |
| 2.3.8 乳酸脱氢酶测定和活性氧测定 |
| 2.3.9 抗氧化酶活性检测 |
| 2.3.10 统计分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 TET干预对MCAO/R小鼠行为学的影响 |
| 2.4.2 TET干预对MCAO/R小鼠脑萎缩体积的影响 |
| 2.4.3 OGD不同时间对HT22 细胞活性的影响 |
| 2.4.4 TET干预抑制OGD/R诱导的氧化损伤 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 芫根各萃取相对神经元细胞糖氧剥夺损伤的保护作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.2.1 试剂与材料 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 芫根各萃取相的分离 |
| 3.3.2 细胞培养 |
| 3.3.3 糖氧剥夺/再灌注模型 |
| 3.3.4 细胞存活率测定 |
| 3.3.5 乳酸脱氢酶测定和活性氧测定 |
| 3.3.6 抗氧化酶活性检测 |
| 3.3.7 统计分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 TET不同萃取相对正常HT22 细胞活力的影响 |
| 3.4.2 TET不同萃取相对OGD/R细胞活力的影响 |
| 3.4.3 TET不同萃取相对OGD/R细胞LDH水平的影响 |
| 3.4.4 TET不同萃取相对OGD/R细胞ROS水平的影响 |
| 3.4.5 TET不同萃取相对OGD/R细胞氧化应激损伤的影响 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 芫根水相对缺血缺氧损伤的保护作用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与仪器 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 试剂与材料 |
| 4.2.3 主要仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 芫根水相的提取 |
| 4.3.2 MCAO/R模型 |
| 4.3.3 行为学测试 |
| 4.3.4 脑损伤评估 |
| 4.3.5 细胞培养 |
| 4.3.6 糖氧剥夺/再灌注模型 |
| 4.3.7 细胞存活率测定 |
| 4.3.8 乳酸脱氢酶测定和活性氧测定 |
| 4.3.9 免疫荧光 |
| 4.3.10 蛋白质印迹法 |
| 4.3.11 统计分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 AET干预对MCAO/R小鼠行为学的影响 |
| 4.4.2 AET干预对MCAO/R小鼠脑萎缩体积的影响 |
| 4.4.3 AET干预对OGD/R细胞线粒体的影响 |
| 4.4.4 AET干预对PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响 |
| 4.4.5 LY294002 逆转AET对 OGD/R细胞的保护作用 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 芫根水相的分离纯化与鉴定 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与仪器 |
| 5.2.2 试剂与材料 |
| 5.2.3 主要仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 芫根水相的逐级分离 |
| 5.3.2 细胞培养 |
| 5.3.3 糖氧剥夺/再灌注模型 |
| 5.3.4 活性氧测定 |
| 5.3.5 核磁分析 |
| 5.3.6 统计分析 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 AET中 part1-part3对OGD/R细胞中 ROS的影响 |
| 5.4.2 Part2中part(1)-part(4)的分离结果及对OGD/R细胞中ROS的影响 |
| 5.4.3 Part(1)中 part A-part D的分离结果及对OGD/R细胞中 ROS的影响. |
| 5.4.4 Part A中 part E-part G的分离结果及对OGD/R细胞中 ROS的影响 |
| 5.4.5 AET-1 的分离纯化与鉴定 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 芫根水相中有效单体AET-1 对缺血缺氧损伤的保护作用 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与仪器 |
| 6.2.1 试剂与材料 |
| 6.2.2 主要仪器 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 芫根单体AET-1 的制备 |
| 6.3.2 细胞培养 |
| 6.3.3 糖氧剥夺/再灌注模型 |
| 6.3.4 细胞存活率测定 |
| 6.3.5 乳酸脱氢酶测定和活性氧测定 |
| 6.3.6 抗氧化酶活性检测 |
| 6.3.7 免疫荧光 |
| 6.3.8 蛋白质印迹法 |
| 6.3.9 统计分析 |
| 6.4 结果与讨论 |
| 6.4.1 AET-1 干预抑制OGD/R诱导的氧化损伤 |
| 6.4.2 AET-1 干预对OGD/R细胞线粒体的影响 |
| 6.4.3 AET-1 干预对PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响 |
| 6.4.4 LY294002 逆转AET-1对OGD/R细胞的保护作用 |
| 6.4.5 AET-1 干预抑制OGD/R诱导的神经元凋亡 |
| 6.5 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
（4）三七皂苷R1对局灶性脑缺血损伤大鼠急性期保护作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 理论研究 |
| 1 缺血性中风急性期主要的病理生理改变 |
| 1.1 血脑屏障破坏 |
| 1.2 线粒体能量代谢异常及细胞凋亡 |
| 1.3 激活内源性神经再生 |
| 2 缺血性中风急性期的中医认识 |
| 3 缺血性中风急性期的干预策略 |
| 3.1 溶栓与取栓 |
| 3.2 神经保护 |
| 3.3 中医药角色 |
| 第二部分 实验研究 |
| 1 大鼠局灶性脑缺血损伤模型的建立 |
| 2 三七皂苷R1对缺血性中风急性期大鼠血脑屏障的保护 |
| 3 三七皂苷R1对缺血性中风急性期大鼠脑内能量代谢的改善 |
| 4 三七皂苷R1促进缺血性中风大鼠海马区神经再生 |
| 5 三七皂苷R1干预下的大鼠脑缺血组织蛋白组学初探 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（5）TIPARP在转录组和蛋白组水平上对星形胶质细胞的调控（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 脑卒中概述 |
| 2 星形胶质细胞与脑卒中 |
| 2.1 星形胶质细胞 |
| 2.2 星形胶质细胞活化与脑卒中 |
| 3 PARP家族与脑卒中 |
| 3.1 聚ADP-核糖基化(Poly-ADP-ribosylation,PAR) |
| 3.2 PARP家族蛋白的结构与活性 |
| 3.3 PARP与脑卒中 |
| 4 TIPARP与脑卒中 |
| 4.1 TIPARP的结构和功能 |
| 4.2 circRNA-TIPARP通路与脑卒中 |
| 5 高通量基因分析方法 |
| 6 前景与展望 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器与耗材 |
| 1.4 试剂的配制 |
| 2 实验方法 |
| 第三章 实验结果 |
| 1 蛋白质组 |
| 1.1 真核表达载体的筛选,慢病毒测试 |
| 1.2 免疫共沉淀,蛋白质谱测序鉴定 |
| 1.3 蛋白质鉴定结果以及定量统计 |
| 2 转录组 |
| 2.1 TIPARP慢病毒在A172 细胞中过表达程度评估 |
| 2.2 TIPARP过表达条件下基因表达谱的RNA-Seq分析 |
| 第四章 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）基于1DE-LC-MS系统化分析的差异蛋白质组学研究策略的建立与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 蛋白质组学概述 |
| 1.2 蛋白质组学的主要研究策略 |
| 1.2.1 Top-down蛋白质组学策略 |
| 1.2.2 Bottom-up蛋白质组学策略 |
| 1.2.3 Hybrid(基于凝胶)蛋白质组学策略 |
| 1.3 定量与差异蛋白质组学 |
| 1.3.1 同位素标记的定量蛋白质组学 |
| 1.3.2 非标记定量蛋白质组学 |
| 1.4 研究背景、内容和意义 |
| 1.4.1 研究背景 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 1.4.3 研究意义 |
| 第二章 1DE-LC-MS系统化分析的差异蛋白质组学方法的流程建立和条件优化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 实验仪器与试剂 |
| 2.2.3 相关溶液配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 平行梯度凝胶制备 |
| 2.3.2 平行凝胶电泳 |
| 2.3.3 平行切胶 |
| 2.3.4 标准化胶内酶解 |
| 2.3.5 CBB染色的必要性探究 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 平行制胶、平行电泳、平行切胶和标准化酶解流程的建立 |
| 2.4.2 CBB染色对简单样品1DE-LC-MS分析的影响 |
| 2.4.3 CBB染色对复杂样品1DE-LC-MS/MS系统化分析的影响 |
| 2.4.4 蛋白质native1DE-MS-blots或 SDS-PAGE-MS blots的构建 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 非变性1DE-LC-MS系统化差异蛋白质组学分析方法的建立及在人血浆/血清研究中的应用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.2.1 实验仪器与试剂 |
| 3.2.2 相关溶液配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 人血浆和血清样品准备 |
| 3.3.2 人血浆和血清蛋白的非变性一维凝胶电泳 |
| 3.3.3 平行全泳道网格凝胶切取、胶粒编号及表观分子量评估 |
| 3.3.4 胶内酶解及Nano LC-MS/MS数据采集 |
| 3.3.5 质谱数据分析 |
| 3.3.6 Western blot实验 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 结合非变性PAGE分离,全泳道切胶和定量LC-MS/MS分析结果 |
| 3.4.2 总蛋白native1DE-MS blots反应整体蛋白分布 |
| 3.4.3 蛋白质native1DE-MS blots反应蛋白质结构信息 |
| 3.4.4 血浆和血清蛋白native1DE-MS blots的比较 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 SDS-PAGE-LC-MS系统化差异蛋白质组学分析方法建立及在脑缺血复灌损伤研究中的应用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与仪器 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 实验仪器与试剂 |
| 4.2.3 相关溶液配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 局灶性大鼠脑缺血复灌损伤模型构建 |
| 4.3.2 动物分组及实验设计 |
| 4.3.3 动物模型成功性验证 |
| 4.3.4 大鼠脑皮质蛋白质组学分析 |
| 4.3.5 Western blot蛋白验证 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 大鼠脑缺血复灌损伤模型验证结果 |
| 4.4.2 大鼠脑皮质蛋白质组数据整体评估 |
| 4.4.3 大鼠脑皮质蛋白质组的差异变化蛋白及Western blot验证 |
| 4.4.4 蛋白质SDS-PAGE-MS blots反应蛋白质结构信息 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 创新之处 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（7）探讨生物信息学筛选的miR216/124靶向CADM2对小鼠再灌注脑损伤细胞凋亡的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 非编码RNA与脑卒中的关系及研究进展 |
| 1.3 本课题的研究内容 |
| 技术路线图 |
| 第2章 大脑中动脉闭塞小鼠的MIRNAS芯片数据挖掘建模及数据验证 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 选用数据库下载脑卒中相关的mi RNAs芯片数据 |
| 2.2.2 mi RNAs数据分析及建模软件 |
| 2.2.3 筛选mi RNAs的靶基因及富集分析软件 |
| 2.2.4 双荧光素酶报告验证实验的材料 |
| 2.3 研究方法与内容 |
| 2.3.1 下载缺血性脑卒中基因芯片数据及预处理 |
| 2.3.2 脑卒中进展相关的意义mi RNAs数据建模 |
| 2.3.3 脑卒中差异表达mi RNAs的靶基因预测及生物信息学分析 |
| 2.3.4 双荧光素酶实验验证建模的意义mi RNAs与靶标基因的关系 |
| 2.4 研究结果 |
| 2.4.1 标准化处理脑卒中进展相关的mi RNAs芯片数据 |
| 2.4.2 脑卒中进展相关的意义miRNA数据筛选及建模 |
| 2.4.3 预测脑卒中差异表达mi RNAs模型的靶基因及生物信息学分析 |
| 2.4.4 双荧光素酶报告实验验证意义mi RNAs与靶基因的关系 |
| 2.5 讨论 |
| 参考文献 |
| 第3章 MIR-216/124对小鼠氧糖剥夺再灌注损伤N2A细胞的保护作用及其机制研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 研究方法 |
| 3.3.1 小鼠神经母瘤细胞(N2a细胞)的培养 |
| 3.3.2 细胞的转染及OGD模型建立、实验分组 |
| 3.3.3 CCK-8法检测细胞存活率 |
| 3.3.4 细胞成管能力的检测 |
| 3.3.5 流式细胞仪检测细胞凋亡状态 |
| 3.4 数据处理及统计分析 |
| 3.5 结果 |
| 3.5.1 N2a细胞转染mi R-216/124 mimics/inhibitor后的有效性检测 |
| 3.5.2 转染miR-216/124模拟物或抑制物对N2a细胞活力的影响 |
| 3.5.3 mi R-216、mi R-124 对细胞成管能力的检测 |
| 3.5.4 流式细胞术检测mi R-216、mi R-124对N2a细胞凋亡的影响 |
| 3.5.5 mi R-216与mi R-124 对靶基因CADM2 及细胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax的影响 |
| 3.5.6 mi R-216、mi R-124 抑制氧糖剥夺诱导的N2a细胞凋亡与PI3K/AKT信号通路相关 |
| 3.6 讨论 |
| 参考文献 |
| 第4章 MIR-216/124对小鼠缺血再灌注脑损伤的保护作用及其机制研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 动物 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.2.3 主要仪器 |
| 4.2.4 主要溶液的配制 |
| 4.3 研究方法 |
| 4.3.1 构建小鼠脑缺血的适宜再灌注时间 |
| 4.3.2 制备miR-216/124过表达慢病毒 |
| 4.3.3 小鼠正式实验及Zea Longa神经功能评分 |
| 4.3.4 脑片TTC染色评价脑梗死体积的变化 |
| 4.3.5 TUNEL法检测缺血脑组织中细胞凋亡情况 |
| 4.3.6 实时定量PCR检测缺血脑组织中mi RNA/靶基因的表达 |
| 4.4 统计分析 |
| 4.5 结果 |
| 4.5.1 选择小鼠脑缺血的适宜再灌注时间 |
| 4.5.2 评估miR-216/124慢病毒 |
| 4.5.3 小鼠Zea Longa神经行为学评分 |
| 4.5.4 脑片TTC染色评价脑梗死体积的变化 |
| 4.5.5 TUNEL法检测缺血脑组织中细胞凋亡情况 |
| 4.5.6 实时定量PCR检测缺血脑组织中mi RNA及 CADM2 的表达 |
| 4.5.7 Western Blot检测缺血脑组织中CADM2 的表达量 |
| 4.6 讨论 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 攻读博士学位期间取得的科研成果 |
| 附录2 攻读博士学位期间参加的科研项目 |
| 致谢 |
（8）ENO1和Syt1在缺血性脑神经损伤的作用及其调控机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 脑卒中概况 |
| 1.2 影响脑卒中疾病的主要因素 |
| 1.3 脑卒中疾病治疗 |
| 1.4 脑卒中机制研究 |
| 1.5 脑卒中模型 |
| 1.6 脑卒中研究方法 |
| 1.7 脑卒中相关蛋白 |
| 1.8 本研究论文的构思 |
| 第2章 蛋白质组学鉴定ENO1调控脑缺血神经损伤 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验仪器和材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 小鼠局部脑缺血模型构建 |
| 2.3.2 脑缺血早期海马CA1区神经元死亡程度研究 |
| 2.3.3 缺血3 h小鼠脑匀浆考染检测 |
| 2.3.4 小鼠ENO1参与脑缺血鉴定 |
| 2.3.5 小鼠ENO1在脑缺血早期表达水平研究 |
| 2.3.6 小鼠ENO1基因在不同器官组织的表达谱 |
| 2.3.7 小鼠ENO1在脑不同区域及时间的表达谱 |
| 2.3.8 海马神经元ENO1表达及定位研究 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 ENO1在脑缺血早期神经损伤功能及机制研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验仪器与材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 海马神经元缺氧缺糖模型构建 |
| 3.3.2 ENO1蛋白表达水平在脑缺血体外模型中动态变化 |
| 3.3.3 神经元过表达ENO1在缺氧缺糖的功能研究 |
| 3.3.4 海马神经元干扰ENO1-2表达增加缺氧缺糖神经损伤 |
| 3.3.5 小鼠局部脑缺血后ENO1产物PEP检测 |
| 3.3.6 烯醇式丙酮酸对神经元缺氧缺糖的影响 |
| 3.3.7 体内注射PEP降低脑缺血神经元死亡率及梗死体积 |
| 3.3.8 线虫缺氧饥饿模型构建 |
| 3.3.9 ENO1 敲除线虫缺氧饥饿研究 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 磷酸化组学鉴定syt1调控脑缺血神经损伤 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验仪器与材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 小鼠局部脑缺血早期海马蛋白磷酸化修饰鉴定 |
| 4.3.2 小鼠局部脑缺血2h海马蛋白磷酸化组学 |
| 4.3.3 神经元syt1磷酸化在缺氧缺糖的功能研究 |
| 4.3.4 神经元syt1磷酸化在缺氧缺糖的机制研究 |
| 4.3.5 秀丽隐杆线虫SNT-1敲除突变体抵抗缺氧饥饿损伤 |
| 4.3.6 秀丽隐杆线虫SNT-1敲除外源拯救缺氧饥饿 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 核酸适体筛选脑缺血标记蛋白 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 实验仪器和材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 脑缺血早期组织切片进行核酸适体筛选 |
| 5.3.2 核酸适体筛选监控 |
| 5.3.3 核酸适体LCW17研究 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 核酸适体LCW17及其靶蛋白研究 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 实验部分 |
| 6.2.1 实验仪器和材料 |
| 6.2.2 实验方法 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 核酸适体LCW17靶蛋白鉴定 |
| 6.3.2 核酸适体LCW17亲和力分析 |
| 6.3.3 核酸适体LCW17脑缺血程度诊断 |
| 6.3.4 核酸适体LCW17体内研究 |
| 6.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 A 攻读学位期间所发表的学术论文目录 |
| 附录 B 攻读学位期间所发明的专利 |
（9）食蟹猴局灶性脑缺血的组织及血浆蛋白质组学分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 基于质谱的蛋白质组学概述 |
| 1.1.1 研究方法学的一般分类 |
| 1.1.2“鸟枪法”蛋白质组学概述 |
| 1.1.3 蛋白质与多肽的分级处理 |
| 1.1.4 肽段多肽及蛋白质的鉴定 |
| 1.2 蛋白组学在脑缺血研究中的应用 |
| 1.2.1 缺血性脑卒中及缺血脑组织的病理变化 |
| 1.2.2 脑缺血疾病的研究及展望 |
| 1.3 研究背景、意义和内容 |
| 1.3.1 研究背景 |
| 1.3.2 研究意义 |
| 1.3.3 研究内容 |
| 第二章 食蟹猴局灶性脑缺血模型的构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验仪器与试剂 |
| 2.2.2 溶液配制 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 超声多普勒血流测定 |
| 2.3.2 脑组织病理切片的观察 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 食蟹猴脑缺血模型中线粒体及核蛋白组学分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验仪器、试剂及耗材 |
| 3.2.2 溶液配制 |
| 3.2.3 实验方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 线粒体及细胞核分级结果 |
| 3.3.2 脑组织线粒体蛋白质组分析 |
| 3.3.3 脑组织细胞核蛋白质组分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 食蟹猴脑缺血模型中胞浆蛋白组学分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验仪器、试剂及耗材 |
| 4.2.2 溶液配制 |
| 4.2.3 实验方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 脑组织胞浆蛋白分级结果 |
| 4.3.2 脑组织胞浆蛋白质谱鉴定结果 |
| 4.3.3 通路及分子功能分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 食蟹猴脑缺血模型中血浆蛋白组学分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验仪器与试剂 |
| 5.2.2 溶液配制 |
| 5.2.3 实验方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 血浆蛋白分级结果 |
| 5.3.2 质谱鉴定结果 |
| 5.3.3 脑组织-特异表达蛋白的筛选结果 |
| 5.4 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 创新之处 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（10）大鼠大脑局灶性缺血再灌注损伤病理机制及STV保护作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 脑卒中现状概述 |
| 1.2 脑卒中病理机制及研究现状 |
| 1.3 脑卒中的药物治疗现状 |
| 1.3.1 溶栓治疗 |
| 1.3.2 降纤药物与抗凝药物 |
| 1.3.3 抗血小板聚集药物 |
| 1.3.4 神经保护治疗 |
| 1.4 STV及其衍生物研究背景 |
| 1.5 蛋白质组学分析方法概述 |
| 1.5.1 基于蛋白质二维凝胶电泳分离-质谱分析的top-down策略 |
| 1.5.2 基于肽段液相色谱分离-质谱分析的bottom-up策略 |
| 1.6 低密度脂蛋白的概述 |
| 1.7 本实验研究背景、意义和内容 |
| 1.7.1 研究背景 |
| 1.7.2 研究意义 |
| 1.7.3 研究内容 |
| 第二章 大鼠大脑中动脉闭塞/再灌注模型（MCAO/R）构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.1.1 脑卒中模型的选择及评价 |
| 2.1.2 大鼠大脑中动脉线栓法构建模型的优势 |
| 2.2 实验仪器与材料 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验材料及相关溶液 |
| 2.2.3 线栓模型制作准备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 大鼠大脑中动脉局灶性缺血/再灌注模型的制备 |
| 2.3.2 试验分组和剂量、给药 |
| 2.3.3 模型成功性验证 |
| 2.3.4 生理参数检测 |
| 2.3.5 神经行为学恢复的评估 |
| 2.3.6 脑组织的切取 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 血流值测定结果 |
| 2.4.2 生理参数测定结果 |
| 2.4.3 脑梗死面积计算结果 |
| 2.4.4 动物行为学评分结果 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 不同十二烷基硫酸钠-丙烯酰胺凝胶系统（SDS-PAGE）对脑组织蛋白的分离 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 大鼠脑蛋白质的提取及浓度测定 |
| 3.3.2 不同SDS-PAGE凝胶系统的制备 |
| 3.3.3 梯度SDS-聚丙烯酰胺凝胶（4.2%-17.85% T（线性梯度），5% C（交联度））电泳 |
| 3.3.4 不同浓度（10% T，2.6% C或 12% T，2.6% C或 15% T，2.6% C）均一SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 不同系统胶对蛋白分离的影响 |
| 3.4.2 脑组织蛋白的特点 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 不同时间点MCAO/R模型级联反应过程相关蛋白表达及量的变化 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与仪器 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 相关溶液的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 水溶性蛋白质的提取及浓度测定 |
| 4.3.2 大鼠脑组织蛋白质的一维十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 4.3.3 大鼠脑组织蛋白质的免疫印迹法 |
| 4.3.4 统计学分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 脑缺血过程中氧化应激相关蛋白的分析 |
| 4.4.2 相关蛋白不同时间点表达量的变化的所涉及的级联反应 |
| 4.4.3 STV与依达拉奉的比较 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 使用数字化非变性蛋白图谱方法分析低密度脂蛋白（LDL）及其相关蛋白 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与仪器 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 血浆样品的准备 |
| 5.3.2 人血浆蛋白的非变性二维凝胶电泳 |
| 5.3.3 凝胶网格切取 |
| 5.3.4 胶内酶解 |
| 5.3.5 纳升级超高效液相色谱分离 |
| 5.3.6 质谱对肽段样品的定性定量分析 |
| 5.3.7 数据处理及蛋白质的鉴定和定量分析 |
| 5.3.8 重构非变性蛋白图谱 |
| 5.4 实验结果与讨论 |
| 5.4.1 MS~E模式与HDMS~E模式的比较 |
| 5.4.2 Apo B-100 的分布及网格切取区域其他主要的血浆蛋白 |
| 5.4.3 运用数字化蛋白质谱图进行低密度脂蛋白相关蛋白搜索 |
| 5.4.4 已报道的LDL相关蛋白结果的比较 |
| 5.4.5 数字化天然蛋白图谱在分析LDL结合蛋白的特征 |
| 5.5 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
四、脑缺血相关蛋白质的鉴定和功能研究（论文参考文献）
- [1]额尔敦-乌日勒的活性成分分析及其对小胶质细胞基因调控作用的研究[D]. 其布日. 内蒙古大学, 2021(11)
- [2]丹参酮ⅡA磺酸钠调控HIF1α/mTOR介导细胞自噬干预缺血性脑卒中的机制研究[D]. 王哲义. 北京中医药大学, 2021(01)
- [3]芫根对局灶性脑缺血缺氧损伤的保护作用及其机制研究[D]. 化涵毅. 江南大学, 2021(01)
- [4]三七皂苷R1对局灶性脑缺血损伤大鼠急性期保护作用的研究[D]. 刘博文. 南京中医药大学, 2021(01)
- [5]TIPARP在转录组和蛋白组水平上对星形胶质细胞的调控[D]. 汤宇燕. 东南大学, 2020(01)
- [6]基于1DE-LC-MS系统化分析的差异蛋白质组学研究策略的建立与应用[D]. 文美玲. 华南理工大学, 2020(01)
- [7]探讨生物信息学筛选的miR216/124靶向CADM2对小鼠再灌注脑损伤细胞凋亡的作用[D]. 胡玲. 武汉科技大学, 2020(01)
- [8]ENO1和Syt1在缺血性脑神经损伤的作用及其调控机制[D]. 蒋伟. 湖南大学, 2020
- [9]食蟹猴局灶性脑缺血的组织及血浆蛋白质组学分析[D]. 赵旭. 华南理工大学, 2016(02)
- [10]大鼠大脑局灶性缺血再灌注损伤病理机制及STV保护作用的研究[D]. 陈谨. 华南理工大学, 2016(02)