一、多种反义寡脱氧核苷酸联合逆转人肝癌多药耐药性的实验研究（论文文献综述）
郭园园[1]（2020）在《功能小分子-硫代核酸偶联物的合成及其抗肿瘤应用》文中进行了进一步梳理化学偶联策略是构建新型药物制剂的重要手段,例如小分子药物与载体或靶向分子偶联以及基因药物化学修饰等。小分子药物通常与聚合物、单克隆抗体、多肽、脂质分子等偶联以改善其药动学性质、提高稳定性、实现肿瘤组织穿透和靶向作用。然而,传统药物偶联物载体仍存在很多挑战:如分子量不可控、载体潜在毒性、免疫原性、制备工艺复杂、接枝位点和数量不确定、载药量低等问题。除了作为基因药物治疗疾病外,核酸作为天然存在的生物大分子还是理想的药物载体,具有分子结构和序列精准可控、完全生物相容和可降解等优势。因此,研究核酸的化学修饰和分子偶联具有重要意义。目前用于核酸化学修饰和分子偶联的方式通常依赖于固相合成,需要特殊修饰而存在合成复杂、载药量低、影响功能、安全性差等问题。为此,本文基于成熟的硫代核酸修饰技术,利用硫代磷酸酯基团高效接枝不同功能小分子,从而构建了功能小分子-硫代核酸偶联物的通用合成方法。此接枝方法简单高效、不影响核酸碱基互补配对和分子识别特性,且修饰位点和数量精确可控。基于此本研究实现了一系列功能小分子在核酸上的精确接枝偶联,并将其应用于基因调控、药物输送、肿瘤治疗等领域。具体研究内容如下:1.马来酰亚胺-硫代核酸偶联物促进反义寡核苷酸入胞研究反义寡核苷酸药物（antisense oligonucleotides,ASO）由于其合成简单、药效优良而得到广泛应用。但其肿瘤靶向和细胞穿透性差强人意,制约了ASO的成药性和临床应用。通过在ASO末端偶联靶向分子、细胞穿透肽、脂质分子等可以提高入胞效率,但存在合成复杂、偶联产物具有安全性问题等。为此,本课题利用硫代ASO（PS-ASO）的硫代磷酸酯基团与苄溴修饰的马来酰亚胺分子（Mal-Bz-Br）偶联,制备了多个马来酰亚胺分子（Maleimide,Mal）接枝的硫代反义寡核苷酸（nMal-g-ASO）,以促进ASO的肿瘤细胞穿透能力和基因沉默效率。其中,马来酰亚胺的接枝不影响ASO的分子识别性质和生物学功能。所制备的nMal-g-ASO具有较好的生物安全性,并可通过与细胞膜表面巯基发生点击化学反应而促进ASO的非内吞途径依赖的细胞摄取,从而增强ASO的基因沉默效率。2.光敏剂-硫代核酸偶联物自组装纳米水凝胶的构建及其光动力-免疫联合治疗研究核酸除作为基因药物实现疾病治疗外,还可作为载体材料进行药物递送。为此,我们利用核酸作为载体,进一步在硫代核酸骨架上接枝光敏剂分子进行光动力-免疫联合抗肿瘤研究。光动力-免疫检查点抑制剂联合应用在癌症治疗中发挥重要作用。然而,两者的理化性质和作用位点差别较大,其合理共递送成为一个挑战。研究如何通过纳米药物手段,选择一个安全、生物相容性的载体材料以更好更合理地实现两者的共同递送意义重大。为此,本课题选择DNA作为载体,利用硫代核酸修饰和DNA纳米组装技术共同负载光敏剂（焦脱镁叶绿酸a,PPA）及靶向于程序性死亡蛋白配体-1（PD-L1）的小干扰RNA（anti-PD-L1 si RNA）,制备了光动力-免疫检查点抑制剂共递送纳米凝胶体系。首先通过在四条DNA链上分别进行硫代修饰后偶联PPA以得到亲水性光敏剂-硫代核酸偶联物（PPA-DNA）。亲水性PPA-DNA保持DNA的分子识别功能,可在1×TAE/Mg2+中通过一步退火制备含有粘性末端的载药DNA四面体（tailed-PPA-TET）。进而利用含互补粘性末端的anti-PD-L1 si RNA作为交联剂制备联合递送纳米凝胶（PD-L1/PPA-NG）。光敏剂PPA在光照条件下可引起肿瘤细胞免疫原性死亡（immungentic cell death,ICD）,促进抗原释放;交联剂anti-PD-L1 si RNA可实现肿瘤细胞内PD-L1基因下调从而降低肿瘤细胞表面PD-L1表达,促进细胞毒性T细胞的肿瘤杀伤效应。两者双管齐下,实现良好的免疫增强和肿瘤治疗,显着抑制初级瘤和远端转移瘤生长,为构建药物联合递送体系提供新的方法。3.紫杉醇-硫代核酸偶联物肿瘤靶向多功能球形核酸构建及性能研究上述研究表明,硫代核酸可以实现小分子药物在核酸骨架上偶联的目的。偶联策略在化疗药物递送体系研究中也具有重要意义,而目前核酸载体进行化疗药物递送存在稳定性差、载药量低等问题。此外,纳米药物在体内的被动靶向作用存在很多争议,因此亟需构建具有较高载药量和肿瘤靶向性的化疗药物递送体系。为了进一步体现硫代核酸作为药物载体的普遍性和重要性,以提高载药量和肿瘤靶向性为目的,我们在一条嵌段型DNA(PODNA-b-PSDNA)链一端连续、多个硫代修饰,在硫代修饰位点特异性接枝疏水性化疗药物紫杉醇（paclitaxol,PTX）制备了嵌段型、两亲性紫杉醇-核酸偶联物(PODNA-b-(PSDNA-g-PTX))。将PODNA-b-(PSDNA-g-PTX)在水溶液中透析制备了球形核酸（spherical nucleic acid,SNA）样的载药胶束结构（PTX-SNA）,其中磷酸二酯键核酸部分为胶束外壳,偶联疏水PTX的硫代核酸部分为胶束内核。同时,通过与磷酸二酯核酸部分碱基互补配对或将此部分更换为功能性核酸序列,即可同时赋予PTX-SNA靶向性、肿瘤成像和基因-化疗联合功能,以得到多功能球形核酸结构,从而实现肿瘤靶向、成像以及抗肿瘤耐药的目的。实验结果表明,核酸中硫代磷酸酯基团（PS）可以全部进行药物接枝,提高载药量的同时实现了药物接枝数量的精确可控。通过简单操作即可制备具有靶向作用的多功能载药体系,体系成分简单、安全性高。所制备的多功能球形核酸具有较好的肿瘤靶向、肿瘤治疗和抗肿瘤耐药性质。
王开雷[2]（2020）在《粉防己碱逆转大肠癌LOVO/5-Fu多药耐药性的研究》文中研究表明研究背景和意义:大肠癌是全球第四大常见的癌症,每年大约有639 000人因大肠癌而死亡。近年来,我国大肠癌患者的发病率和死亡率呈现出一种显着上升的趋势,而且很多大肠癌患者在明确诊断时已经为中晚期,其治疗效果较差。寻找一种有效且可靠的治疗大肠癌的方法已成为一项现代医学亟需解决的问题。目前,有多种方法可用于治疗大肠癌,包括手术、放射治疗、化疗和生物治疗等。现阶段的医学指南认为手术和化疗为大肠癌主要而有效的治疗手段。尽管通过手术治疗可以使部分早期大肠癌患者得到根治性治疗,但是很多大肠癌患者在临床明确诊断时已经为肿瘤中晚期,手术切除肿瘤后部分患者会出现肿瘤的复发转移,因此化疗就成为大肠癌患者手术之后必要的治疗方法之一。大肠癌患者在手术治疗之后辅助以化疗,可以在很大程度上防止肿瘤复发转移;对部分中晚期大肠癌患者通过手术治疗无法将肿瘤完全切除干净时,通过化疗可以将残余肿瘤细胞杀灭或者抑制肿瘤细胞继续生长;对于有些肿瘤患者在确诊时已为晚期,且有广泛转移而无法进行手术,通过化疗可使肿瘤体积缩小,使患者的部分症状缓解,有时候甚至达到可以实施手术的可能。但是,在大肠癌患者进行化疗的过程中,除部分原发耐药者之外,还有部分肿瘤患者可能在治疗的过程中随着化疗疗程的增加,最终出现对某种化疗药物的耐药,甚至出现对多种化疗药物耐药,进而导致化疗失败,肿瘤复发转移。有研究表明由于肿瘤多药耐药的出现,大约有三分之一的大肠癌患者会出现肿瘤复发、转移。因此,多药耐药的出现是大肠癌化疗失败的主要原因之一。在大肠癌的化疗药物中,五氟尿嘧啶（5-Fluorouracil,5-Fu）作为最有效的临床药物之一,在临床治疗中有着广泛的应用,但是多药耐药的大肠癌细胞对5-Fu产生的耐药性也是大肠癌患者在临床化疗中失败的常见原因之一。因此探讨大肠癌细胞的耐药机制,寻找一种新的、有效的能够逆转大肠癌多药耐药的方法是当前在大肠癌研究中的热点问题之一。鉴于此原因,我们建立了具有良好稳定性和耐药性的五氟尿嘧啶耐药的大肠癌LOVO/5-Fu耐药细胞系,并利用LOVO/5-Fu耐药细胞株研究大肠癌耐药的分子机制,将多药耐药的大肠癌LOVO/5-Fu耐药细胞逆转为对化疗药物敏感的肿瘤细胞,同时研究其可能的逆转机制。P糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）是细胞膜上重要的转运蛋白,属于ABC转运蛋白（ATP依赖性转运蛋白）超家族成员,在引起肿瘤细胞产生多药耐药性（multidrug resistance,MDR）中起重要的作用。肿瘤细胞发生MDR的原因很多,其中的重要原因之一是P-gp增多,而P-gp是肿瘤细胞MDR1基因编码的。在人类中,MDR1 mRNA在肾上腺、胰腺、大肠、小肠等组织中是低表达状态,它参与了人体正常组织细胞的生长;在MDR表型的肿瘤细胞中,MDR1/P-gp有过量表达现象。有体外实验研究表明,MDR1基因和P-gp的表达水平越高,则MDR细胞内抗肿瘤药物的浓度越低,其耐药性越强。另有研究表明P-gp具有药物泵的功能,它可以将进入肿瘤细胞内的化疗药物主动地泵出细胞外,从而使蓄积在肿瘤细胞内的抗肿瘤药物减少,进而使肿瘤细胞发生MDR。C-jun N端激酶（c-jun N-terminal kinase,JNK）也被人们称之为应激活化蛋白激酶（stress-activated protein kinase,SAPK）,是一类丝氨酸/苏氨酸激酶,是哺乳类动物细胞中丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）家族中的重要成员之一。JNK信号通路在渗透压、氧化应激、电离辐射等多种环境应激因素以及生长因子、细胞因子（如TNF、IL21）作用下均可被激活,从而导致JNK/SAPK信号通路中的苏氨酸和丝氨酸双磷酸化而将其活化,最终导致JNK/c-jun信号通路被激活。在细胞生长、应激反应、癌基因转化、细胞分化以及细胞凋亡等多种生理和病理过程中JNK/SAPK信号通路均发挥着重要的作用。有研究发现,大肠癌的发生、发展以及耐药机制与JNK信号通路有着密切的关系。粉防已碱（Tetrandrine,Tet）又称汉防己甲素,是一种双苄基异喹啉生物碱,是从中草药粉防己根块中提取的。它具有抗炎、降低血压、阻断钙离子通道等广泛的药理作用,有研究报道称其可在体内外均表现有较好的逆转白血病细胞多药耐药的作用,其逆转耐药的机制为下调MDR1 mRNA/P-gp的表达、使抗肿瘤药物在细胞内积聚,同时使抗肿瘤药物的敏感性增加,进而导致肿瘤细胞凋亡。基于此,我们推测Tet可能会通过调节MDR1 mRNA/P-gp的表达,进而调节大肠癌在化疗过程中产生的MDR。我们在本研究中将Tet在体外作用于大肠癌LOVO/5-Fu耐药细胞株,研究Tet对大肠癌LOVO/5-Fu耐药细胞株的生长抑制及其诱导凋亡的情况,进而了解其对多药耐药的大肠癌LOVO/5-Fu细胞的逆转作用及其逆转机制。研究结果表明Tet通过抑制MDR1基因的表达,使P-gp的表达降低,进而逆转大肠癌LOVO/5-Fu对5-Fu的耐药。同时通过对JNK信号通路的研究发现,Tet可调控细胞内JNK和c-jun的磷酸化水平,进而调控细胞的耐药性。Tet可能成为逆转大肠癌多药耐药的一个重要逆转药物。方法:1.建立LOVO/5-Fu多药耐药细胞系本实验采取逐渐递增5-Fu药物浓度,并持续作用于大肠癌敏感细胞LOVO细胞株,进行体外诱导使其产生耐药性,逐步筛选出具有多药耐药性的LOVO/5-Fu细胞株。多次使用MTT法检测其多药耐药性,从而确认我们建立的LOVO/5-Fu多药耐药细胞系拥有良好的多药耐药性和稳定性。2.分析MDR mRNA和P-gp蛋白在大肠癌细胞LOVO和耐药细胞LOVO/5-Fu中的表达实时荧光定量PCR（Realtime-PCR）检测LOVO和LOVO/5-Fu细胞中多药耐药基因的MDR mRNA表达,Western blot检测LOVO和LOVO/5-Fu细胞中P-gp蛋白的表达。揭示MDR mRNA和P-gp蛋白在大肠癌LOVO和LOVO/5-Fu细胞中的表达情况。3.MTT法确定逆转剂的浓度使用不同浓度的Tet分别作用于LOVO细胞和LOVO/5-Fu细胞,MTT实验检测Tet对细胞抑制率的影响。4.耐药逆转试验使用Tet作用于LOVO/5-Fu细胞之后,MTT实验检测细胞抑制率,并进一步计算出IC50以及耐药指数。5.流式细胞术检测细胞周期分布Tet分别作用于LOVO和LOVO/5-Fu细胞后,采用流式细胞术检测各组细胞周期分布情况。6.流式细胞术检测细胞凋亡Tet分别作用于LOVO和LOVO/5-Fu细胞后,采用流式细胞术检测各组细胞凋亡率的变化情况。7.流式细胞术检测细胞P-gp的表达Tet分别作用于LOVO和LOVO/5-Fu细胞后,采用流式细胞术检测各组细胞P-gp的表达情况。8.PCR检测MDR1基因表达Tet分别作用于LOVO和LOVO/5-Fu细胞后,采用PCR检测MDR1基因表达情况。9.Western blot 检测 P-gp、JNK、p-JNK、c-jun、p-c-jun 蛋白Tet分别作用于LOVO和LOVO/5-Fu细胞后,采用Western blot检测各组细胞 P-gp、JNK、p-JNK、c-jun、p-c-jun 的表达情况。结果在本实验研究中,我们发现与对照组大肠癌细胞LOVO细胞相比,五氟尿嘧啶耐药的LOVO/5-Fu细胞中MDR mRNA表达水平明显上调,P-gp蛋白含量明显增高。进一步研究我们还发现使用Tet作用于LOVO/5-Fu细胞之后,可以增强LOVO/5-Fu细胞对五氟尿嘧啶的敏感性。使用Tet作用于LOVO和LOVO/5-Fu细胞之后,可以使LOVO/5-Fu细胞凋亡率升高,使被阻滞在G1期的细胞增多,而进入分裂期的细胞较前明显减少;LOVO/5-Fu细胞MDR1表达量和P-gp蛋白含量较未使用Tet作用之前明显降低。Tet作用于LOVO/5-Fu细胞后,p-JNK较未使用Tet的LOVO/5-Fu组细胞明显升高,其下游分子p-c-jun表达量也显着增加;加入JNK信号通路抑制剂SP600125之后,Western blot检测结果显示,Tet作用组细胞的p-JNK、p-c-jun较未加入JNK信号通路抑制剂SP600125之前表达量显着降低;各个组总JNK和c-jun表达量无明显变化。结论1、本实验方法建立的LOVO/5-Fu耐药细胞系有良好的耐药性和稳定性。2、LOVO/5-Fu组细胞中MDR mRNA表达水平和P-gp蛋白含量比LOVO组细胞中明显上调。3、Tet体外可以逆转人大肠癌多药耐药细胞株LOVO/5-Fu细胞的MDR。4、Tet可以通过对人大肠癌多药耐药细胞株LOVO/5-Fu细胞凋亡率和细胞周期的调控,改变细胞的MDR。5、Tet逆转人大肠癌多药耐药细胞株LOVO/5-Fu细胞MDR的机制可能是通过调控JNK信号通路,下调MDR mRNA和P-gp蛋白的表达来实现的。
陈思媛[3]（2014）在《ERK1/2信号传导通路在逆转肝癌细胞耐药性中的作用研究》文中提出目的：1.检测肝癌细胞耐药株模型的耐药性。2.检测ERK1/2信号通路的特异性抑制剂索拉菲尼和PD98059对肝癌耐药细胞株耐药性的影响,以明确下调ERK1/2活性是否可以逆转肝癌细胞耐药性。3.检测经典耐药逆转剂环孢霉素A对ERK1和ERK2表达水平的影响,初步探索ERK1/2信号通路与逆转肝癌细胞耐药性之间的关系。方法：1.使用阿霉素对人肝癌细胞株SMMC-7721和BEL-7402进行大剂量冲击方法诱导得到肝癌耐药株模型。采用Celltiter-Glo荧光细胞活性检测方法进行药敏实验并计算耐药指数,确定耐药细胞株的耐药性。2.用MTT法检测索拉菲尼、PD98059及环孢霉素A对肝癌细胞的毒性。3. Western Blot检测索拉菲尼、PD98059及环孢霉素A作用后耐药细胞ERK1、ERK2表达水平的变化情况。4.采用Celltiter-Glo荧光细胞活性检测方法检测索拉菲尼、PD98059及环孢霉素A作用后耐药细胞株对阿霉素敏感性的变化情况。结果：1.阿霉素诱导得到肝癌耐药细胞株SMMC-7721/ADM和BEL-7402/ADM。与亲本株相比,耐药细胞株对阿霉素的敏感性明显下降,阿霉素的半数抑制浓度（IC50）显着升高。SMMC-7721/ADM及BEL-7402/ADM的耐药指数分别为16.44、20.34。2.索拉菲尼及PD98059分别作用于耐药细胞株后,ERK1、ERK2的总表达水平无变化,磷酸化水平显着降低,且药物的作用浓度越高,效果越明显。与对照组相比,索拉菲尼及PD98059均提高了耐药细胞株对阿霉素的敏感性。3.与对照组相比,经环孢霉素A作用后,耐药细胞株对阿霉素的敏感性明显提高。环孢霉素A对耐药细胞ERK1、ERK2的总表达水平无影响,但ERK1、ERK2磷酸化水平有所提高。结论：1.诱导得到的耐药株SMMC-7721/ADM和BEL-7402/ADM表现出稳定的耐药性。2.通过下调ERK1/2活性可以逆转肝癌耐药细胞株的耐药性。3. ERK1/ERK2磷酸化水平降低并未参与环孢霉素A对肝癌细胞的耐药逆转作用。下调ERK1/2信号通路活性并不是逆转肝癌细胞耐药的唯一途径。
盛龙,熊茂明[4]（2012）在《原发性肝癌MDR耐药性逆转的研究进展》文中研究说明在肝癌的综合治疗中化学药物治疗是其重要方法,但多药耐药（multidrug resistance,MDR）的存在一直是影响其疗效的主要因素。多药耐药是指肿瘤细胞对某一化疗药物产生耐药性后对其他化学结构及机理不同的化疗药物也产生交叉耐药,分为原发性MDR和获得性MDR。研究MDR的
盛龙[5]（2012）在《筛选靶向肝癌Bel-7402/ADM细胞MDR1基因的高效siRNA的实验研究》文中进行了进一步梳理目的筛选出靶向人肝癌多药耐药细胞亚系Bel-7402/ADM细胞MDR1基因的高效siRNA，为逆转肝癌多药耐药提供新的分子靶点。方法设计并化学合成4条靶向MDR1的siRNAs（mdr1si-1、mdr1si-2、mdrlsi-3和mdrlsi-4），通过Lipofectamine2000介导转染Bel-7402/ADM细胞株，用RT-PCR检测Bel-7402/ADM细胞MDR1mRNA表达、western blot检测P-gp的表达和MTT检测细胞对ADM的敏感性，综合评价这4条siRNAs的沉默效果。结果经siRNA干扰后，4条siRNAs均能不同程度逆转Bel-7402/ADM细胞MDR1介导的多药耐药。4条siRNA转染48小时后，mdrlsi-1组或mdrlsi-3组的mRNA的表达水平下降幅度较mdrlsi-4组或mdrlsi-2组差异有统计学意义（P<0.05）；转染72ｈ后P-gp蛋白的表达量由低到高依次为mdrlsi-1组，mdrlsi-3和mdrlsi-4组，mdrlsi-2组（P<0.05）；mdrlsi-1组对ADM耐药的相对逆转率最高，mdrlsi-3组次之（P<0.05），mdrlsi-4组和mdrlsi-2组的差异无统计学意义（P>0.05）。结论相比较其他3条siRNAs，mdr1si-1对人肝癌Bel-7402/ADM细胞MDR1介导的耐药逆转效果最好，其靶序列有望成为逆转肝癌多药耐药新的靶点。
朱明明,刘斌,李江[6]（2012）在《人原发性肝癌中多药耐药相关蛋白MRP的表达、耐药机制及逆转的研究进展》文中提出原发性肝癌（primary of liver）是我国常见的恶性肿瘤之一.手术切除率相对较低,术后复发率较高,许多肿瘤常规化疗效果差,预后不良,而肿瘤多药耐药性（MDR）则是肿瘤化疗失败的关键因素.多药耐药相关蛋白（multidrug associated protein,MRP）是一种介导多药耐药性的跨膜转运蛋白,能减少细胞内药物聚积,或改变药物在细胞内分布,从而影响化疗疗效及患者生存.主要针对MRP的结构和功能、在正常组织和肝癌细胞中的表达,以及多药耐药相关蛋白MRP的耐药机制和耐药性逆转等因素进行综述,以为临床提高肝癌的综合治疗水平提供理论基础.
邹阳[7]（2010）在《乳岩宁方诱导MCF-7细胞凋亡及抑制荷瘤裸鼠微血管生成作用的实验研究》文中提出目的:MCF-7是人源乳腺癌细胞, ER、PR、VEGF均阳性表达,本实验分为两部分,通过体外实验观察乳岩宁方对MCF-7细胞凋亡的影响,通过体内实验观察乳岩宁方对MCF-7荷瘤裸鼠乳腺癌的抑瘤作用、抑制MCF-7荷瘤裸鼠肿瘤血管生成及对磷酸化Akt蛋白表达水平的影响,来探讨乳岩宁方的作用机制,可能与PI3K/Akt信号转导通路相关。材料与方法:实验细胞株:MCF-7购于湖南湘雅医学院中心实验室细胞库（美国标准生物品收藏中心ATCC制备）。实验动物:SPF级小鼠（4-6周龄）50只雌雄各半,体重20±2 g ;雌性BALB/c-nu/nu裸鼠（4-6周龄）30只,体重20±2 g购于大连医科大学实验动物中心实验动物质量合证:SCXKGGD2004-0017。实验方法:一、含乳岩宁方SPF小鼠血清制备:50只SPF级小鼠适应性喂养3天,随机分为对照组、用药组,用药组按人与小鼠体表面积比值折算成相当于人临床剂量10倍量给药,对照组灌服等体积生理盐水,于每天上、下午相同时间（每次间隔12小时）灌胃,连续灌胃7天,后禁食不禁水,于末次给药2次,中间间隔lh,于最后一次给药后l小时,无菌操作下取血。血样常温放置4小时后4℃过夜,离心2000rpm×15min,0.22um微孔滤膜过滤分装于EP管中,-20℃保存,使用前56℃水浴灭活30min。二、MTT比色法测定乳岩宁含药血清对MCF-7细胞增殖的影响实验步骤:1将对数生长期的细胞以0.25%的消化胰酶/EDTA 800ul消化,用10%FBS的DMEM制成单细胞悬液;2调整细胞浓度为2×105/ml,接种于3块96孔板中,每孔200ul,于37℃,5%CO2饱和湿度条件培养24 h; 3换用0.5%FBS的DMEM培养基,继续于37℃,5%CO2饱和湿度条件培养24 h,同步细胞于G0/G1期;4根据DMEM培养基中血清来源不同将细胞随机分为6组,即5%正常血清组、10%正常血清组、20%正常血清组及相同体积分数的5%中药血清组、10%中药血清组、20%中药血清组,每组设10个复孔;5每孔分别添加各组不同体积分数血清及DMEM培养基,每孔终体积为200ul,继续分别培养24 h、48 h、72 h;6在不同的终点时间均换成无血清DMEM100ul,并加入MTT （5mg/ml） 20uL,孵育4 h后,吸弃培养液,然后加入二甲基亚砜（ DMSO） 150uL/孔,放于水平摇床轻微震荡10 min;7用酶标仪在490nm波长处测定吸光度（OD值）,结果取均值;计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=（对照组OD值-实验组OD值）/对照组OD值×100%。三、AO/EB荧光染色法观察乳岩宁对MCF-7细胞凋亡的影响取对数生长期MCF-7细胞,PBS液洗涤1次,0.25%胰酶/EDTA 800ul消化后,用含10%胎牛血清的低糖DMEM培养液配成104个/ml的细胞悬液。以每孔2ml体积接种于6孔板,孔内放玻片。细胞培养生长抑制2天后,分为乳岩宁含药血清浓度为5%、10%、20%、及对照组共4组,每组3个复孔,每组给药24h。1天后,吸去培养液,取出6孔板的玻片,PBS洗3次后,10%甲醛固定30分钟, AO/EB染色,碳酸盐缓冲甘油封片,荧光显微镜观察,激发波长为405 nm。每组分别计数3次,每次计数细胞300个,计算凋亡率,用SPSS10.0软件X2检验进行统计分析,确定影响凋亡的含药血清浓度。含药血清浓度为20%组,凋亡率最高,因此以下实验选择用20%浓度含药血清进行实验。四、流式细胞仪检测MCF-7细胞周期。五、乳岩宁对MCF-7细胞BAX/BCL2/ Caspase3蛋白表达的影响取对数生长期的MCF-7细胞,用0.25%胰酶/EDTA 800ul消化后,配成104个/ml的细胞悬液,以每瓶5ml体积接种于培养瓶中,每2天换液一次。在含有10%胎牛血清低糖DMEM培养基中培养,待其生长至70%融合时,换用0.5%FBS的DMEM培养基继续培养24 h,同步细胞于G0/G1期。将细胞分为对照组（含20%空白血清）和中药血清组（含20%中药血清）,培养24 h,1天后,倒去培养液。将细胞培养液吸弃,预冷PBS洗细胞2次,倒出PBS,加入预冷的细胞裂解液,置冰上裂解细胞;细胞样品完全破碎后,用细胞刮刮下细胞,移至准备好的1.5ml的EP管中。冷冻高速离心机中离心,4℃1500转/min离心20分钟,取上清,即是蛋白。用Western blot的方法进行检测。六、乳岩宁含药血清诱导MCF-7细胞凋亡相关信号转导机制Western blot检测P-AKT蛋白表达取对数生长期平滑肌细胞,用PBS液洗涤1次,用0.25%胰酶/EDTA 800ul消化后,制成单细胞悬液,以每瓶5ml体积接种于培养瓶中,于37℃,5%CO2条件下培养;待其生长至70%融合时,换用0.5%FBS的DMEM培养基继续培养24 h,同步细胞于G0/G1期;将细胞分为正常血清组（含20%空白血清）和中药血清组（含20%中药血清）,培养24 h;在终点时间,更换含有PDGF-BB（5ng/ml）的培养基继续孵育30 min;分别于5min、10min、20min、30min将细胞培养基吸弃,细胞刮收集细胞,后续Western blot检测。七、以及MCF-7荷瘤裸鼠病理切片制备、透射电镜观察细胞凋亡微观状态、免疫组化检测细胞凋亡原位杂交（TUNEL）法、MVD表达、ELISA方法检测MCF-7荷瘤裸鼠血清中EGF/VEGF表达,以及Western blot法对PI3K-Akt蛋白检测等。结果:1. MTT检测提示乳岩宁20%含药血清干预24小时对MCF-7有明显抑制作用。流式细胞仪凋亡检测试剂盒（AnnexinⅤ-FITC）检测提示乳岩宁含药血清可诱导MCF-7细胞凋亡。2.流式细胞仪细胞周期检测提示乳岩宁含药血清诱导MCF-7细胞停滞于G0/G1-S期,且呈量效关系。3.蛋白检测乳岩宁含药血清可下调BCL-2蛋白表达,提高Bax及Caspase3蛋白表达,降低Bcl-2/Bax比值,下调P-Akt表达,说明乳岩宁含药血清诱导MCF-7细胞凋亡机制之一是通过影响PI3K/Akt通路中磷酸化Akt蛋白表达水平,进而干预细胞周期相关调控蛋白的表达实现。4. MCF-7荷瘤裸鼠在体实验病理、电镜形态学观察细胞凋亡微观状态,免疫组化检测细胞凋亡原位杂交（TUNEL）法、蛋白检测P-Akt弱表达,印证乳岩宁方对MCF-7荷瘤裸鼠亦具有诱导细胞凋亡作用。5.乳岩宁方分组干预后免疫组化检测MCF-7荷瘤裸鼠MVD下降、ELISA方法检测MCF-7荷瘤裸鼠血清中EGF/VEGF表达下调,说明乳岩宁方具有抑制乳腺癌血管生成作用,对MCF-7荷瘤裸鼠乳腺癌具有多靶点治疗作用。结论:1.乳岩宁方对MCF-7细胞及MCF-7荷瘤裸鼠乳腺癌具有诱导细胞凋亡作用。诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制与PI3K/Akt信号转导通路相关。2.乳岩宁方具有抗MCF-7荷瘤裸鼠乳腺癌血管生成作用。
郭永良[8]（2009）在《水蛭提取物对人肝癌HepG2细胞化疗药物敏感性的影响及机制探讨》文中指出目的：探讨水蛭提取物（leech extract, LE）对人肝癌HepG2细胞化疗药物敏感性的影响及机制。方法：比较液氮快速冻融法LE和传统水提醇沉法LE对HepG2细胞增殖的抑制作用并确定提取方法。以氟尿嘧啶（5-Fu）、阿霉素（ADM）对照,分别采用LE与5-Fu或ADM联合用药,体外干预HepG2细胞。采用MTT法检测各组药物对HepG2细胞的增殖抑制作用,流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期,RT-PCR法检测MDR1和baxmRNA的表达,吖啶橙／溴乙锭（AO/EB）荧光染色法观察HepG2细胞凋亡形态。结果：1、液氮快速冻融法制备的LE对人肝癌HepG2细胞增殖有明显抑制作用,细胞数目明显下降,并呈剂量依赖性,与水提醇沉提取法比较,差异有显着统计学意义（P<0.01）,从而确定液氮快速冻融法LE为下一步实验用药。2、LE可以增强5-Fu、ADM对HepG2细胞的抑制作用,差异有显着统计学意义（P<0.01）。倒置相差显微镜显示细胞数量明显减少,悬浮的圆细胞增多,细胞周围出现碎片；AO/EB荧光染色法观察到HepG2细胞明显的凋亡形态。3、LE可以增强5-Fu、ADM诱导HepG2细胞凋亡的作用,差异有显着统计学意义（P<0.01）。48h时,各药物组HepG2细胞凋亡率明显高于24h时,差异有显着统计学意义（P<0.01）。4、与5-Fu组比较,LE+5-Fu组HepG2细胞周期表现为GO／G1期、G2/M期细胞比例下降,s期细胞比例上升,差异有显着统计学意义（P<0.01）；与ADM组比较,LE+ADM组HepG2细胞周期表现为GO／G1期细胞比例下降,S期、G2/M期细胞比例上升,差异有显着统计学意义（P<0.01）5、与对照组比较,LE能够下调HepG2细胞MDR1 mRNA的表达,差异有显着统计学意义（P<0.01）；bax mRNA表达水平轻微上调,差异无统计学意义（P>0.05）。结论：1、液氮快速冻融法制备的LE体外抑制HepG2细胞增殖作用明显优于水提醇沉法。2、LE可体外诱导人肝癌HepG2细胞凋亡,并提高对化疗药物5-Fu、ADM的敏感性。3、通过下调MDR1 mRNA的表达,可能是LE提高HepG2细胞化疗药物敏感性的重要分子机制。
罗晓婷,黄勤,李舒梅[9]（2009）在《反义核酸抑制肝癌细胞生长的研究进展》文中认为
魏莉[10]（2009）在《索拉非尼逆转肝癌细胞多药耐药的实验研究》文中研究说明一、研究背景原发性肝癌（HCC）是世界常见的恶性肿瘤之一,全世界半数左右的肝癌患者集中在中国,我国每年约有11万人死于肝癌,居恶性肿瘤病死率的第二位。目前临床肝癌诊疗中还存在着早期诊断难、复发转移率高、治疗缺乏针对性、源头创新药物和治疗手段少等问题。在肝癌的综合治疗中,化疗是其中重要方法之一,而肿瘤多药耐药（MDR）是严重影响化疗效果及患者生存的主要原因之一。肿瘤多药耐药在临床肿瘤治疗中已普遍存在,成为目前肿瘤化疗的主要障碍之一。MDR是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物出现耐药的同时,对其他结构及作用机制不同的抗肿瘤药物也产生交叉耐药的现象。MDR的产生机制目前并未阐明,目前认为肿瘤化疗MDR的主要分子生物学机制为:①跨膜转运蛋白将化疗药物从肿瘤细胞中泵出,从而减少抗肿瘤药物在细胞中聚集,主要包括MDR1编码的P-糖蛋白（P-gp）、MDR相关蛋白（MRP）以及肺耐药相关蛋白（LRP）;②细胞内与氧化还原和解毒有关的酶系统发生改变,如还原型谷胱苷肽（GSH）和谷胱苷肽巯基转移酶（GST）;③药物靶分子的改变,如蛋白激酶C（PKC）和DNA拓扑异构酶Ⅱ（TOPOⅡ）;④控制凋亡的基因和蛋白的改变,如Ras、Bcl-2、P53、c-fos和c-jun等。随着人们对肿瘤生物学行为的日益深入,肿瘤分子靶向治疗是继传统的三大治疗方法——手术、化疗和放疗后又一有力的肿瘤治疗手段而得到广泛的关注。肿瘤分子靶向治疗是针对可能导致细胞癌变的环节,如细胞信号传导通路、原癌基因和抑癌基因、细胞因子及受体、抗肿瘤血管形成、自杀基因等,从分子水平来逆转这种恶性生物学行为,从而抑制肿瘤细胞生长,甚至使其完全消退的一种全新的生物治疗模式。由于该治疗手段是特异性针对于在肿瘤的发生发展过程中起关键作用的靶分子及其调控的信号转导通路,因此,不但具有了抗肿瘤治疗的特异性和选择性,而且避免了常规化疗药物的无选择性所致的毒副作用和耐药性。分子靶向药物是肿瘤治疗研究的一个新领域,由于这类药物作用的高选择性以及较小的副作用,成为近年来抗癌药物研究的热点和发展趋势,也是提高肝癌治疗效果的研究方向之一。索拉非尼（sorafenib,BAY 43—9006）是一种新型口服多靶点的抗肿瘤药,它是一种双芳基尿素类口服多激酶抑制剂,具有双重抗肿瘤作用,一方面通过抑制RAF/MEK/ERK信号传导通路,直接抑制肿瘤生长,另一方面通过抑制几种与新生血管生成和肿瘤发展有关的酪氨酸激酶受体的活性,包括血管内皮生长因子-2（VEGFR-2）、血管内皮生长因子-3（VEGFR-3）、血小板源生长因子-β（PDGFR-β）和c-kit原癌基因,阻断肿瘤新生血管生成,间接抑制肿瘤细胞的生长,从而起到抗肿瘤作用。细胞内和细胞间的信号转导是生物体各种生物学行为的基础,信号通路的异常与肿瘤的关系十分密切。肝癌发生MDR过程中所涉及的各种细胞生理活动,需要依赖于细胞内复杂的信号转导系统与各种激酶的激活。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号转导通路是介导细胞外刺激到细胞内反应的重要信号转导系统,调节着细胞的增殖、分化、凋亡和细胞间相互作用。MAPK是哺乳动物细胞内广泛存在的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,目前,发现了4条平行的MAPK信号转导通路,分别为细胞外信号调节激酶（ERK）通路、c-Jun氨基末端激酶（JNK）通路、p38通路及ERK5/BMK1通路。资料显示,MAPK通路在肿瘤化疗耐药中发挥着重要的作用,抗肿瘤药物能够引起MAPK信号转导系统的激活及MDR的产生。目前大多数研究都认为,ERK的过度激活与许多肿瘤的化疗耐药性存在明显正相关,其作用机制可能是通过调控耐药相关基因和蛋白的表达。通过调节肿瘤细胞MARK激酶系统的表达有可能逆转MDR,成为逆转MDR的新方法。肿瘤靶向治疗的进展随着分子生物学技术的发展和对发病机制从细胞、分子水平的进一步认识而进入一个全新的时代。国内尚未见有关分子靶向药物对肿瘤耐药相关蛋白的影响的研究,而国外研究也只多见于体外研究,有报道,单克隆抗体-西妥昔单抗能逆转大肠癌对化疗药物的耐药性,但是多靶向药物对耐药蛋白的影响尚未见报道。因此,对索拉非尼逆转肝癌耐药的分子机制进行深入研究,可以有计划地联合应用化疗药物和索拉非尼进行治疗,以取得最好的治疗效果,达到最大限度地改善病人生存质量的目的,为肝癌的综合治疗、提高疗效提供理论基础。二、研究目的多靶点药物索拉非尼分别在生长因子与其膜受体结合和细胞内信号转导两个水平上阻断肿瘤血管生成和肿瘤细胞的增殖,能有效的抑制肝癌细胞的生长和血管形成,本研究旨在确定索拉非尼对肝癌细胞多药耐药的逆转作用,寻找出索拉非尼对多药耐药蛋白的影响,并从分子水平和细胞信号转导两个方面探讨索拉非尼对化疗药物多药耐药的可能逆转机制。三、研究方法1.选择肝癌细胞系BEL-7402细胞、肝癌耐药细胞系BEL-7402/5-FU细胞做为实验细胞,测量两种细胞的生长和死亡率曲线、细胞倍增时间、细胞核分裂指数,并以流式细胞仪检测细胞表面P-gp蛋白的表达率。2.以MTT比色法测定（1、2、4、8、16）/μmol/L索拉非尼对BEL-7402/5-FU细胞的剂量效应曲线,并以流式细胞仪检测上述剂量的索拉非尼对BEL-7402/5-FU细胞内罗丹明123（Rho123）浓度的影响,并根据上述实验结果选取合适的索拉非尼实验剂量。3.实验分为三组:BEL-7402细胞组、BEL-7402/5-FU细胞组、BEL-7402/5-FU细胞+sorafenib（4μmol/L）组。3.1以阿霉素（ADM）、健择（GEM）、顺铂（DDP）、氟尿嘧啶（5-FU）四种化疗药物作用上述三组细胞,通过MTT比色法检测细胞存活率的变化,评价上述四种化疗药物对三组细胞的生长抑制作用,并得出细胞的半数抑制率(IC50),以判断化疗药物敏感性,并计算出索拉非尼对肝癌耐药细胞的逆转倍数;3.2流式细胞仪测定三组细胞表面P-gp蛋白的表达率、Rho123的蓄积作用及细胞的周期分布;3.3免疫细胞化学法检测三组细胞表面P-gp、MRP蛋白的表达;3.4半定量PCR及实时荧光定量PCR法检测三组细胞MDR1、MRP基因的mRNA水平的变化;3.5 Western-blot法检测三组细胞P-gp、MRP、ERK、pERK、pJNK蛋白水平并分析相关性。4.统计方法实验数据均采用SPSS 13.0软件进行统计学分析:两样本比较采用独立样本t检验分析。多组样本比较采用One-way ANOVA比较各组细胞的差异,用LSD法进行多重比较;如果方差不齐,采用近似F检验（Welch方法）及多重比较的Tamhane法分析。结果以均数±标准差（（?）±SD）表示,P＜0.05认为有统计学意义。四、结果1.BEL-7402细胞及BEL-7402/5-FU细胞形态均呈上皮样单层排列,每3d～4 d传代一次,对数生长期两种细胞的存活率均＞95%,BEL-7402/5-FU细胞的多核巨细胞较BEL-7402细胞明显增多（P=0.000）。BEL-7402细胞倍增时间为23 h,BEL-7402/5-FU细胞倍增时间为32 h,明显高于BEL-7402细胞（P=0.007）。2.BEL-7402细胞表面P-gp蛋白的表达率为11.64%±1.03%,BEL-7402/5-FU细胞为68.94%±1.45%,显着高于亲本细胞（P=0.000）。传代后BEL-7402细胞分裂指数逐渐上升,到第4 d达到高峰,占69.33‰±0.96‰,培养5 d后,分裂指数开始下降,到第8 d降为最低。传代后BEL-7402/5-FU细胞分裂指数也呈上升趋势,到第5 d达到高峰,占69.83‰±1.82‰,培养6 d后,分裂指数开始下降,到第8 d降为最低。3.索拉非尼在4μmol/L以下对BEL-7402/5-FU细胞无明显毒性,超过此浓度,其毒性呈剂量效应,IC50为（30.69±0.93）μmol/L。当索拉非尼在（1～8）μmol/L浓度时,细胞内Rho123荧光强度随索拉非尼的浓度的增加而升高;当索拉非尼浓度超过8μmol/L时,细胞内Rho123荧光强度不再增加,显示索拉非尼浓度在4μmol/L时逆转效率较高且毒副作用较小。4.对ADM、GEM、DDP、5-FU这四种化疗药物,BEL-7402/5-FU细胞均显示耐药性,其IC50分别为:（16.74±1.12）μmol/L、（253.56±2.41）μmol/L、（11.48±5.45）μmol/L、（893.02±2.55）μmol/L,而BEL-7402细胞相对较敏感,其IC50明显下降（P=0.000）,分别为:（3.56±0.03）μmol/L、（17.82±0.13）μmol/L、（3.35±0.05）μmol/L、（38.31±0.09）μmol/L,耐药细胞较亲本细胞对四种化疗药物的耐药倍数分别为:4.70、14.23、3.30、23.36,经4μmol/L的索拉非尼作用后,耐药细胞BEL-7402/5-FU对各抗癌药的敏感性增强,其IC50明显下降（P≤0.001）,分别为:（5.57±0.57）μmol/L、（35.63±1.30）μmol/L、（5.45±0.88）μmol/L、（88.31±1.60）μmol/L,其逆转倍数分别为:2.98、7.16、1.99、10.08。5.BEL-7402/5-FU细胞经索拉非尼4μmol/L作用24 h后,P-gp表达率为36.34%±1.12%,BEL-7402/5-FU细胞的P-gp表达率为67.44%±1.69%,BEL-7402细胞的表达率为30.66%±1.17%,肝癌耐药细胞BEL-7402/5-FU经索拉非尼作用后,P-gp表达率较用药前明显下降（P=0.002）。6.在Rho123蓄积实验中,BEL-7402细胞内Rho123荧光很强,表达率为76.01%±3.47%,而BEL-7402/5-FU细胞内Rho123荧光很弱,表达率仅为19.83%±1.44%,加索拉非尼4μmol/L后,波峰右移,细胞内荧光明显增强,表达率为49.80%±1.35%,提示索拉非尼可明显增加耐药细胞对Rho123的蓄积（P=0.000）。7.流式细胞仪检测细胞周期显示,索拉非尼可使细胞周期阻滞于G0/G1期,经4μmol/L索拉非尼作用24 h后,BEL-7402细胞、BEL-7402/5-FU细胞、BEL-7402/5-FU+sorafenib组G0/G1期细胞比率分别为:76.48%±1.23%、38.29%±1.40%、56.45%±2.08%,S期细胞比率分别为:15.69%±1.13%、48.15%±1.37%、34.70%±2.79%,加药后BEL-7402/5-FU细胞的G0/G1期细胞比率明显高于用药前（P=0.000）,S期细胞比率明显低于用药前（P=0.000）。8.光学显微镜下观察,P-gp、MRP蛋白阳性反应呈棕黄色,主要位于胞质中,呈细颗粒状均匀分布,耐药细胞BEL-7402/5-FU组表达增加,颜色加深,广泛分布于胞核及胞质中;经4μmol/L索拉非尼作用后的耐药细胞P-gp、MRP蛋白表达明显下降,颜色变浅,胞质内棕黄色颗粒明显减少。9.半定量PCR结果显示:索拉非尼4μmol/L作用BEL-7402/5-FU细胞24 h后,BEL-7402、BEL-7402/5-FU、BEL-7402/5-FU+sorafenib组MDR1/β-actin比值分别为:0.484±0.065、0.776±0.069、0.503±0.082,BEL-7402/5-FU细胞经索拉非尼作用后,MDR1基因表达较用药前下降了27.3%（P=0.004）。MRP/β-actin比值分别为:0.350±0.026、0.698±0.123、0.493±0.024,BEL-7402/5-FU细胞经索拉非尼作用后,MRP基因表达较用药前下降了20.5%（P=0.000）。10.实时荧光定量PCR结果显示:BEL-7402组MDR1基因的CT值为23.65±0.21,β-actin的CT值为20.87±0.16;BEL-7402/5-FU组MDR1基因的CT值为23.85±0.23,β—actin的CT值为19.02±0.13;BEL-7402/5-FU+sorafenib组MDR1基因的CT值为23.33±0.22,β-actin的CT值为19.43±0.15。根据公式计算2-△△CT为2-0.63,故BEL-7402/5-FU+sorafenib组MDR1基因的含量约为BEL-7402/5-FU组的64.62%,逆转率约为35.38%。BEL-7402组MRP基因的CT值为26.83±0.21,β-actin的CT值为20.87±0.16;BEL-7402/5-FU组MRP基因的CT值为26.87±0.23,β-actin的CT值为19.32±0.13;BEL-7402/5-FU+sorafenib组MRP基因的CT值为26.51±0.22,β-actin的CT值为19.43±0.15。根据公式计算2-△△CT为2-0.47,故BEL-7402/5-FU+sorafenib组MRP基因的含量约为BEL-7402/5-FU组的72.20%,逆转率约为27.80%。11.Western-blot结果显示,经4μmol/L索拉非尼作用后,BEL-7402/5-FU细胞P-gp蛋白（0.257±0.014）表达较用药前（0.400±0.014）明显下降（P=0.000）;MRP蛋白（0.253±0.024）表达较用药前（0.396±0.007）明显下降（P=0.000）;ERK蛋白（0.913±0.006）表达较用药前（0.917±0.018）无明显变化（P=0.683）;pERK蛋白（0.663±0.009）表达较用药前（0.934±0.006）明显下降（P=0.000）;pJNK蛋白（0.536±0.007）表达较用药前（0.305±0.009）明显升高（P=0.000）。五、结论1.索拉非尼在体外可明显提高肝癌耐药细胞对化疗药物的敏感性,并可以使细胞周期阻滞于G0/G1期,同时减少S期细胞比率,使肿瘤细胞增殖受阻。2.通过免疫细胞化学、半定量及实时荧光定量PCR、蛋白印迹结果显示,索拉非尼在体外逆转肝癌多药耐药的机制可能是下调MDR1、MRP基因的表达,从而抑制了跨膜转运蛋白的功能,使进入细胞内的化疗药物泵出减少,增加了细胞内化疗药物的浓度,使其对耐药细胞的杀伤作用增强。3.索拉非尼还可以使ERK信号转导通路受抑制,JNK信号转导通路激活,从而使肿瘤细胞增殖受阻,说明索拉非尼逆转肝癌多药耐药的机制还可能与影响MAPK信号转导通路的有关分子相关。4.通过本实验证明索拉非尼在体外表现出较强的逆转肝癌细胞多药耐药性的作用,为进一步深入进行动物体内实验逆转MDR和临床MDR逆转提供了重要的参考价值。
二、多种反义寡脱氧核苷酸联合逆转人肝癌多药耐药性的实验研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、多种反义寡脱氧核苷酸联合逆转人肝癌多药耐药性的实验研究（论文提纲范文）
（1）功能小分子-硫代核酸偶联物的合成及其抗肿瘤应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 重要缩略语中英文对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 纳米药物递送体系分类 |
| 1.2.1 脂质体 |
| 1.2.2 聚合物囊泡 |
| 1.2.3 聚合物胶束 |
| 1.2.4 纳米凝胶体系 |
| 1.2.5 无机纳米粒子 |
| 1.2.6 蛋白载体 |
| 1.2.7 多肽载体 |
| 1.2.8 核酸载体 |
| 1.2.8.1 核酸载体进行小分子药物递送 |
| 1.2.8.2 核酸载体进行大分子药物递送 |
| 1.2.9 其他药物载体 |
| 1.3 核酸化学修饰在药物递送体系中的应用 |
| 1.3.1 核酸药物的化学修饰 |
| 1.3.2 药物分子与核酸的接枝偶联 |
| 1.4 本文究目的、主要内容和意义 |
| 第二章 马来酰亚胺-硫代核酸偶联物促进反义寡核苷酸入胞研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验仪器和药品 |
| 2.2.1.1 实验试剂和药品 |
| 2.2.1.2 实验仪器 |
| 2.2.1.3 核酸序列 |
| 2.2.2 合成部分 |
| 2.2.2.1 苄溴修饰的马来酰亚胺分子(Mal-Bz-Br)的合成 |
| 2.2.2.2 马来酰亚胺-硫代反义寡核苷酸偶联物(Mal-g-ASO)合成 |
| 2.2.3 表征实验 |
| 2.2.3.1 Mal-g-ASO分子识别功能表征 |
| 2.2.3.2 Mal-g-ASO体外RNase H酶依赖m RNA降解功能 |
| 2.2.3.3 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE) |
| 2.2.3.4 非变性PAGE凝胶电泳 |
| 2.2.4 细胞培养 |
| 2.2.5 细胞毒性实验 |
| 2.2.6 流式细胞实验 |
| 2.2.6.1 Mal-g-ASO在不同细胞系中的摄取 |
| 2.2.6.2 不同马来酰亚胺偶联个数对细胞摄取的影响 |
| 2.2.6.3 Mal-g-ASO细胞摄取的时间和浓度依赖性 |
| 2.2.6.4 细胞内吞抑制实验 |
| 2.2.6.5 膜表面巯基抑制实验 |
| 2.2.7 激光共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscopy,CLSM) |
| 2.2.8 Mal-g-ASO的基因沉默作用 |
| 2.2.8.1 qRT-PCR |
| 2.2.8.2 Western blot |
| 2.2.9 细胞凋亡实验 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 Mal-Bz-Br的合成和表征 |
| 2.3.2 Mal-g-ASO的合成和表征 |
| 2.3.3 Mal-g-ASO的细胞摄取行为 |
| 2.3.3.1 Mal-g-ASO在不同细胞中的摄取行为研究 |
| 2.3.3.2 接枝数量、孵育时间和浓度对Mal-g-ASO细胞摄取的影响 |
| 2.3.3.3 Mal-g-ASO细胞摄取机制研究 |
| 2.3.4 CLSM成像结果 |
| 2.3.5 Mal-g-ASO的细胞水平基因沉默和凋亡效应 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 光敏剂-硫代核酸偶联物自组装纳米水凝胶的构建及其光动力、免疫联合治疗研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验仪器和药品 |
| 3.2.1.1 实验试剂和药品 |
| 3.2.1.2 实验仪器 |
| 3.2.1.3 核酸序列 |
| 3.2.2 合成部分 |
| 3.2.2.1 苄溴修饰焦脱镁叶绿酸a合成(PPA-Bz-Br) |
| 3.2.2.2 水溶性硫代核酸-光敏剂偶联物合成(PPA-DNA) |
| 3.2.3 载药DNA四面体纳米凝胶组装 |
| 3.2.3.1 载药DNA四面体的制备(tailed-PPA-TET) |
| 3.2.3.2 药物共递送DNA纳米凝胶制备(siRNA/PPA-NG) |
| 3.2.4 表征实验 |
| 3.2.4.1 PPA接枝含量测定 |
| 3.2.4.2 siRNA/PPA-NG释放siRNA实验 |
| 3.2.4.3 变性PAGE电泳 |
| 3.2.4.4 琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.2.4.5 siRNA/PPA-NG水合粒径和形貌 |
| 3.2.4.6 siRNA/PPA-NG细胞外活性氧(ROS)产生实验 |
| 3.2.5 细胞实验 |
| 3.2.5.1 细胞培养 |
| 3.2.5.2 细胞摄取实验 |
| 3.2.5.3 细胞内ROS产生 |
| 3.2.5.4 MTT实验 |
| 3.2.5.5 蛋白印迹实验(Western Blot) |
| 3.2.6 动物实验 |
| 3.2.6.1 动物 |
| 3.2.6.2 小鼠肿瘤部位药物聚集 |
| 3.2.6.3 PD-L1/PPA-NG免疫学评价 |
| 3.2.6.4 体内抗肿瘤研究 |
| 3.2.6.5 组织病理切片 |
| 3.2.6.6 免疫组化分析 |
| 3.2.6.7 免疫荧光分析 |
| 3.2.6.8 体内肿瘤western blot实验 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 PPA-Bz-Br的合成和表征 |
| 3.3.2 亲水性PPA-DNA偶联物的表征 |
| 3.3.3 载药四面体组装(tailed-PPA-TET) |
| 3.3.4 共递送纳米凝胶的组装和表征 |
| 3.3.5 共递送纳米凝胶细胞水平性能评价 |
| 3.3.5.1 细胞摄取实验 |
| 3.3.5.2 细胞内ROS、细胞毒性研究 |
| 3.3.6 共递送纳米水凝胶体内抗肿瘤评价 |
| 3.3.6.1 体内肿瘤组织药物聚集 |
| 3.3.6.2 体内抗肿瘤免疫评价 |
| 3.3.6.3 体内抗肿瘤效应评价 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 紫杉醇-硫代核酸偶联物多功能靶向球形核酸构建及性能研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验仪器和药品 |
| 4.2.1.1 实验试剂和药品 |
| 4.2.1.2 实验仪器 |
| 4.2.1.3 核酸序列 |
| 4.2.2 合成部分 |
| 4.2.2.1 DNA合成 |
| 4.2.2.2 苄溴修饰的二硫代二丙酸合成(DTPA-Bz-Br) |
| 4.2.2.3 苄溴修饰的紫杉醇分子合成(PTX-Bz-Br) |
| 4.2.2.4 嵌段型两亲性紫杉醇-核酸偶联物的合成 |
| 4.2.3 表征实验 |
| 4.2.3.1 PTX接枝含量测定 |
| 4.2.3.2 载药球形核酸制备 |
| 4.2.3.3 20%变性PAGE电泳 |
| 4.2.3.4 1.0%琼脂糖凝胶电泳 |
| 4.2.3.5 PTX-SNA水合粒径和形貌 |
| 4.2.3.6 临界胶束浓度(Critical micellar concentration,CMC)测定 |
| 4.2.3.7 PTX-SNA的稳定性 |
| 4.2.3.8 PTX-SNA体外响应性药物释放 |
| 4.2.4 细胞实验 |
| 4.2.4.1 细胞培养 |
| 4.2.4.2 PTX-SNA体外细胞摄取行为 |
| 4.2.4.3 体外细胞毒性和抗耐药研究 |
| 4.2.4.4 细胞凋亡实验 |
| 4.2.4.5 qRT-PCR |
| 4.2.4.6 Western blot |
| 4.2.5 动物实验 |
| 4.2.5.1 动物模型建立 |
| 4.2.5.2 体内肿瘤靶向和分布 |
| 4.2.5.3 肝肾毒性实验 |
| 4.2.5.4 体内抗肿瘤研究 |
| 4.2.5.5 体内抗肿瘤耐药研究 |
| 4.2.5.6 组织病理切片 |
| 4.2.5.7 免疫组化分析 |
| 4.2.5.8 免疫荧光分析 |
| 4.2.5.9 体内基因敲除实验 |
| 4.3 结果和讨论 |
| 4.3.1 DTPA-Bz-Br和 PTX-Bz-Br的合成和结构表征 |
| 4.3.2 嵌段型两亲性紫杉醇-核酸偶联物(~(PO)DNA-b-(~(PS)DNA-g-PTX))的结构表征 |
| 4.3.3 PTX-SNA制备和表征 |
| 4.3.3.1 CMC测定 |
| 4.3.3.2 PTX-SNA尺寸、形貌和稳定性研究 |
| 4.3.3.3 PTX-SNA响应性药物释放 |
| 4.3.4 靶向PTX-SNA制备和表征 |
| 4.3.5 靶向PTX-SNAs细胞层面靶向性和抗肿瘤研究 |
| 4.3.5.1 细胞层面肿瘤靶向性研究 |
| 4.3.5.2 细胞层面抗肿瘤研究 |
| 4.3.6 靶向PTX-SNA动物层面靶向性、安全性和抗肿瘤研究 |
| 4.3.6.1 靶向PTX-SNA动物层面靶向性研究 |
| 4.3.6.2 靶向PTX-SNA体内安全性评价 |
| 4.3.6.3 靶向PTX-SNA抗肿瘤研究 |
| 4.3.7 多功能抗耐药PTX-SNA的制备和表征 |
| 4.3.8 多功能抗耐药PTX-SNA细胞水平抗耐药研究 |
| 4.3.8.1 多功能抗耐药PTX-SNA细胞摄取 |
| 4.3.8.2 多功能抗耐药PTX-SNA对耐药细胞抑制作用 |
| 4.3.9 多功能抗耐药PTX-SNA在动物水平对耐药肿瘤抑制作用研究 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 全文总结与展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 工作展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间论文发表情况 |
（2）粉防己碱逆转大肠癌LOVO/5-Fu多药耐药性的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 LOVO/5-Fu耐药细胞系的建立及其MDR和P-gp的表达情况 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 结论 |
| 讨论 |
| 第二部分 粉防己碱逆转大肠癌LOVO/5-Fu细胞多药耐药性的研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 结论 |
| 讨论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| ENGLISH ARTICLEⅠ |
| ENGLISH ARTICLEⅡ |
（3）ERK1/2信号传导通路在逆转肝癌细胞耐药性中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文名词及缩略词表 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 肝癌多药耐药逆转策略的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（5）筛选靶向肝癌Bel-7402/ADM细胞MDR1基因的高效siRNA的实验研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 进一步研究方向 |
| 7 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（6）人原发性肝癌中多药耐药相关蛋白MRP的表达、耐药机制及逆转的研究进展（论文提纲范文）
| 1 MRP的结构 |
| 2 MRP的功能 |
| 3 MRP在正常肝组织和原发性肝癌中的表达 |
| 4 MRP与原发性肝癌耐药 |
| 5 MRP介导人原发性肝癌多药耐药逆转机制的研究进展 |
| 5.1 化学药物逆转MRP |
| 5.2 基因技术逆转MRP |
| 5.3 谷胱甘肽抑制剂逆转MRP |
| 5.4 免疫治疗逆转 |
| 5.5 中药治疗对MRP的逆转 |
| 6 总结与展望 |
（7）乳岩宁方诱导MCF-7细胞凋亡及抑制荷瘤裸鼠微血管生成作用的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 英文缩略语 |
| 文献综述 |
| 综述一 中医乳腺癌研究现状 |
| 综述二 乳腺癌与细胞凋亡及信号转导通路研究进展 |
| 综述三 乳腺癌与肿瘤血管生成研究进展 |
| 正文 |
| 第一部分 乳岩宁对 MCF-7 细胞凋亡的影响及相关作用通路 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第二部分 乳岩宁对 MCF-7 荷瘤裸鼠细胞凋亡影响的实验研究 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第三部分 乳岩宁干预 MCF-7 乳腺癌肿瘤微血管生成的实验研究 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 本研究创新性自我评述 |
| 本实验创新点 |
| 附件 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（8）水蛭提取物对人肝癌HepG2细胞化疗药物敏感性的影响及机制探讨（论文提纲范文）
| 缩略语 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 第一部分 两种提取方法制备的水蛭提取物对人肝癌HepG2细胞增殖抑制作用的对比研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞株来源 |
| 1.2 药物及试剂 |
| 1.2.1 药物 |
| 1.2.2 主要试剂 |
| 1.2.3 试剂配制方法 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.4.1 制备水蛭超微粉 |
| 1.4.2 水蛭提取物的制备 |
| 1.4.3 细胞培养 |
| 1.4.4 MTT法检测水蛭提取物对人肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用 |
| 1.4.5 细胞计数绘制生长曲线 |
| 1.5 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 水蛭提取物对人肝癌HepG2细胞增殖抑制作用的影响 |
| 2.2 水蛭提取物对人肝癌HepG2细胞形态及生长的影响 |
| 第二部分 水蛭提取物对人肝癌HepG2细胞化疗药物敏感性及MDR1、bax mRNA表达的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞株来源 |
| 1.2 药物及试剂 |
| 1.2.1 药物 |
| 1.2.2 主要试剂 |
| 1.2.3 试剂配制方法 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.4.1 水蛭提取物的制备 |
| 1.4.2 细胞培养 |
| 1.4.3 MTT法检测各组药物对人肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用 |
| 1.4.4 流式细胞术测定细胞凋亡和细胞周期 |
| 1.4.5 AO/EB荧光染色观察细胞凋亡形态 |
| 1.4.6 RT-PCR技术检测MDR1和bax mRNA的表达 |
| 1.5 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 水蛭提取物对5-Fu、ADM抑制HepG2细胞增殖作用的影响 |
| 2.2 HepG2细胞的形态变化 |
| 2.3 HepG2细胞的凋亡情况 |
| 2.4 HepG2细胞的周期变化 |
| 2.5 荧光显微镜下HepG2细胞的凋亡形态 |
| 2.6 水蛭提取物对HepG2细胞MDR1和bax mRNA表达的影响 |
| 第三部分 讨论 |
| 1 中医医籍中对水蛭及含水蛭的方剂的记载 |
| 2 水蛭抗肿瘤的现代及临床实验研究 |
| 3 肿瘤细胞的多药耐药基因MDR1及促凋亡基因bax |
| 3.1 多药耐药基因MDR1 |
| 3.2 促凋亡基因bax |
| 4 水蛭提取物对人肝癌HepG2细胞增殖的影响 |
| 4.1 水蛭提取物提取方法对人肝癌HepG2细胞抑制增殖的差异性 |
| 4.2 水蛭提取物对人肝癌HepG2细胞化疗药物敏感性的影响 |
| 4.3 水蛭提取物对人肝癌HepG2细胞MDR1、bax表达的影响 |
| 5 进一步研究与展望 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录1 文献综述 |
| 附录2 攻读硕士学位期间的主要成果 |
（9）反义核酸抑制肝癌细胞生长的研究进展（论文提纲范文）
| 1 增殖细胞核抗原mRNA反义寡核苷酸 |
| 2 血管内皮生长因子mRNA反义寡核苷酸 |
| 3 多药耐药基因mRNA反义寡核苷酸 |
| 4 针对HBV的pre-S2基因区翻译起始位点设计的 反义寡核苷酸 |
| 5 反义Stathmin核酸 |
| 6 反义Survivin核酸 |
| 7 反义胰岛素样生长因子-I寡核苷酸 |
（10）索拉非尼逆转肝癌细胞多药耐药的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 肝癌细胞及肝癌耐药细胞的培养和鉴定 |
| 第一节 材料与方法 |
| 第二节 结果 |
| 第三节 讨论 |
| 第二章 索拉非尼对肝癌耐药细胞的逆转作用 |
| 第一节 材料和方法 |
| 第二节 结果 |
| 第三节 讨论 |
| 第三章 索拉非尼逆转肝癌细胞多药耐药机制的初步探讨 |
| 第一节 材料和方法 |
| 第二节 结果 |
| 第三节 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间研究成果 |
| 致谢 |
| 统计学证明 |
四、多种反义寡脱氧核苷酸联合逆转人肝癌多药耐药性的实验研究（论文参考文献）
- [1]功能小分子-硫代核酸偶联物的合成及其抗肿瘤应用[D]. 郭园园. 上海交通大学, 2020(01)
- [2]粉防己碱逆转大肠癌LOVO/5-Fu多药耐药性的研究[D]. 王开雷. 山东大学, 2020(09)
- [3]ERK1/2信号传导通路在逆转肝癌细胞耐药性中的作用研究[D]. 陈思媛. 厦门大学, 2014(08)
- [4]原发性肝癌MDR耐药性逆转的研究进展[J]. 盛龙,熊茂明. 肝胆外科杂志, 2012(03)
- [5]筛选靶向肝癌Bel-7402/ADM细胞MDR1基因的高效siRNA的实验研究[D]. 盛龙. 安徽医科大学, 2012(01)
- [6]人原发性肝癌中多药耐药相关蛋白MRP的表达、耐药机制及逆转的研究进展[J]. 朱明明,刘斌,李江. 昆明医学院学报, 2012(S1)
- [7]乳岩宁方诱导MCF-7细胞凋亡及抑制荷瘤裸鼠微血管生成作用的实验研究[D]. 邹阳. 辽宁中医药大学, 2010(04)
- [8]水蛭提取物对人肝癌HepG2细胞化疗药物敏感性的影响及机制探讨[D]. 郭永良. 湖南中医药大学, 2009(S1)
- [9]反义核酸抑制肝癌细胞生长的研究进展[J]. 罗晓婷,黄勤,李舒梅. 赣南医学院学报, 2009(02)
- [10]索拉非尼逆转肝癌细胞多药耐药的实验研究[D]. 魏莉. 南方医科大学, 2009(01)