一、胚胎小鼠肝脏Sca-1~+细胞横向分化的研究（论文文献综述）
王雪[1]（2019）在《前列腺上皮组织特征维持及分子调控机制的研究》文中进行了进一步梳理目的:前列腺组织主要由两种类型上皮细胞组成,基底和管腔上皮细胞,两者存在一定的相似性,同时又存在多种因素在两者特异的表型方面参与调控及维持。本论文旨在:（1）研究前列腺基底上皮细胞特征是如何维持的?该过程需要哪些调控因子参与?（2）研究管腔上皮细胞特征是如何维持的?前列腺管腔上皮组织的三大属性,细胞间连接、细胞极性和细胞分裂轴定位三者之间存在怎样的相互作用?方法:通过开展一系列体内体外实验考察上皮间质转化（EMT）转录调控因子在前列腺上皮组织中的表达模式及生物学功能,利用高通量单细胞RNA测序分析及体内实验检测Zeb1表达上皮细胞中富集哪些相关信号通路调节因子来维持基底上皮干细胞亚群的干性、EMT特征和基底细胞的正常发育。通过开展一系列体内体外实验考察细胞间连接蛋白E-cadherin在前列腺上皮组织中的表达模式和黏附连接缺陷小鼠的表型。通过转录组测序分析和生化实验研究管腔上皮细胞特征维持的主要因素细胞间黏附连接蛋白E-cadherin,Scribble细胞极性蛋白复合物及LGN分裂纺锤体定位复合物三者之间的相互关系。所有的统计学检验均为双侧检验。结果:（1）上皮间质转化核心转录因子Zeb1仅阳性表达在前列腺基底上皮细胞层,同时表达上皮和间质细胞相关基因,且Zeb1+基底细胞富集分布在前列腺干细胞存在的近尿道区域。（2）Zeb1+基底细胞在前列腺自发肿瘤模型小鼠和人前列腺样本中均有发现,且比例明显增多,甚至出现了Zeb1+管腔细胞。（3）相比Zeb1-基底细胞,Zeb1+基底上皮细胞具有更强的体外连续类器官形成能力和体内连续肾包膜移植能力,既可以自我更新又可以分化产生其他两种不同类型上皮细胞。（4）体内和体外Zeb1表达缺失造成基底上皮细胞数目急剧减少,基底上皮细胞正常发育过程受阻,但对管腔上皮细胞和内分泌细胞发育并未产生明显影响。（5）活化的Wnt信号通路维持了Zeb1+基底上皮细胞的干性及基底细胞层的表型。（6）成年小鼠前列腺上皮组织中E-cadherin蛋白主要表达在管腔上皮细胞之间,而在零散存在的基底上皮细胞中几乎不表达。（7）在前列腺组织发育、去势再生及成熟等不同时期,E-cadherin表达缺失导致各个组织分叶管腔上皮细胞增殖比例显着增加,促进前列腺肿瘤的发生发展,21个月龄的E-cadherin敲除小鼠基底膜破损,基底上皮细胞缺失,肿瘤细胞浸润至微环境。（8）E-cadherin敲除显着增加了管腔上皮细胞分裂纺锤体轴定位异常的比例,分裂中后期纺锤体轴发生较大角度的异常偏转。同时,E-cadherin敲除导致纺锤体轴定位核心蛋白LGN和NuMA,细胞极性蛋白PAR和SCRIBBLE三元复合物,分布弥散,特异膜定位处结合能力显着下降。（9）相比对照组,E-cadherin敲除组中与促进细胞增殖和迁移相关的信号通路存在富集且表达显着上调,与增强细胞间连接相关的基因表达显着下调,且E-cadherin敲除组与TCGA数据库中人前列腺癌样本分子表达谱具有一定的相似性。（10）分子机制方面,管腔上皮细胞黏附连接蛋白E-cadherin、极性蛋白SCRIB和分裂轴定位蛋白LGN三者之间存在内源性的相互作用,且敲低E-cadherin蛋白表达水平,显着减弱SCRIB和LGN两者之间的结合作用,敲低SCRIB蛋白表达水平,显着削弱E-cadherin和LGN两者之间的结合作用。E-cadherin和LGN蛋白两者与SCRIB蛋白的PDZ结构域特异性结合。结论:（1）前列腺基底上皮细胞层发现一小群EMT转录因子Zeb1+细胞,这群细胞既可以自我更新又可以分化产生其他不同类型上皮细胞,同时对基底上皮细胞的正常发育是必不可少的。（2）前列腺管腔上皮细胞间黏附连接、细胞极性、分裂纺锤体轴定位三者之间存在着紧密的相互作用,E-cadherin/SCRIB/LGN三元蛋白复合物的形成维持了管腔上皮细胞的特征,保证其发育分化过程正常进行和有效地预防前列腺肿瘤的发生发展。科学意义:Zeb1+上皮细胞的发现及其生物学功能的探究,为前列腺上皮组织正常发育和细胞可塑性研究奠定了一定的理论基础,为肿瘤来源细胞（肿瘤起始细胞,肿瘤干细胞）研究提供了新的线索。上皮细胞间黏附连接、细胞极性和分裂轴定位三者之间紧密的相互作用维持了正常的前列腺管腔上皮组织结构,对前列腺组织正常发育和肿瘤发生发展有了新的理论认识,对临床治疗和预后具有重要的指导意义。
巩芷娟[2]（2018）在《HSV-tk小鼠肝损伤修复及其肝癌发生机理研究》文中指出肝脏是人体的重要器官,肝脏的各种损害会导致肝炎、肝纤维化、肝硬化,发展为癌症。为研究肝癌的发病机制,制备能够模仿人类肝损伤复杂过程最终导致肝癌的小鼠模型,对于肝损伤以及肝癌发生的研究都有重要意义。我们在已得到小鼠血清白蛋白调控的肝内表达HSV-tk的转基因小鼠的基础上,制备了3个新的HSV-tk小鼠家系,实验证实,HSV-tk分别整合在染色体的8C3-C4的基因间、5E1-E2的Rufy3和11A1-A2的Abca13内含子中。免疫荧光分析显示HSV-tk在3个小鼠家系肝脏内有不同程度的表达。GCV可以诱导小鼠发生肝损伤,并具有CK19+和α-SMA+细胞增加,血清ALT和AST明显升高。因此,本研究将HSV-tk小鼠作为GCV诱导的肝损伤模型以研究造血干细胞（HSC）宫内注射对肝损伤的修复作用,结果表明在肝脏损伤条件下HSC可以归巢到肝脏并增殖和分化,从而对肝损伤有一定程度的保护和修复效果。HSV-tk小鼠无GCV诱导的情况下,6月龄后发生肝炎和肝癌。肝癌是否与HSV-tk转基因有关,其发生机理如何?为了探讨上述问题,我们分析了HSV-tk小鼠肝癌和肝炎的转录谱,GO富集分析显示癌症小鼠中表达上调的基因主要包括免疫和细胞周期相关基因,表明免疫系统对HSV-tk小鼠肝癌的发生和发展可能具有重要贡献。而肝癌中下调的基因主要富集于脂类代谢相关通路,至使肝癌伴随脂肪变性。将HSV-tk小鼠与已发表的Notch转基因肝癌小鼠的表达谱进行比较。基因探针富集分析（GSEA）结果显示HSV-tk小鼠中免疫相关的信号通路较Notch小鼠上调,而细胞周期和DNA修复信号通路则下调。这表明,免疫/炎症相关的基因高表达是HSV-tk小鼠特有的现象。以上分析结果提示了炎症-细胞周期-癌症三者在肝癌发生中的密切联系。分析TCGA人肝癌数据库,发现免疫/炎症反应的信号通路在人肝癌的部分样本中高表达。本课题研究了HSV-tk小鼠作为GCV诱导肝损伤模型在造血干细胞体内损伤修复中的应用;转录谱分析表明HSV-tk小鼠肝癌发生可能与炎症/免疫信号通路相关,同时脂类代谢障碍在肝炎到肝癌的发展中可能也有一定贡献。为人类与免疫/炎症及脂肪性肝炎相关的肝癌提供了良好的研究模型。
姚远[3]（2015）在《原发性胆汁性肝硬化模型鼠发病过程中造血系统、细胞因子、肠道菌群的作用探究》文中进行了进一步梳理原发性胆汁性肝硬化（简称PBC）是一种由于免疫系统攻击肝内小胆管而引起的慢性胆汁淤积性自身免疫疾病。PBC以对线粒体自身抗原的耐受丢失和小胆管的破坏为特征。晚期病人会出现肝纤维化与肝硬化的发展,严重威胁患者的生命健康。在以往的研究中,我们建立了IL-2Rα（-/-）小鼠作为人类PBC的动物模型。IL-2Rα（-/-）小鼠的血清中出现抗线粒体抗体（AMA）,组织病理学上存在着明显的门脉炎症和胆管破坏,肝脏中存在着CD4+T细胞与CD8+T细胞浸润,多种炎性细胞因子的水平升高。这些结果表明IL-2Rα（-/-）小鼠能够自发自身免疫性胆管炎,并具有多种类似于人类PBC的症状。而且这种小鼠同时自发产生炎症性肠病（简称IBD）,因此IL-2Rα（-/-）小鼠也可以用于研究肠道微环境（包括肠道菌群和肠道炎症）与肝脏炎症的相互作用。前期的研究工作显示,在IL-2Rα（-/-）小鼠中敲除CD4会减轻结肠炎症但不影响肝脏炎症,而敲除CD8会减弱胆管破坏和门脉炎症但不影响结肠炎症。在IL-2Rα（-/-）小鼠中可以发现存在着比野生型对照小鼠增强的Th1和Th17型反应。我们的前期工作证明IL-2Rα（-/-）小鼠的血清IL-12p40水平比IL-2Rα（+/-）小鼠要高。IL-12p40是1L-12与IL-23的共同亚基,IL-12与IL-23均属于IL-12家族,IL-12家族在多种自身免疫病中有着较为重要的作用。尤其是在基于人类PBC的全基因组关联分析研究中,IL-12相关基因被发现与PBC相关。但是IL-12p40在PBC中的具体作用尚不清楚。因此我们尝试在IL-2Rα（-/-）小鼠中敲除IL-12p40以研究IL-12p40在PBC中的作用,结果显示相比IL-2Rα（-/-）小鼠,IL-12p40（-/-）IL-2Rα（-/-）小鼠可以作为一个更好的PBC模型。我们在这个模型之上对于造血干细胞、细胞因子、肠道菌群进行了深入的研究。得到的实验结果如下：1.IL-12p40的敲除加重了IL-IRα（-/-）小鼠的自身免疫性胆管炎症并引起肝纤维化令人惊奇的是p40（-/-）IL-2Rα（-/-）小鼠显示出更加严重的门脉炎症与胆管损伤,但是其肠炎显着减轻。p40（-/-）IL-2Rα（-/-）小鼠高比例出现脾肿大的症状,其脾脏与肝脏细胞数均显着高于IL-2Rα（-/-）小鼠,但肠系膜淋巴结的细胞数要明显低于IL-2Rα（-/-）小鼠。有趣的p40（-/-）IL-2Rα（-/-）小鼠的脾脏细胞数与肝脏细胞数呈正相关,但肠系膜淋巴结的细胞数与肝脏细胞数没有关联。我们通过纤维化评分、羟脯氨酸含量测定、免疫组化、实时定量荧光PCR等多种方法证明,与IL-2Rα（-/-）小鼠最突出的区别是p40（-/-）IL-2Rα（-/-）小鼠能够自发肝纤维化,以此可以模拟PBC患者病程中晚期症状。我们分析了p40（-/-）IL-2Ra（-/-）小鼠的表型,发现T细胞、CD4+T细胞与CD8+T细胞的比例增高。p40（-/-）IL-2Ra（-/-）小鼠的肝脏CD8+T细胞主要是效应性记忆性细胞,而IL-2Ra（-/-）小鼠的肝脏CD8+T细胞主要是中枢性记忆性细胞。p40（-/-）IL-2Ra（-/-）小鼠的肝脏CD4+T与CD8+T细胞主要是PD-1+的细胞,而IL-2Ra（-/-）小鼠的肝脏CD4+T与CD8+T细胞主要是PD-1-的细胞。与IL-2Ra（-/-）小鼠相比,p40（-/-）IL-2Ra（-/-）小鼠的CD4+T细胞分泌IFN-y和IL-10的能力上升,而分泌IL-17A的能力下降。RT PCR的结果也证明p40（-/-）IL-2Ra（-/-）小鼠肝脏中Thl型反应增强,Th17反应受到抑制。2. p40（-/-）IL-2Ra（-/-）小鼠的造血系统异常有趣的是,我们发现p40（-/-）IL-2Ra（-/-）小鼠与野生型小鼠相比,骨髓Lineage c-Kit+Sca-1l田胞（LSK细胞）的数目和比例都有所增加。p40（-/-）IL-2Ra（-/-）小鼠存在着髓外造血现象,表现在脾脏与肝脏中出现LSK细胞。LSK细胞通常被认为包含有造血干细胞（HSC）和前体细胞。p40（-/-）IL-2Ra（-/-）小鼠中的骨髓LSK细胞表型与野生型小鼠相差很大,它们具有更大的细胞体积和颗粒度（高FSC和SSC）,更低的CD86表达,并且CD150/CD48与CD34/CD135的表达方式不同。p40（-/-）IL-2Ra（-/-）小鼠骨髓中红细胞、B细胞和NK细胞的比例与数目均降低,提示我们该小鼠的造血干细胞的造血功能存在障碍。令人惊奇的是,p40（-/-）IL-2Ra（-/-）小鼠的骨髓LSK细胞高表达MHCII类分子,暗示这群细胞可能作为抗原提呈细胞（APC）行使功能,而野生型小鼠则不会出现类似特征。我们发现p40（-/-）IL-2Ra（-/-）小鼠的骨髓T细胞包括CD4+T细胞与CD8+T细胞的比例与数目均显着升高。我们猜测骨髓T细胞对于LSK细胞的异常起着重要的作用。我们检测年龄较小的小鼠的状态,发现3周与4周时的p40（-/-）IL-2Ra（-/-）小鼠出现了明显的脾脏肿大、骨髓T细胞浸润和骨髓LSK细胞异常,而2周的p40（-/-）IL-2Ra（-/-）小鼠却没有这些现象。因此我们假设小鼠在离乳后肠道细菌的改变可能通过T细胞来影响骨髓LSK细胞的异常。我们使用骨髓嵌合的方法,对p40（-/-）IL-2Ra（-/-）小鼠的骨髓造血能力是否改变进行了探究,将Ly5.2p40（-/-）IL-2Ra（+/-）小鼠与Ly5.1p40（-/-）IL-2Ra（-/-）小鼠的骨髓细胞在用红细胞裂解液处理后以1：1的比例进行嵌合,转输给致死剂量辐照过的Ly5.1/5.2小鼠中。8周后杀鼠检测各脏器中来自Ly5.1小鼠与Ly5.2小鼠的细胞的比例。结果证明p40（-/-） IL-2Ra（-/-）小鼠全骨髓的重建能力要低于p40（-/-）IL-2Ra（+/-）小鼠。我们同样进行了骨髓LSK细胞1：1嵌合的实验,结果p40（-/-）IL-2Ra（-/-）小鼠LSK的重建能力要远低于p40（-/-）IL-2Ra（+/-）小鼠,说明p40（-/-）IL-2Ra（-/-）小鼠的骨髓LSK细胞很多都是造血功能较弱的前体细胞。3. IFN-γ是p40（-/-）IL-2Ra（-/-）小鼠造血系统异常的关键细胞因子由于p40（-/-）IL-2Ra（-/-）小鼠的骨髓存在着增强的T细胞浸润并且p40（-/-）IL-2Ra（-/-）小鼠的T细胞高表达IFN-γ,我们猜想T细胞来源的IFN-γ对于LSK细胞失调起着至关重要的作用。我们将p40（-/-）IL-2Ra（-/-）小鼠与IFN-y（-/-）小鼠杂交得到p40（-/-）IFN-y（-/-）IL-2Ra（-/-）小鼠,并与p40（-/-） IL-2Ra（-/-）小鼠进行对比。我们发现p40（-/-）IFN-y（-/-）IL-2Ra（-/-）小鼠依然存在着肝脏炎症,但是不再出现“巨脾”的现象。p40（-/-）IFN-y（-/-）IL-2Ra（-/-）小鼠的T细胞在肝脏与脾脏中的比例并没有改变,其表型依然处于高度活化状态。然而我们发现在p40（-/-）IFN-y（-/-）IL-2Ra（-/-）小鼠骨髓中浸润的T细胞的比例和数目下降,同时该小鼠骨髓中B细胞与红细胞的比例和数目上升。重要的是,p40（-/-）IFN-y（-/-）IL-2Ra（-/-）小鼠的骨髓LSK细胞的比例、数目与表型完全恢复正常,并且几乎不表达MHCII类分子。这证明p40（-/-）IL-2Ra（-/-）小鼠的造血系统异常完全依赖于IFN-γ。4.肠道微生物参与调节p40（-/-）IL-2Ra（-/-）小鼠的肝脏炎症与造血系统为了清除肠道中绝大多数的共生菌,我们用含有氨苄青霉素,甲硝唑,新霉素以及万古霉素这四种抗生素的水从4周龄起饲养SPF级的p40（-/-）IL-2Ra（-/-）小鼠。在抗生素喂养8周后,即小鼠12周时杀鼠。结果发现清除肠道微生物可以显着减轻p40（-/-）IL-2Ra（-/-）小鼠的脾肿大和肝脏炎症。清除了肠道菌的p40（-/-）IL-2Ra（-/-）小鼠的各脏器T细胞的比例和数目下降,并且T细胞的效应性记忆细胞的比例下降,其分泌IFN-γ的能力也下降。清除了肠道菌的p40（-/-）IL-2Ra（-/-）小鼠的骨髓LSK细胞的比例和数目下降,一些LSK细胞异常的特征也得到一定程度的改善。这些数据证明了肠道共生菌在p40（-/-）IL-2Ra（-/-）小鼠中能够促进肝脏炎症和骨髓造血系统异常。我们提取了p40（-/-）IL-2Ra（-/-）小鼠与p40（-/-）IL-2Ra（+/-）小鼠的结肠中粪便的基因组DNA,通过qPCR检测16S RNA类型来测定一些种类细菌的含量。我们将p40（-/-）IL-2Ra（-/-）小鼠根据脾脏重量分成巨脾和非巨脾的2组,并将它们的结果与p40（-/-）IL-2Ra（+/-）小鼠进行对比。有意思的是,非巨脾的p40（-/-）IL-2Ra（-/-）小鼠的放线菌门、β-变形菌纲、γ-变形菌纲与乳酸杆菌群的含量比起巨脾的p40（-/-）IL-2Ra（-/-）小鼠和p40（-/-）IL-2Ra（+/-）小鼠有所增高,而我们并没有观察到巨脾的p40（-/-）IL-2Ra（-/-）小鼠和p40（-/-）IL-2Ra（+/-）小鼠之间存在着差异。非巨脾的p40（-/-）IL-2Ra（-/-）小鼠中失调的肠道菌群可能对于炎症起到了抑制的作用。但是具体是那些细菌在p40（-/-）IL-2Ra（-/-）小鼠中起到何种作用尚不清楚。综上所述,本研究发现p40（-/-）IL-2Ra（-/-）小鼠的自身免疫性胆管炎加重同时结肠炎减轻,并且能够自发肝纤维化,因此比起IL-2Ra（-/-）小鼠能够更好的模拟人类PBC。本研究还发现了p40（-/-）IL-2Ra（-/-）小鼠的造血系统异常,出现了高表达MHCII类分子的造血干细胞样细胞,而这些现象依赖于IFN-γ并且受肠道共生菌调节。利用该疾病模型中可以探讨自身免疫性肝病中,肝脏炎症与造血系统、细胞因子、肠道微环境之间的关系,这为研究PBC的致病机制以及寻找有效的治疗靶点提供了理论依据。
孙洁文[4]（2015）在《鉴定诱导造血干细胞自我更新和扩增的Niche细胞和基因》文中认为我们认为造血干细胞（hematopoietic stem cells,HSC）大量体外扩增可能是解决HSC来源短缺这一困难的最直接而有效的办法。HSC的扩增依赖于骨髓造血微环境（Niche）中的细胞和分子成分的调节。在体外培养体系中,由于脱离了Niche信号的保护,HSC大多因自我更新能力的减弱而耗竭。因此,筛选并鉴定出骨髓造血微环境中参与HSC自我更新调控的细胞和分子,然后利用这些知识在体外模拟骨髓造血微环境（添加保护性因子和去除不良刺激）,可能是构建HSC体外扩增体系的最佳策略。本课题采用两种活跃型骨髓造血微环境模型,即5-FU诱导的小鼠骨髓和发育过程中新生小鼠骨髓。选取正常成年小鼠骨髓作为了正常稳定型骨髓对照。通过比较活跃型骨髓和正常稳定型骨髓中几种代表性的Niche细胞和基因的表达差异,试图筛选出我们感兴趣的具有促进HSC自我更新和扩增的Niche细胞和基因,然后希望利用这些知识优化体外HSC扩增的培养体系。为了研究小鼠造血重建过程中骨髓造血支持细胞的动态变化,我们采用流式细胞仪分析小鼠骨髓CD45-T119-非造血细胞。结果在5-FU处理的实验组中以及小鼠发育实验组中均可以检测到与HSC扩增相伴随的Niche细胞的动态变化。例如CD45-Ter119-CD140a+基质细胞和CD45-Ter119-CD31high血管内皮细胞在5-FU处理后的早期即发生变化,到第2天数目达到最高。此外发现这种细胞在发育早期小鼠的骨髓中含量较高,直到出生2周后含量开始降低并在成年后维持较低水平。提示,这两种细胞可能参与调节HSC的增殖和分化。进一步验证5-FU药物处理后小鼠造血重建过程中骨髓Niche细胞祖细胞的动态变化,我们采用了CFU-F克隆形成实验和M3434克隆形成实验。实验结果表示CD45-Ter119-CD140+骨髓基质细胞具有间充质干细胞的特性,能够形成成纤维集落。为了研究小鼠造血重建过程中骨髓基质细胞中基因表达谱的动态变化,我们分离出小鼠骨髓非造血细胞后进行转录组测序,高通量RNA测序到5066个上调或下调的不同动态表达的基因,数据量极为庞大。通过和信息学专家共同分析,我们鉴定出了与HSC增殖和自我更新相伴随的许多分泌型和膜蛋白基因的变化。我们目前正在对部分这些基因进行功能验证。
何智辉[5]（2013）在《去甲基化对香烟提取物所致小鼠肺气肿模型及内皮祖细胞功能和干细胞抗原-1表达的作用》文中研究指明第一章5-杂氮-2’-脱氧胞苷对香烟提取物所致小鼠肺气肿模型和干细胞抗原-1表达的影响目的：探讨经腹腔注射香烟提取物（Cigarette Smoking Extract,CSE）所致肺气肿小鼠模型的建立,腹腔注射5-杂氮-2’-脱氧胞苷（5-aza-2’-deoxycytidine, AZA）对肺气肿动物模型的保护作用和对干细胞抗原-1（Stem Cell Antigen-1, Sca-1）表达的影响。方法：32只4-6周龄的雄性C57BL/6J小鼠随机分为正常对照组（N组）、AZA （A组）、CSE+AZA （AC组）及CSE（C组）,每组8只,定时定量腹腔注射CSE溶液/AZA溶液/PBS溶液,第28天处理四组小鼠,检测体重变化、Buxco系统及PLY3211小动物肺功能检测系统行肺功能检查、收集标本。肺组织病理切片苏木素-伊红（HE）染色后观察形态学改变并定量测定平均肺泡隔厚度（MAST）、平均内衬间隔（MLI）及肺泡破坏指数（DI）,肺组织TUNEL染色检测肺泡间隔细胞凋亡。将动物模型于造模第28天处死,密度梯度离心法分离小鼠骨髓EPCs并培养7天,Western Blotting检测各组EPCs及肺组织Sca-1蛋白表达,实时定量RT-PCR检测各组EPCs及肺组织Sca-1mRNA表达。结果：（1）（i）4组小鼠体重变化均无统计学差异（P>0.05）。（ii）肺功能比较中,与正常对照组比较,AC组及C组小鼠气道阻力（Raw）显着增高（P<0.01）,动态肺顺应性（Cdyn）、呼气峰流速（PEF）及吸呼比（Ti/Te）降低（P<0.05或P<0.01）,AC组和C组之间肺功能各指标无统计学差异（P>0.05）。（iii）小鼠肺组织HE染色,形态学变化明显,C组肺组织可见肺实质破坏,肺泡间隔断裂,肺泡壁变薄,肺泡腔融合、高度扩大,肺气肿明显。各组MAST比较：与N组比较,A组、AC组和C组MAST均显着降低（P<0.01）；与A组比较,AC组和C组MAST显着降低（P<0.01）；与AC组比较,C组MAST降低（P<0.05）。各组MLI比较：与N组比较,A组、AC组和C组MAST增高（P<0.05或P<0.01）；与A组比较,AC组和C组MAST显着增高（P<0.01）；与AC组比较,C组MAST增高（P<0.05）。各组DI比较：与N组比较,A组、AC组和C组MAST均显着增高（P<0.01）；与A组比较,AC组和C组MAST显着增高（P<0.01）；与AC组比较,C组MAST增高（P<0.05）。（iv）肺组织TUNEL染色,与N组比较,AC组和C组AI显着增高（P<0.01）；与A组比较,AC组和C组AI显着增高（P<0.01）；与AC组比较,C组AI显着增高（P<0.01）。（2）（i）各组EPCs的Sca-1蛋白表达比较：与N组比较,AC组和C组Sca-1蛋白表达量显着降低（P<0.01）；与A组比较,AC组Sca-1蛋白表达量降低（P<0.05）,C组Sca-1蛋白表达量显着降低（P<0.01）；与AC组比较,C组Sca-1蛋白表达量显着降低（P<0.01）。（ii）各组EPCs的Sca-1mRNA表达比较：与N组比较,AC组和C组Sca-1mRNA表达量显着降低（P<0.01）。与A组比较,AC组和C组Sca-1mRNA表达量显着降低（P<0.01）。与AC组比较,C组之间Sca-1mRNA表达量降低（P<0.05）。（iii）各组肺组织的Sca-1蛋白表达比较：与N组比较,A组、AC组和C组Sca-1蛋白表达量均显着降低（P<0.01）；与A组比较,AC组和C组Sca-1蛋白表达量显着降低（P<0.01）；与AC组比较,C组Sca-1蛋白表达量显着降低（P<0.01）。（iv）各组肺组织的Sca-1mRNA表达比较：与N组比较,A组、AC组和C组Sca-1mRNA表达量显着降低（P<0.01）。与A组比较,AC组和C组Sca-1mRNA表达量显着降低（P<0.01）。与AC组比较,C组Sca-1mRNA表达量降低（P<0.05）。结论：（1）腹腔内注射CSE可成功建立小鼠肺气肿模型,缩短建模周期,且肺部形态学改变早于功能改变。（2）去甲基化剂可能通过部分逆转CSE对骨髓EPCs及肺组织Sca-1表达的抑制作用,而发挥对肺气肿动物模型肺功能和肺组织形态学的保护作用。（3）表观遗传学DNA甲基化机制参与了肺气肿的发病机制。第二章5-杂氮-2’-脱氧胞苷对香烟提取物所致内皮祖细胞功能及其干细胞抗原-1表达的影响目的：观察干细胞抗原-1（Stem Cell Antigen-1, Sca-1）在正常小鼠内皮祖细胞（Endothelial Progenitor Cells, EPCs）上的表达,以及5-杂氮-2’-脱氧胞苷（5-aza-2’-deoxycytidine, AZA）对香烟提取物（Cigarette Smoking Extract,CSE）所致EPCs功能及其Sca-1蛋白表达的影响。方法：采用密度梯度离心法分离小鼠骨髓EPCs并培养；通过观察细胞形态学改变、对培养第7天的贴壁细胞行DiI-acLDL摄取及FITC-UEA-I结合双染鉴定及流式细胞术检测细胞表面标志物,综合鉴定EPCs;采用流式细胞术检测EPCs上Sca-1的表达。采用不同浓度和不同干预时间,用CSE溶液、AZA溶液体外干预培养7天的小鼠EPCs,采用噻唑蓝比色法（MTT法）检测EPCs增殖能力,选择最佳干预浓度和干预时间进行后续干预试验。采用贴壁细胞计数检测EPCs粘附能力,培养液中NO浓度测定检测EPCs分泌能力。将培养第7天的EPCs分为四组：正常EPCs组（对照组,N组）,2umol/L AZA干预组（A组）,1%CSE+2umol/L AZA干预组（AC组）和1%CSE干预组（C组）,采用western-blot检测各组Sca-1蛋白表达。结果：（1）培养7天的EPCs呈梭形、纺锤形或多边形,可形成首尾相连网状血管样结构,亦可呈铺路石样外观。其DiI-acLDL摄取及FITC-UEA-I结合双染阳性率为（94.67±4.16）%,其特异性表面抗原FITC-CD34、PE-CD133、APC-Flk-1三阳表达率为（95.07±1.73）%,加上PerCP-Sca-1后的四阳表达率（94.00±1.67）%,其中EPCs的Sca-1阳性表达率为（98.87±0.24）%。（2）（i）不同浓度和不同时间CSE干预后EPCs增殖能力比较：CSE干预3小时,与对照组比较,1%CSE和2.5%CSE组细胞OD值显着增加（P<0.05）,5%CSE和10%CSE组细胞OD值显着下降（P<0.01）；CSE干预6小时,与对照组比较,1%CSE组细胞OD值显着增加（P<0.05）,2.5%CSE、5%CSE和10%CSE组细胞OD值显着下降（P<0.01）；CSE干预24小时,与对照组比较,各CSE浓度干预均使细胞OD值下降（P<0.01）。（ii）选择1%CSE和干预24小时时间点,比较不同浓度5-azaC干预后的EPCs增殖能力：与对照组比较,1%CSE组,1%CSE+2umol/L AZA组,1%CSE+5umol/LAZA组细胞OD值均下降（P<0.05）；与1%CSE组比较,1%CSE+2umol/L AZA组,1%CSE+5umol/L AZA组细胞OD值增加（P<0.05）;1%CSE+2umol/L AZA组,1%CSE+5umol/L AZA组细胞OD值差异无统计学意义（P>0.05）。（iii）选择1%CSE+2umol/LAZA和干预24小时时间点,比较各组EPCs粘附能力和分泌能力：对照组（N组）、1%CSE+2umol/L AZA组（AC组）和1%CSE组（C组）,EPCs贴壁细胞计数比较为：与N组比较,AC组和C组贴壁细胞数显着降低（P<0.01）,与AC组比较,C组贴壁细胞数显着降低（P<0.01）。对照组（N组）、1%CSE+2umol/L AZA组（AC组）和1%CSE组（C组）,EPCs培养液中NO浓度比较为：与N组比较,AC组和C组浓度显着降低（P<0.01）,AC组和C组之间无统计学差异（P>0.05）。（3）正常EPCs组（对照组,N组）,2umol/L AZA干预组（A组）,1%CSE+2umol/L AZA干预组（AC组）和1%CSE干预组（C组）4组EPCs上Sca-1蛋白表达比较：与N组比较,C组Sca-1蛋白表达显着降低（P<0.01）,AC组及A组Sca-1蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）；与C组比较,N组,AC组,A组Sca-1蛋白表达均显着上升（P<0.01）；AC组和A组之间Sca-1蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）。结论：（1）小鼠EPCs高表达Sca-1基因。（2）短时间低浓度的CSE干预使得EPCs的增殖功能代偿性增强,延长干预时间和／或提高干预浓度都将使EPCs的功能降低,甚至完全抑制,呈时间和浓度依赖。（3）DNA甲基化转移酶抑制剂能部分逆转CSE对EPCs上Sca-1蛋白表达的抑制作用,同时改善EPCs的功能,EPCs上Sca-1蛋白表达和EPCs功能改变趋势一致,提示DNA甲基化参与了EPCs功能受损机制,Sca-1DNA甲基化可能参与了EPCs功能受损机制。
陈海旭[6]（2012）在《胚胎期造血细胞分化潜能分析与内皮祖细胞动员剂研究》文中研究说明哺乳动物造血的发生与发育是一个非常复杂的过程，具有严格的时空特异性，在胚胎发育过程中造血位点出现于不同的解剖部位，分别为原始造血和永久造血。原始造血最早是由出现于胚胎第7天（E7.0）的卵黄囊（YS）“血岛”产生原始红细胞，和成年人的红血胞在大小形状、基因表型、细胞激素需求上有差别。但永久造血起源于何处仍存在争议，目前主流认为胚胎初生造血干细胞（HSCs）是多个造血位点共同起源，即卵黄囊和胚体的P-Sp/AGM区，还有认为尿囊和胎盘也可能是发生部位，随后迁移至胎肝大量扩增。研究表明卵黄囊也可产生永久造血干/祖细胞，但由于微环境和其他可能的原因，卵黄囊来源的造血干/祖细胞自我更新能力弱，分化能力强，数量迅速减少。因此，卵黄囊造血表现为胚胎发育过程中第一波的短暂性造血，并不是随后发生的胎肝和骨髓造血的主要来源。近期的一系列研究表明，在E8.25的卵黄囊造血中可以检测出胚胎发育过程中第一波的一过性造血，随着循环系统的形成，在胚体其他部位也出现造血细胞，E8.5的主动脉旁脏层（P-Sp）也出现一波短暂性造血；真正具有长期重建各系造血功能的HSC出现在E10.0的胚内AGM区，并且进一步定位在其中的背主动脉（dorsal aorta，DA）。随后,在胚胎其他的大血管，如卵黄囊动脉以及脐动脉中也发现有造血前体细胞，而且在上述动脉管壁内可见造血细胞簇。由于血液循环系统的建立，定位胚胎期产生的造血干细胞的发生位点是个非常复杂的过程，在研究中，使用合适的胚胎期造血细胞的标志成为研究的关键点之一。CD41，又称αIIb整合素，是众所周知的巨核细胞和血小板的特异性标志，最近研究发现在小鼠胚胎发育过程中CD41的表达标志着原始造血和永久造血的启动发生，并且胚胎发育过程中CD41在YS“血岛”，AGM区和胎盘中都有阶段性表达。内皮细胞、造血细胞和间质细胞在发育过程中关系密切，目前的研究报道主要集中在CD41+细胞向造血分化潜能的研究，然而，小鼠胚胎时期CD41+细胞除造血之外的多向分化潜能尚未阐明清晰。因此，我们拟通过流式细胞仪分选胚胎11.0天（E11.0）的AGM区，卵黄囊和胚胎循环血（CB）中的CD41+细胞，并研究其向间质细胞分化的潜能，为研究胚胎造血发育调控奠定良好的基础。首先我们在体外半固体培养基中进行CD41+细胞造血分化潜能研究，AGM区、YS和CB来源的CD41+细胞生成造血各谱系的能力有一定差异；随后主要在体内外研究了CD41+细胞向间质细胞分化的潜能：（1）体外建立间质细胞诱导体系，探讨小鼠胚胎发育过程中AGM区、YS和CB来源的CD41+细胞向间质细胞分化潜能；（2）建立一个体内评价CD41+细胞向间质细胞分化的动物模型，分选GFP转基因小鼠胚胎发育过程中AGM区、YS和CB来源的GFP+CD41+细胞进行体内移植，通过免疫荧光检测间质细胞分化标志vimentin、α-SMA、epimorphin（EPM）的表达情况来评估其向间质细胞分化能力；（3）根据CD41表达强弱分析和探讨CD41+细胞中具有间质细胞分化潜能的细胞亚群。我们体外实验发现，AGM区的CD41+细胞形成的贴壁的成纤维样间质细胞增殖能力较强，至少能扩增5-6代；YS来源的CD41<sup>+细胞也能生成贴壁的成纤维样间质细胞，但其只能扩增1-2代，增殖能力较弱；CB来源的CD41<sup>+细胞只有很少一部分能生成贴壁的成纤维样间质细胞，大多都是圆形不贴壁的造血细胞。免疫荧光结果表明，无论AGM区还是YS来源的成纤维样间质细胞都表达成纤维母细胞标志vimentin和α-SMA，而CB中只有极少量的甚至无vimentin和α-SMA的表达。体内实验通过建立半致死剂量辐射损伤小鼠模型，移植GFP+CD41+细胞后，从第二周开始直至第四周，检测受体小鼠外周血中GFP表达情况，发现AGM区来源的GFP+CD41+细胞造血重建能力远远强于YS和CB来源的GFP+CD41+细胞，YS来源的GFP+CD41+细胞呈现短暂性造血重建；检测受体骨髓中GFP+CD45+嵌合情况，发现AGM区来源的GFP+CD41+细胞能归巢到受体骨髓进行造血重建，而YS和CB来源的GFP+CD41+细胞很少归巢至骨髓。与此同时，我们在AGM区和YS来源的GFP+CD41+细胞移植组小鼠肺部切片中发现有GFP+细胞，并沿着血管外周形成管腔样结构，对这些GFP+细胞的进一步鉴定表明其表达间质细胞标志vimentin/α-SMA/EPM，并还检测到有少部分细胞表达造血/内皮细胞标志CD31+，而在CB来源的GFP+CD41+细胞移植小鼠肺部并没有发现GFP+细胞的分布。为了进一步确定CD41+细胞中具有间质分化潜能的细胞亚群，我们根据CD41表达强弱，流式分选出AGM区和YS来源的CD41int和CD41high亚群进行体外间质细胞诱导分化，研究表明AGM区和YS来源的CD41+细胞中具有间质细胞分化潜能的一群细胞主要在CD41int中。随后又对AGM区和YS来源的CD41int做了进一步鉴定研究，联合利用CD34标志双色分选出CD41intCD34-和CD41intCD34+细胞，发现AGM区来源CD41intCD34-细胞具有间质细胞分化能力，而CD41intCD34+细胞未观察到间质分化潜能；YS来源CD41intCD34-细胞和CD41intCD34+细胞都具有间质细胞分化潜能。综上所述，我们的研究初步表明：（1）AGM区、YS和CB来源的CD41+细胞体外除了能向造血各谱系分化外，在体内外一定条件下，还能向间质细胞分化，且AGM区来源的CD41+细胞形成的间质细胞增殖能力远远强于YS和CB来源的CD41+细胞。（2）体内移植实验中，只有AGM区和YS来源的CD41+具有间质分化能力，且AGM区来源的CD41+细胞造血重建能力强于YS和CB来源的CD41+细胞。（3）AGM区和YS来源的CD41+细胞中具有间质细胞分化潜能的一群细胞主要在CD41int中。联用CD34标志双标分选出CD41intCD34-和CD41intCD34+细胞中，AGM区来源的CD41intCD34-细胞具有间质细胞分化能力，而CD41intCD34+细胞未观察到；YS来源的CD41intCD34-细胞和CD41intCD34+细胞都具有间质细胞分化潜能。缺血性疾病是一类严重威胁人类健康和生存质量的疾病，包括心脑血管缺血和严重肢体缺血损伤。目前，临床治疗手段主要包括药物治疗、血管旁路重建、血管腔内成形或支架术等,治疗方法无实质性改进，疗效也不理想。“治疗性血管新生”（therapeutic neovascularization）的提出为缺血性疾病的治疗提出新策略，应用内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）植入术可促进缺血组织的血管新生和侧枝循环形成，增强血流灌注，治疗缺血性疾病。外周血中EPCs是同时表达Sca-1和Flk-1表面标志的一群可向血管内皮分化的高增殖潜能前体细胞，可替代凋亡或坏死的内皮细胞，参与损伤后的血管新生。通过外源性移植EPCs可促进缺血心肌和肢体骨骼肌血管的新生。近年来的研究发现干细胞动员药物对治疗缺血性疾病有一定的疗效，可动员自体骨髓中的干细胞到损伤组织，促进血管新生、恢复缺血组织功能，为缺血性疾病的治疗提供了新的思路。干细胞动员过程复杂，SDF-1α/CXCR4轴在骨髓干细胞的迁移与归巢中发挥重要的作用。SDF-1α的趋化作用由其受体CXCR4介导。骨髓中HSCs和EPCs高表达CXCR4，基质细胞分泌SDF-1α对此类细胞具有趋化作用。干细胞归巢与动员是个互为镜像的动态过程。通过扰动SDF-1α/CXCR4轴可大量动员骨髓干细胞进入外周血。缺血、缺氧及组织损伤等病理变化均可使缺血损伤组织SDF-1α的分泌显着增强，形成SDF-1α浓度梯度差，骨髓中高表达CXCR4的EPCs能够沿着SDF-1α的浓度梯度迁移至损伤部位参与修复。但正常外周血中EPCs数量很低，这种代偿性的EPCs动员过程不足以用来修复损伤组织，通过干细胞动员药物则能打破这一限制，大量动员骨髓中EPCs并迁移至缺血组织，促进血管新生，恢复缺血组织功能。目前研究发现的细胞因子包括G-CSF，GM-CSF，VEGF和雌二醇（estradiol），CXCR4拮抗剂AMD3100，及一氧化氮（NO）和血管生成素（angiopoietin）均可不同程度动员骨髓干细胞进入外周血。这些干细胞动员剂对内皮祖细胞的动员效果及促进缺血组织恢复的能力还需进一步改进，部分动员剂反复给药会引发副作用。因此，研发新型、高效、无毒副作用的干细胞动员剂成为研究和开发的热点。本研究中，我们首次研究发现了一种饱和胺类小分子化合物Me6可持续大量动员EPCs，促进缺血组织血管的新生，对下肢缺血性疾病的修复具有一定的作用。我们研究证明Me6皮下给药后小鼠的外周血和脾脏中Sca-1+Flk-1+细胞含量均显着增加。Me6在给药12h后的通过流式检测显示外周血中内皮祖细胞Sca-1+Flk-1+比例是正常血中的3倍（Me61.98±0.13%vs. vehicle control0.71±0.09%），统计分析与对照组间存在显着性差异（**p<0.01），直至72h后外周血中Sca-1+Flk-1+比例恢复正常。脾脏具有募集内皮祖细胞的功能，同时在此作用时间点，脾脏中这群Sca-1+Flk-1+细胞（Me67.33±0.71%vs. vehicle control3.3±0.37%）的比例也上调，统计数据与正常对照组的脾脏中内皮祖细胞数量具有统计学意义（**p<0.01）。流式检测外周血还发现Me6还能显着上调CD34的表达（Me619.5±1.4vs. vehicle control14.8±0.76），而间充质干细胞相关标志并没有明显变化，CD29有轻微上调，CD105没有变化。为进一步评估Me6动员的EPCs促进缺血下肢损伤修复的功能，我们建立了小鼠下肢缺血模型，将Me6或PBS处理小鼠的外周血单个核细胞移植到小鼠下肢缺血损伤肌肉组织中，应用激光多普勒（LDPI）指数（由缺血下肢与正常下肢之比值来计算）经行评估血流灌注恢复效果。结果发现移植了Me6给药小鼠的外周血细胞能明显促进缺血下肢血流灌注的恢复。我们进一步观察了Me6对下肢缺血损伤小鼠的EPCs动员效果。建立小鼠下肢缺血模型在第7天给药检测各组外周血中Sca-1+Flk-1+比例（Me63.09±0.5%; AMD31003.17±0.4%; vehicle control1.49±0.1%），发现结果表明Me6能有效动员下肢缺血损伤小鼠骨髓中的EPCs至外周血中。进一步研究结果证明Me6能直接动员自体骨髓中的EPCs进入外周血，进而被募集到缺血损失组织，分化为血管内皮参与血管新生。对下肢缺血损伤小鼠皮下注射Me6后的治疗效果观察中发现，经Me6治疗的小鼠，其缺血损伤的下肢血流灌注得到了很好的恢复，新生血管数量显着高于对照组。结果表明，Me6能大量高效地动员自体骨髓中Sca-1+Flk-1+内皮祖细胞到外周血，并迁移至缺血部位增殖分化，参与新生血管的形成，增强血流灌注，改善下肢远端血运和氧供。通过初步探索小分子Me6的动员EPCs作用机理发现：Me6通过上调骨髓中MMP-9的表达和释放，从而降解骨髓基质上清中SDF-1α的浓度，并从12h一直持续到48h（49.7%±2.6%）与缺血受损部位之间形成SDF-1α浓度梯度差，同时还明显上调骨髓单个核细胞的CXCR4的表达（Me654.9±6.1%vs. vehicle control29.1±4.3%），并能干扰SDF-1/CXCR4信号通路，降低EPCs对骨髓“龛”的附着能力，促使其从骨髓中释放进入外周血，并向缺血受损组织迁移，进而促进血管新生和功能恢复。我们的研究证明，小分子Me6可持续大量安全有效地动员自体EPCs，促进缺血损伤部位血管再生与血流灌注，修复下肢缺血损伤。进一步开发Me6在治疗下肢缺血性疾病方面的成药性等，有望为临床治疗相关疾病提供很好的治疗手段。此外，心脑血管缺血性疾病与肢体缺血的病变机制相类似，这种自体血管再生手段将为其它缺血性疾病的治疗提供有益的参考。
刘达[7]（2012）在《香烟提取物对小鼠内皮祖细胞增殖能力及干细胞抗原-1表达的影响》文中提出目的：分离提取小鼠内皮祖细胞,测定其表面干细胞抗原-1（Sca-1）的表达并观察不同浓度香烟提取物（CSE）对内皮祖细胞增殖能力和Sca-1表达的影响。方法：从12只健康4周雄性近交系SPF级C57BL/6J小鼠体内取四肢长骨骨髓细胞培养,于第七天取出贴壁细胞做内皮祖细胞鉴定并测定其细胞表面Sca-1表达情况。将内皮祖细胞植入孔板中,分四组,用原培养基继续培养的为对照组；其余三组为低浓度组、中浓度组、高浓度组,分别用浓度为1.0%,2.5%,5.0%的香烟提取物溶液干预。分别在干预后第3小时,第6小时,第24小时用MTT比色法测定活细胞数量。用Western Blot法测定对照组与CSE干预组Sca-1表达差异。结果：1、小鼠源性内皮祖细胞在第七天贴壁后呈现类圆形、纺缍形、梭形或多边形及“铺路石”样外观。它们能摄取DiI-acLDL,胞浆呈红色；与FITC-UEA-I连接,胞膜呈绿色,阳性率为55.30%。并能表达CD34.CD133.和Flk-1阳性,CD34+CD133+CD34+Flk-1+. CD34+CD133+Flk-1+日性率分别为12.28%、0.098%、3.85%。2、MTT比色法测得对照组、低浓度组、中浓度组、高浓度组分别在3小时的OD值为（0.1404±0.0074）、（0.1900±0.0125）、（0.2137±0.0147）、（0.0158±0.0112）：6小时的OD值分别为（0.1444±0.0117）（0.1729±0.0132）（0.0529±0.0156）（0.0054±0.0046）；24小时的OD值分别为（0.1580±0.0013）（0.0834±0.0158）（0.0169±0.0062）（0.0008±0.0011）。CSE干预组OD值均较空白对照组显着降低（p均<0.05）,差异有统计学意义且与对照组相比,各干预组OD值的变化与CSE之间存在浓度、时间依赖性3、流式细胞术显示内皮祖细胞表达Sca-1的阳性率为98.87%。Western-Blot法结果显示与对照组相比,CSE干预组的Sca-1蛋白表达显着下降（0.5657±0.0545vs0.2883±0.0658P<0.05）结论：采用密度梯度离心法和EGM-2MV培养体系能够较好的从小鼠骨髓中分离获取并培养出内皮祖细胞。小鼠源性内皮祖细胞表面可高度表达Sca-1。香烟提取物可同时降低内皮祖细胞增殖能力和Sca-1的表达。
谢晓强[8]（2011）在《G-CSF动员骨髓干细胞向缺血再灌注损伤肾脏归巢并促进肾脏修复的研究》文中指出目的：本研究拟通过肾脏缺血再灌注损伤动物模型的研究,探讨骨髓来源的干细胞在急性肾脏损伤修复中的作用,观察骨髓来源的干细胞能否分化为肾脏实质细胞,深化对干细胞可塑性的认识；观察骨髓干细胞是否可以转化为肾祖细胞,明确肾祖细胞的来源；观察粒细胞集落刺激因子（G-CSF）是否可以有效动员骨髓干细胞进入外周血并向缺血再灌注损伤肾脏归巢,提高1肾脏修复的效能,为急性肾脏损伤的治疗探索新方法。方法：6周龄全身表达绿色荧光蛋白（GFP）的C57BL/6J转基因小鼠提供骨髓,6-8周龄同种无荧光标记的C57BL/6J小鼠20只作为骨髓受体。在接受骨髓移植前,所有受体小鼠接受致死剂量的γ放射线137Cs照射（放射剂量为8.5Gy）照射结束后2小时内静脉注射2×105骨髓单个核细胞。接受骨髓移植5周后,嵌合体小鼠骨髓重建情况经流式细胞仪检测确认。待骨髓重建完毕后（移植后第6周）所有小鼠均结扎左侧肾蒂30min后再开放,建立缺血再灌注动物模型。实验动物分为两组：（1）生理盐水对照组（n=10）：缺血再灌注手术前3天至术后4天,皮下注射生理盐水,0.2ml/d。（2）G-CSF动员组（n=10）：缺血再灌注手术前3天至术后4天,皮下注射人重组粒细胞集落刺激因子200μg/kg/d。动员结束后第1天取外周血通过流式细胞仪检测Sca-1、c-Kit、CD34阳性的干细胞占外周血非红系细胞的比例。缺血损伤再灌注损伤1周后取肾脏标本行HE染色,采用Vyacheslav等的半定量方法评估肾小管损伤程度。观察动员组与对照组肾脏病理损伤程度的差异。用胶原酶将肾脏消化为单个细胞通过对Sca-1、c-Kit、CD34等不同干细胞抗原标志物进行荧光染色,流式细胞仪检测比较两组肾脏中干细胞含量的差异。缺血再灌注损伤4周后通过组织切片荧光组织化学、免疫组织化学等方法观察骨髓来源的干细胞在肾脏内的分化情况,通过统计肾脏血管内皮细胞数量以及骨髓来源的肾祖细胞数量来验证G-CSF动员组与对照组在肾脏损伤修复方面的差异。结果：G-CSF动员后,外周血流式细胞仪检测显示,分别为Sca-1、c-Kit、CD34阳性的三群干细胞占外周血非红系细胞的比例（3.16%±0.11%、3.78%±0.08%、6.09%±0.13%）均高于对照组（1.67%±0.10%、2.19%±0.06%、2.85%±0.14%）,差异有统计学意义（P<0.05）。缺血再灌注损伤1周后,肾脏细胞流式细胞仪检测发现,G-CSF动员组的缺血侧肾脏中,骨髓来源并且分别表达Sca-1、c-Kit、CD34的干细胞（GFP和干细胞抗原表达双阳性）的比例（0.86%±0.05%、0.78%±0.11%、0.90%±0.08%）均高于对照组（0.51%±0.06%、0.47%±0.08%、0.43%±0.03%）,差异有统计学意义（P<0.05）；同时动员组的缺血侧肾脏中骨髓来源GFP阳性细胞的百分比（13.05%±1.14%）也明显高于对照组（7.75%±0.58%）,差异有统计学意义（P<0.05）。缺血再灌注损伤4周后的肾脏组织切片经CD31、SMA、Sca-1免疫荧光染色,可见骨髓来源的干细胞出现在肾小管间隙和肾小球血管簇,并分化为CD31或SMA阳性的肾脏血管内皮细胞,参与损伤后血管新生。在损伤区域的肾小管中出现骨髓来源表达GFP绿色荧光的细胞,骨髓来源的细胞可以分化为肾小管上皮细胞,参与了肾小管损伤的修复。在肾脏间质中还可以观察到GFP和Sca-1双阳性的骨髓来源的肾祖细胞。通过对比G-CSF动员组和对照组的肾脏,发现动员组在缺血缺血再灌注损伤1周后肾小管损伤程度评分分值（1.46±0.05）明显低于对照组（2.32±0.16）差异有统计学意义（P<0.05）。损伤4周后G-CSF动员组的肾脏中表达血管内皮标志CD31的细胞数目（31.30±0.42）高于生理盐水对照组（20.05±0.58）差异有统计学意义（P<0.05）。通过对骨髓来源的肾祖细胞的计数发现G-CSF动员组中GFP与Sca-1双阳性的细胞数（6.00±0.82）多于对照组（3.50±0.58）,差异有统计学意义（P<0.05）结论：（1）骨髓来源的干细胞可以参与损伤后肾脏的血管新生、肾小管细胞再生以及肾脏修复；（2）G-CSF可以有效动员骨髓干细胞进入外周血并向缺血肾脏归巢；（3）G-CSF动员可以减轻小鼠缺血肾脏的组织病理学损伤程度；（4）G-CSF动员可以通过促进缺血肾脏内血管新生及骨髓来源的细胞分化为肾祖细胞,提高肾脏修复的效能；（5）骨髓来源的细胞可以分化为肾脏干细胞,即肾祖细胞,证实了部分肾祖细胞可能来源于肾脏以外的推测。
刘波[9]（2010）在《肝卵圆细胞移植治疗肝纤维化与肝功能不全的实验研究》文中研究表明目的：建立一种稳定而确实可靠的肝卵圆细胞分离方法,为后续的实验研究奠定基础。方法：参照Bryon等的报道,利用携带GFP（绿色荧光蛋白）转基因C57BL/6小鼠12只,2只作为空白对照,10只喂以含浓度为0.1%的3,5-二乙酯基-1,4二氢三甲基毗啶（DDC）,刺激卵圆细胞的增生。而后利用两步酶灌注法分离出肝非实质细胞,以Sca-1抗体标记的免疫磁珠分选方法加以纯化分离出携带有GFP的SCa-1+细胞。结果：DDC喂养小鼠6周后,病理切片结果显示肝组织内可见明显的肝卵圆细胞增生反应。分离每只小鼠得可到约106/ml的非肝实质细胞,培养扩增约5d后可见克隆样生长的卵圆细胞,通过Sca-1抗体标记的免疫磁珠分选提纯。电镜下细胞直径10-15μm,呈铺路石样排列,多角形,折光性强,核大,卵圆形,胞浆少,核仁明显。经过鉴定,分离得到的Sca-1+细胞符合卵园细胞的形态学表现,也表达胆管上皮的表面标记OV-6及肝细胞的表面标记AFP,分离纯度达95%以上。结论：该方法稳定可靠,可为肝卵圆细胞的相关研究提供较为理想的研究手段。目的：研究肝卵圆细胞在治疗小鼠肝纤维化疾病中的有效性。方法：SPF级C57BL/6小鼠利用皮下注射四氯化碳的方法,建立小鼠肝纤维化模型。40只肝纤维化模型小鼠分为两大组,将两大组小鼠根据是否继续皮下注射CCl4分为A、B两组,其中A组为施予处理后（HOCA或NSA）,继续皮下注射CCl4,B组为施予处理后（HOCB或NSB）,不再皮下注射CCl4,每小组10只小鼠。4周后观察肝功能各项指标、羟脯氨酸及胶原纤维及肝脏的病理改变,比较各组间的差别。结果：卵圆细胞经脾脏移植后入肝,在共聚焦激光显微镜下可以观察到肝组织中存在GFP阳性细胞,这些细胞主要分布于门脉区。在A组继续皮下注射CCl4时,NSA组的ALT.AST均明显升高；而HOCA组ALT.AST明显降低,同时升高TP.ALB；HOCA组与NSA组两两比较,差异有统计学意义（P＜0.05）；在B组未继续皮下注射CCl4时,各组ALT.AST均下降,而且下降至近似正常水平,TP和ALB有升高,但两两比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。肝脏病理学检测,在继续皮下注射CCl4情况下,治疗组肝纤维化程度有减轻,NSA组则呈典型肝纤维化改变；在未继续皮下注射CCl4情况下,两组肝纤维化程度都有不同程度减轻,HOCB组缓解更为明显。结论：携带GFP的基因卵圆细胞经短暂体外培养扩增,经脾注射肝纤维化小鼠体内后,可定植于受者肝脏内（主要聚集于汇管区）,并可缓解肝纤维化的进展,促进肝纤维化的逆转。目的：比较肝卵圆细胞与骨髓间充质干细胞治疗小鼠肝纤维化的疗效差别。方法：利用皮下注射四氯化碳的方法,建立小鼠肝纤维化模型。将肝纤维化/肝硬化成模小鼠60只随机分为6组,即HOC移植治疗组A （HOCA）、HOC移植治疗组B （HOCB）, MSC移植治疗组A （MSCA）和MSC移植治疗组B （MSCB）,对照组A（NSA）和对照组B（NSB）,每组10只。根据不同的组别经脾分别输入卵圆细胞、生理盐水（NS）或四氯化碳。4周后观察肝功能各项指标、羟脯氨酸及胶原纤维及肝脏的病理改变,比较各组间的差别。结果：SPF级C57BL/6小鼠85只,其中6只行骨髓间充质干细胞提取,79只行肝纤维化模型制作,成功造模64只（成功率81%）。分别对两组大鼠肝脏羟脯氨酸及胶原纤维含量这两项指标进行检测,统计分析发现两指标在各组间总体比较均有统计学差别（p＜0.05）。在继续皮下注射CCl4情况下,比较各组间差异显示HOCA组与MSCA组及NSA组之间的差异均有统计学意义（P＜0.05）,而MSCA组与NSA组间无统计学意义（p>0.05）；在未继续皮下注射CCl4情况下,进一步比较各组间差异显示三组间均无统计学意义（p>0.05）。病理组织学检测结果,在未继续皮下注射CCl4情况下,各组肝纤维化程度都有不同程度减轻,肝纤维化程度HOC。组<MSCB组<NS。组,其中HOCB组肝纤维化程度减轻最为明显；在继续皮下注射CCl4情况下,肝纤维化程度HOCA组<MSCA组<NSA组,NSA组呈典型肝硬化改变。结论：肝卵圆细胞和骨髓间充质干细胞经脾注射移植后,均能不同程度改善肝纤维化小鼠的肝功能,减轻其肝硬化的程度,但肝卵圆细胞的治疗效果更为明显。肝卵圆细胞移植可作为肝硬化疾病的一种新型的治疗方法进一步研究。
许丹[10]（2009）在《胚胎干细胞参与形成的融合细胞对损伤肝细胞作用的研究》文中研究指明当人们发现体细胞在体外被诱导通过融合可以被病毒感染的现象后,关于细胞间融合的研究便迅速展开并不断深入。目前,由病毒或化学方法介导的细胞间融合已成为基因表达分析、染色体图谱、抗体生产及癌症免疫治疗的有力工具之一。细胞融合在个体发育、疾病发生和治疗等诸多领域发挥着极其重要的作用,如受精、肌肉、骨骼和胎盘的发育,以及由干细胞调控的组织再生等过程中无不突显它的身影。细胞间融合被认为是干细胞作用于组织再生过程的一种重要机制。诸如肝、肌肉、骨和软骨等组织在损伤后可以重建,机体接受损伤信号后,损伤部位本身的或迁移入损伤部位的干细胞经过增殖和分化后完成组织重建。然而,这种关于重建的理解并不能解释发育过程中干细胞或它们的后代是如何迁至机体最合适部位的?但是,如果是因为干细胞与该组织的实质细胞发生了融合,就可以解释上述问题。融合已被证明是作用于组织再生的一种重要机制。融合后的细胞可以扩增和分裂,修饰后的杂合细胞将成为再生医学和细胞移植疗法的又一新的种子细胞。然而人们对细胞融合过程的了解甚少。在损伤环境中,融合细胞是如何发挥作用的?融合细胞作用的机制是什么?融合细胞在特定的环境中会怎样发生变化?目前还尚未见相关研究的报道。因此,本研究将胚胎干细胞参与形成的融合细胞作为研究对象,探讨融合细胞在损伤微环境中的作用与变化情况。重序论是现今被广泛认可的干细胞作用于组织重建机制的一种学说。通过将体细胞与胚胎源性细胞融合,或通过转导几种多能性相关的关键因子,体细胞的基因组可以被重序。干细胞与分化终末细胞的融合可以重序终末分化细胞的DNA,从而可以调控终末分化细胞的潜能和细胞命运。当异核体形成或“合子”形成后,染色体发生混合（非同源重组）或受到来源于干细胞的细胞因子（包括转录因子）作用后,终末分化细胞的DNA可以发生重序。可见,“合子”的形成会使细胞具有“多能化”的特性从而直接改变其表型。体外实验证明,异核体具有遗传重序的潜能,形成的杂合细胞拥有多能性,与ES细胞的特征相似。因此,基于以上理论,本研究假设,融合后的重编程化的细胞在损伤微环境中,以干细胞的方式作用于组织再生与损伤修复是融合细胞的作用机理。本研究首先建立了体外损伤细胞模型。试验使用氧化损伤剂H202对人胎肝细胞系L-02细胞进行了损伤。如果损伤过于严重,细胞将大量死亡使后继试验无法进行。如果损伤达不到一定程度,细胞自身有修复功能,那么细胞将在短时间内自我修复,这也将影响到后继试验的进行和试验结果的分析。因此,损伤模型的建立进行了多浓度、多时间点的摸索与比较,以筛选到适合的损伤条件。通过分析损伤后细胞的活力、损伤相关酶的分泌及功能性蛋白的分泌,制备了H202作用于L-02细胞的时效量效曲线。最后选择C3=200μM处理2小时为最适损伤浓度和损伤时间,并将其作为最佳损伤条件,建立了L-02细胞的体外损伤模型。融合在组织损伤修复过程中的作用,其中争论最多的是融合发生率问题,很多研究人员都以融合的偶发率作为驳斥融合理论的证据。但是到目前为止,对融合率的确定都是建立在分析特异性标志物的基础上,比如用FISH技术和鉴定Y染色体存在等方法。但是这些检测方法的“丢失率”很高。因此,在本实验中我们将ES细胞与转GOF-18质粒的损伤体细胞共培养后,用最直接的核型分析方法检测损伤微环境中融合的发生率。共培养48小时后,在统计细胞总数及非整倍体细胞中染色体数目后发现,在ES细胞与损伤肝细胞共培养体系中非整倍体的发生率比正常对照组高出近12倍。通过核型分析和荧光检测发现,共培养系统中的非整倍体细胞为两种亲本细胞的融合产物。同时,与对照组相比,损伤相关酶活性检测的结果也显示：共培养以后损伤被明显地抑制了。通过基因表达及蛋白表达分析发现,ES细胞在共培养以后分化成了肝细胞特性细胞。以上结果均说明将ES细胞与损伤的肝细胞直接共培养以后产生了非整倍体的融合细胞,损伤被修复。融合的发生率比以往报道的发生率要高。这暗示了融合在一定程度上对组织的损伤修复是有作用的。本试验中还有一个比较重要的发现,ES细胞在与损伤的肝细胞共培养以后,分化成了肝细胞特性的功能性肝上皮细胞,这为ES细胞的体外定向分化又提供了一种新的方法。同时提示是否分化为组织特异性细胞是重序的融合细胞作用于组织修复的一种方式,因为由ES细胞产生的重序的融合细胞也是多能性的。在证明共培养有利于损伤修复和确定了融合在细胞损伤修复过程中的重要作用以后,为了更深入地研究融合细胞如何在损伤细胞与ES细胞的共培养过程中发挥作用,本试验进一步用PEG诱导的方法,获得了人源转GOF-18质粒的肝细胞与小鼠源ES细胞的融合细胞,并运用多种方法,对融合细胞进行融合鉴定及重序鉴定。筛选得到的融合细胞中,有85%以上的细胞表达了EGFP,证明了融合细胞的形成。融合细胞在器官形成、组织再生和癌形成中都有重要的作用。但是对融合细胞的命运及功能的研究还很少。因此,基于以上的试验结果,试验计划在体外的损伤微环境中研究了融合细胞的命运和功能。有众多的研究都报道来源于多能性细胞和体细胞的融合细胞中,体细胞的基因组会被重序,它们的融合产物具有与胚胎干细胞一样的多能性,因此本研究假设,融合细胞在损伤环境中,会像ES细胞一样发挥作用。基于上述的试验结果,试验将获得的融合细胞与损伤的肝细胞用transwell进行共培养。试验用Annexin-V/PI双染色法、FACS和Western-blot方法对损伤细胞进行了损伤细胞的凋亡状况分析。结果发现,在整个p53相关的凋亡通路中,随着共培养的进行,凋亡促进因子（p53, Bax, BC1-2, caspase-3）呈现级联式的下调,其中,Bax的表达变化最为显着。通过RT-PCR分析,试验发现内源性的Bax在抑制凋亡的过程中起主要作用。与对照组相比,信号通路中的其它因子虽有变化但不明显。这说明在共培养过程中,Bax对凋亡抑制作用是非常重要的。试验证明共培养以后,H202诱导肝细胞的损伤通过抑制细胞凋亡的方式被修复了。,通过与融合细胞的共培养,L-02细胞的凋亡被有效地抑制了,凋亡的抑制可能与Bax相关信号通路相关。通过分析基因表达模式和蛋白表达方式,结果显示融合细胞分化成了肝上皮细胞样细胞,具有分泌功能的肝细胞特性。分化后的融合细胞呈AFP、ALB（肝细胞标记）和CK8&18（上皮细胞标记）阳性。而且融合细胞中重新表达有转录活性的肝脏特异性的基因不仅有人源的也有小鼠源性的,这证实了本研究的假设：融合细胞可以像ES细胞一样发挥功能,融合细胞具有双向分化的能力。近期相继的研究都报道了将体细胞与干细胞融合后,融合细胞会重序为“干细胞样”细胞,甚至转导入几种关键性因子后体细胞都能在体外被重序为“胚胎干细胞样”细胞。本试验用免疫荧光的方法,再次证实了融合细胞定向地分化成了肝上皮细胞。另外,在分析损伤相关的酶的活性及肝功能蛋白的分泌后发现,与对照组相比,这些酶的活性逐渐趋向于正常的肝细胞的分泌量。ALB分泌的持续增加再次证明了分化的融合细胞为功能性的肝细胞。本试验证明特定的条件下（共培养）,重序后的融合细胞有分化成组织特异性细胞的能力,就像ES细胞的定向分化能力一样。在建立了体外细胞氧化损伤模型后,本研究首先通过共培养ES细胞与损伤细胞来分析融合在损伤微环境中的发生情况及其作用。在确定了融合对损伤的修复作用后,试验进一步对融合细胞在共培养环境中的命运和功能进行了分析。结果表明,在损伤的微环境中,融合细胞会像多能性胚胎干细胞一样分化成肝上皮细胞样细胞,抑制损伤细胞的凋亡,促进细胞增殖并修复损伤。本试验首次将融合细胞直接用于损伤修复的研究中,并首次在损伤微环境中对融合细胞命运及功能进行了体外的检测和分析。试验同时还提供了一种胚胎干细胞定向分化的新方法。
二、胚胎小鼠肝脏Sca-1~+细胞横向分化的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、胚胎小鼠肝脏Sca-1~+细胞横向分化的研究（论文提纲范文）
（1）前列腺上皮组织特征维持及分子调控机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 存在的科学问题 |
| 1.3 研究技术路线 |
| 1.4 科学意义 |
| 第一部分 前列腺基底干细胞维持基底上皮细胞特征和正常发育 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 上皮组织概述 |
| 1.2 基底上皮细胞特征维持中的EMT机制及分裂模式 |
| 1.3 EMT特征维持的信号通路 |
| 第二章 实验材料与操作方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物及人组织样本 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器耗材 |
| 2.2 实验操作方法 |
| 2.2.1 小鼠基因型鉴定 |
| 2.2.2 原代细胞获得及细胞流式分选 |
| 2.2.3 细胞甩片及免疫荧光染色 |
| 2.2.4 冰冻切片及免疫荧光染色 |
| 2.2.5 石蜡切片及其H&E染色 |
| 2.2.6 质粒抽提实验 |
| 2.2.7 病毒制备及目的细胞感染 |
| 2.2.8 类器官培养及功能检测 |
| 2.2.9 泌尿生殖窦间质细胞分离及培养 |
| 2.2.10 原代前列腺上皮细胞分离及肾包膜移植实验 |
| 2.2.11 谱系示踪实验 |
| 2.2.12 单细胞RNA测序和数据分析 |
| 2.2.13 实时定量聚合酶链式反应 |
| 2.2.14 蛋白免疫印迹 |
| 2.2.15 统计学分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 发现EMT转录因子表达的前列腺上皮细胞 |
| 3.2 高通量单细胞RNA-seq发现Zeb1~+前列腺上皮细胞群 |
| 3.2.1 获得前列腺基底上皮单细胞 |
| 3.2.2 获得高质量单细胞RNA测序数据 |
| 3.2.3 单细胞RNA-seq数据分析得到Zeb1~+基底上皮细胞亚群 |
| 3.3 Zeb1~+上皮细胞与前列腺上皮组织之间的相关性研究 |
| 3.3.1 成功构建Zeb1 荧光报告小鼠 |
| 3.3.2 Zeb1 在前列腺上皮细胞中的分布及表达模式 |
| 3.4 Zeb1~+前列腺基底上皮细胞的生物学功能研究 |
| 3.4.1 体外Zeb1~+基底上皮细胞类器官形成实验 |
| 3.4.2 体内Zeb1~+基底上皮细胞肾包膜移植实验 |
| 3.4.3 体内谱系示踪Zeb1~+基底上皮细胞多向分化的命运 |
| 3.4.4 Zeb1 保证基底上皮细胞正常发育 |
| 3.5 Wnt信号通路正向调控Zeb1~+基底上皮细胞 |
| 3.5.1 单细胞RNA-seq数据显示Zeb1~+基底上皮细胞富集Wnt信号通路 |
| 3.5.2 qRT-PCR实验结果支持单细胞RNA-seq数据分析结果 |
| 3.5.3 APCmin模型小鼠中Zeb1~+基底上皮细胞比例显着增多 |
| 3.6 研究模型图及小结 |
| 第四章 实验结论、讨论及展望 |
| 4.1 实验结论 |
| 4.2 讨论和展望 |
| 4.3 科学意义 |
| 第二部分 细胞连接、细胞极性和细胞分裂轴定位共同维持前列腺管腔上皮细胞的组织特征 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 上皮细胞极性的建立及维持 |
| 1.1.1 上皮细胞极性组成-PAR complex |
| 1.1.2 上皮细胞极性组成-Scribble complex |
| 1.1.3 上皮细胞三种极性蛋白复合物之间的互作及应用 |
| 1.2 上皮细胞间连接的建立及功能 |
| 1.3 细胞分裂模式基础知识 |
| 1.3.1 细胞分裂模式相关分子调控机制 |
| 1.3.2 细胞分裂模式研究的应用 |
| 第二章 实验材料与操作方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物、细胞系、质粒 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器耗材 |
| 2.2 实验操作方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 石蜡切片及其免疫组织化学染色 |
| 2.2.3 细胞增殖 |
| 2.2.4 细胞实时示踪实验 |
| 2.2.5 内源性免疫共沉淀 |
| 2.2.6 GST-pull down实验 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 黏附连接蛋白集中表达及分布在成年小鼠前列腺管腔上皮细胞间 |
| 3.1.1 qRT-PCR结果显示黏附连接蛋白集中分布在前列腺管腔上皮细胞间 |
| 3.1.2 免疫荧光染色结果表明黏附连接蛋白集中分布在前列腺管腔上皮细胞间 |
| 3.2 黏附连接E-cadherin缺失促进前列腺管腔上皮细胞增殖能力及肿瘤发生发展 |
| 3.2.1 体外E-cadherin表达下调促进前列腺上皮细胞增殖能力 |
| 3.2.2 E-cadherin前列腺特异性敲除小鼠模型构建及表型探究 |
| 3.3 黏附连接蛋白E-cadherin表达缺失导致细胞分裂轴定位异常 |
| 3.3.1 体外黏附连接蛋白表达下调严重影响细胞分裂轴正确定位 |
| 3.3.2 体内黏附连接缺陷造成管腔上皮细胞分裂轴偏转随机化 |
| 3.3.3 体外黏附连接蛋白表达下调显着减弱蛋白LGN-NUMA的结合能力 |
| 3.3.4 体内黏附连接缺失导致LGN蛋白复合物细胞膜分布异常 |
| 3.4 黏附连接蛋白E-cadherin丢失导致细胞极性蛋白复合物弥散分布 |
| 3.4.1 体外敲低黏附连接蛋白表达水平显着削弱蛋白DLG-SCRIB的结合能力 |
| 3.4.2 体内黏附连接缺失造成细胞极性蛋白复合物分布异常 |
| 3.5 考察细胞连接、细胞极性和分裂轴定位三者间的互作及分子机制 |
| 3.5.1 RNA-seq分析结果支持细胞连接、极性和分裂轴定位之间存在紧密互作 |
| 3.5.2 增殖活跃的E-cadherin蛋白表达缺失的管腔上皮细胞更易发生肿瘤转化 |
| 3.5.3 E-cadherin/SCRIB/LGN三元复合物的形成维持前列腺管腔上皮组织结构 |
| 3.6 研究模型图及小结 |
| 第四章 实验结论、讨论及展望 |
| 4.1 实验结论 |
| 4.2 讨论和展望 |
| 4.3 科学意义 |
| 全文总结 |
| 1.1 研究总结 |
| 1.2 研究创新性 |
| 1.3 科学意义 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间已发表或录用的论文 |
（2）HSV-tk小鼠肝损伤修复及其肝癌发生机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 符号说明 |
| 引言 |
| 引言参考文献 |
| 1 不同家系HSV-tk转基因小鼠GCV诱导肝损伤的研究 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 实验讨论 |
| 参考文献 |
| 2 应用HSV-tk小鼠研究HSC宫内移植治疗GCV诱导肝损伤 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 实验讨论 |
| 参考文献 |
| 3 HSV-tk转基因小鼠肝癌发生的研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 实验讨论 |
| 参考文献 |
| 小结 |
| 附录Ⅰ 肝癌与正常对照相比上调的信号通路 |
| 附录Ⅱ 骨髓干细胞修复肝损伤的机制 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术文章 |
（3）原发性胆汁性肝硬化模型鼠发病过程中造血系统、细胞因子、肠道菌群的作用探究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 目录 |
| 图序 |
| 表序 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 自身免疫性疾病 |
| 1.1.1 自身免疫性疾病简介 |
| 1.1.2 T细胞概论 |
| 1.1.3 IL-12家族 |
| 1.2 自身免疫性肝脏疾病 |
| 1.2.1 自身免疫性肝脏疾病简介 |
| 1.2.2 原发性胆汁性肝硬化(PBC)简介 |
| 1.2.3 原发性胆汁性肝硬化的动物模型 |
| 1.2.4 肝纤维化 |
| 1.2.5 IL-2Rα(-/-)小鼠的研究工作 |
| 1.3 造血干细胞 |
| 1.3.1 造血干细胞简介 |
| 1.3.2 造血干细胞受到免疫系统的调节 |
| 1.4 肠道菌群 |
| 第二章 实验材料及方法 |
| 2.1 小鼠信息 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.2.1 病理制片及H&E染色 |
| 2.2.2 小鼠各脏器的细胞分离 |
| 2.2.3 流式检测细胞表面分子及细胞因子分泌能力 |
| 2.2.4 小鼠基因型鉴定(Genotyping) |
| 2.2.5 小鼠粪便基因组提取 |
| 2.2.6 肝脏组织的mRNA提取与逆转录 |
| 2.2.7 Real-Time PCR |
| 2.2.8 Dynabeads分选细胞 |
| 2.2.9 流式细胞仪分选细胞 |
| 2.3 实验仪器 |
| 2.4 实验操作步骤 |
| 2.4.1 病理制片 |
| 2.4.2 H&E染色 |
| 2.4.3 组织病理打分标准 |
| 2.4.4 小鼠的各脏器细胞分离 |
| 2.4.5 流式检测细胞表面分子与细胞因子分泌能力 |
| 2.4.6 小鼠基因型鉴定(Genotyping) |
| 2.4.7 小鼠表型鉴定(Phenotyping) |
| 2.4.8 小鼠粪便基因组提取 |
| 2.4.9 肝脏组织mRNA提取、逆转录与qPCR |
| 2.4.10 血清ALT的测定 |
| 2.4.11 Dynabeads去除细胞 |
| 2.4.12 流式细胞仪分选细胞 |
| 2.4.13 小鼠的辐照 |
| 2.4.14 免疫组化 |
| 2.4.15 肝脏羟脯氨酸的含量测定 |
| 2.4.16 统计学分析方法 |
| 第三章 (第Ⅰ部分)实验结果 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠的自身免疫性胆管炎与结肠炎 |
| 3.2.1 敲除IL-12p40加重IL-2Rα(-/-)小鼠的自身免疫性胆管炎 |
| 3.2.2 敲除IL-12p40减轻IL-2Rα(-/-)小鼠的自身免疫性结肠炎 |
| 3.2.3 p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠出现与肝脏炎症相关的脾肿大现象 |
| 3.3 在IL-2Rα(-/-)小鼠中敲除IL-12p40引起肝纤维化 |
| 3.4 p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠的T细胞表型与细胞因子分泌能力发生改变 |
| 3.4.1 p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠的肝脏与脾脏中T细胞的比例与数目增高 |
| 3.4.2 p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠的T细胞表型的改变 |
| 3.4.3 p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠T细胞分泌细胞因子的能力发生改变 |
| 3.4.4 p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠的肝脏中细胞因子mRNA的变化 |
| 3.5 小结与讨论 |
| 第四章 (第Ⅱ部分)实验结果 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠的骨髓LSK细胞增多并发生表型改变 |
| 4.2.1 p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠的骨髓LSK细胞的比例与数目增高 |
| 4.2.2 p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠的骨髓LSK细胞的分群发生改变 |
| 4.2.3 p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠的骨髓LSK细胞高表达MHCII类分子 |
| 4.2.4 p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠的骨髓LSK细胞大小与颗粒度增高 |
| 4.2.5 小结与讨论 |
| 4.3 p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠的骨髓LSK细胞分化能力发生异常 |
| 4.3.1 p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠的骨髓成熟细胞的比例与数目发生改变 |
| 4.3.2 p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠的骨髓各种前体细胞的比例与数目发生改变 |
| 4.3.3 p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠的肝脏与脾脏中各亚群细胞的比例与数目 |
| 4.3.4 小结与讨论 |
| 4.4 年幼的p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠的骨髓细胞表型 |
| 4.5 p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠的骨髓造血能力下降 |
| 4.5.1 p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠与p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠的骨髓嵌合实验 |
| 4.5.2 小结与讨论 |
| 4.6 p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠的骨髓LSK细胞中LT-HSC表型改变 |
| 4.6.1 p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠的骨髓LT-HSC细胞的比例与数目 |
| 4.6.2 p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠的骨髓LT-HSC细胞高表达MHCII类分子并上调Sca-1表达 |
| 4.6.3 小结与讨论 |
| 4.7 进一步的研究计划 |
| 4.7.1 体外实验验证高表达MHCII类分子的LSK细胞能否发挥抗原提呈的功能 |
| 4.7.2 体内实验验证T细胞能否特异性调节LSK细胞的分化 |
| 4.7.3 骨髓嵌合实验验证p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠的骨髓LT-HSC的造血能力 |
| 第五章 (第Ⅲ部分)实验结果 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 IFN-γ的敲除对于p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠外周免疫系统的影响 |
| 5.2.1 IFN-γ(-/-)p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠的脾脏与肝脏细胞的比例与数目 |
| 5.2.2 IFN-γ(-/-)p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠的脾脏T细胞更加活化 |
| 5.2.3 小结与讨论 |
| 5.3 IFN-γ(-/-)p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠的骨髓造血系统恢复正常 |
| 5.3.1 IFN-γ(-/-)p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠的骨髓LSK细胞的比例与数目 |
| 5.3.2 IFN-γ(-/-)p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠的骨髓成熟细胞的分群 |
| 5.3.3 小结与讨论 |
| 5.4 进一步研究计划 |
| 5.4.1 杂交CD4或CD8缺陷的p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠以研究何种细胞导致了造血系统异常 |
| 5.4.2 骨髓嵌合实验验证IFN-γ(-/-)p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠的骨髓造血功能 |
| 5.4.3 分选3种小鼠的骨髓LT-HSC并进行RNA测序检测 |
| 第六章 (第Ⅳ部分)实验结果 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 清除肠道菌对p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠外周免疫系统的影响 |
| 6.3 清除肠道菌对p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠骨髓造血系统的影响 |
| 6.3.1 清除肠道菌影响p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠骨髓LSK细胞 |
| 6.3.2 清除肠道菌影响p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠骨髓细胞的分群 |
| 6.4 粪便中不同种类细菌的16S RNA基因检测 |
| 6.5 小结与讨论 |
| 6.6 进一步研究计划 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
| 附录 |
（4）鉴定诱导造血干细胞自我更新和扩增的Niche细胞和基因（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1 造血干细胞 |
| 1.1 造血干细胞概述 |
| 1.2 造血干细胞的自我更新 |
| 2 骨髓造血微环境 |
| 2.1 骨髓造血微环境的组成和结构 |
| 2.2 Niche细胞对HSC的调节 |
| 2.2.1 成骨细胞和血管内皮细胞对HSC的调控作用 |
| 2.2.2 MSC及各种基质细胞对HSC的调节作用 |
| 2.2.3 神经细胞和神经递质对HSC的调节 |
| 2.2.4 破骨细胞 ,巨噬细胞和脂肪细胞对HSC的调节作用 |
| 2.3 骨髓细胞外基质对HSC的调控 |
| 2.4 细胞外因子调控造血干细胞的自我更新 |
| 2.4.1 发育相关分子对HSC的调控作用 |
| 2.4.2 造血细胞因子诱导的生存、增殖和分化信号与HSC自我更新 |
| 2.4.3 炎性因子诱导的生存和死亡信号与 HSC 自我更新 |
| 2.4.4 应急信号和抗衰老信号与HSC自我更新 |
| 2.4.5 趋化因子和黏附分子信号与HSC自我更新 |
| 3 HSC的发育和Niche的形成 |
| 4 本课题相关研究进展及研究意义 |
| 4.1 国内外研究现状分析 |
| 4.2 研究目的及意义 |
| 第二章 小鼠造血重建和增殖过程中骨髓非造血细胞的动态变化 |
| 0 前言 |
| 1 实验材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 小鼠 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.15-FU处理成年小鼠 |
| 1.3.2 繁殖获得新生小鼠 |
| 1.3.3 主要试剂的配制 |
| 1.3.4 小鼠原代骨髓细胞样品的制备 |
| 1.3.5 台盼蓝染色细胞计数 |
| 1.3.6 细胞抗体染色 |
| 1.3.7 流式细胞仪分析 |
| 1.3.8 统计学分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 5-FU处理后小鼠非造血细胞比例变化趋 |
| 2.1.1 5-FU诱导的小鼠骨髓TNC计数 |
| 2.1.2 流式分析 5-FU处理后小鼠的骨髓非造血细胞 |
| 2.1.3 流式分析 5-FU处理后小鼠骨髓基质细胞和内皮细胞的变化 |
| 2.1.4 流式分析 5-FU处理后不同分化阶段的小鼠骨髓间充质干细胞 |
| 2.1.5 流式分析 5-FU处理后不同分化阶段的小鼠骨髓内皮细胞 |
| 2.2 发育过程中小鼠骨髓非造血细胞比例变化趋势 |
| 2.2.1 发育过程小鼠骨髓TNC计数 |
| 2.2.2 流式分析小鼠发育过程中的骨髓非造血细胞 |
| 2.2.3 流式分析小鼠发育过程中不同分化阶段的间充质干细胞 |
| 2.2.4 流式分析小鼠发育过程中不同分化阶段的骨髓内皮细胞 |
| 3 讨论 |
| 第三章 小鼠造血重建和增殖过程中骨髓Niche细胞祖细胞的动态变化 |
| 0 前言 |
| 1 实验材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 小鼠 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 5-FU处理成年小鼠 |
| 1.3.2 主要试剂的配制 |
| 1.3.3 小鼠全骨髓细胞CFU-F克隆形成实验 |
| 1.3.4 Wright-Giemsa染色 |
| 1.3.5 小鼠原代骨髓非造血细胞样品的制备 |
| 1.3.6 小鼠原代LSK细胞样品的制备 |
| 1.3.7 台盼蓝染色细胞计数 |
| 1.3.8 细胞抗体染色 |
| 1.3.9 MethoCultTM3434 克隆形成实验 |
| 1.3.10 TaqMan定量PCR |
| 1.3.11 统计学分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 CFU-F集落形成实验 |
| 2.2 M3434 克隆形成实验 |
| 2.3 CD45-Ter119-CD140a+细胞、CD45-Ter119-CD31high细胞表达较高的HSC促进因子 |
| 3 讨论 |
| 第四章 小鼠造血重建和增殖过程中骨髓非造血细胞基因表达谱的动态变化 |
| 0 前言 |
| 1 实验材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 小鼠 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 5-FU处理成年小鼠 |
| 1.3.2 繁殖获得新生小鼠 |
| 1.3.3 主要试剂的配制 |
| 1.3.4 小鼠骨髓非造血细胞负选分离与裂解释放RNA |
| 2 实验结果 |
| 2.1 测序序列质量评估 |
| 2.2 小鼠非造血细胞转录组测序 |
| 2.2.1 骨髓非造血细胞差异基因聚类热图分析 |
| 2.2.2 骨髓非造血细胞基因表达的时间序列聚类表达模式分析 |
| 2.2.3 骨髓非造血细胞差异基因Gene Ontology（GO）数据库分析 |
| 2.3 分泌型分子和膜蛋白分子差异基因的检测 |
| 2.4 新基因的检测 |
| 3 讨论 |
| 研究小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附件 |
（5）去甲基化对香烟提取物所致小鼠肺气肿模型及内皮祖细胞功能和干细胞抗原-1表达的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 5-杂氮-2’-脱氧胞苷对香烟提取物所致小鼠肺气肿模型和干细胞抗原-1表达的影响 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 材料与主要试剂、仪器 |
| 1.2.2 实验方法及步骤 |
| 1.2.3 统计学分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 各组小鼠体重及肺功能比较 |
| 1.3.2 肺组织病理学改变及形态分析 |
| 1.3.3 肺组织细胞凋亡比较 |
| 1.3.4 骨髓源EPCs上Sca-1蛋白的表达 |
| 1.3.5 肺组织Sca-1蛋白的表达 |
| 1.3.6 骨髓源EPCs上Sca-1 mRNA的表达 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 肺气肿动物模型的建立 |
| 1.4.2 肺气肿动物模型中骨髓EPCs和肺组织中Sca-1的表达 |
| 1.5 结论 |
| 第二章 5-杂氮-2’-脱氧胞苷对香烟提取物所致内皮祖细胞功能及其干细胞抗原-1表达的影响 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料与主要试剂、仪器 |
| 2.2.2 实验方法及步骤 |
| 2.2.3 统计学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 EPCs形态学变化 |
| 2.3.2 EPCs摄取DiI-acLDL及结合FITC-UEA-I双染鉴定 |
| 2.3.3 贴壁细胞表面标志物及Sca-1表达 |
| 2.3.4 不同浓度CSE干预后不同时间点EPCs增殖能力比较 |
| 2.3.5 1%CSE与不同浓度AZA干预24小时后EPCs增殖能力比较 |
| 2.3.6 EPCs粘附能力比较 |
| 2.3.7 EPCs分泌能力比较 |
| 2.3.8 EPCs表面Sca-1蛋白表达的比较(western-blot) |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的主要研究成果 |
| 致谢 |
（6）胚胎期造血细胞分化潜能分析与内皮祖细胞动员剂研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 第一部分 E11.0 小鼠 AGM 和 YS 来源的 CD41~+细胞间质分化潜能的研究 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一节 CD41~+细胞的体外分化潜能研究 |
| 实验流程 |
| 材料方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 第二节 CD41~+细胞体内间质分化潜能研究 |
| 实验流程 |
| 材料方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 第三节 AGM 区和 YS 来源的 CD41~+细胞中具有间质细胞分化潜能亚群的分析 |
| 材料方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 小分子 Me6 动员内皮祖细胞促进下肢缺血损伤修复的研究 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一节 Me6 动员内皮祖细胞动力学分析 |
| 实验流程 |
| 材料方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 第二节 Me6 动员内皮祖细胞治疗下肢缺血的效果评价 |
| 实验流程 |
| 材料方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 第三节 Me6 通过动员内皮祖细胞机制探讨 |
| 材料方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 已发表文章 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（7）香烟提取物对小鼠内皮祖细胞增殖能力及干细胞抗原-1表达的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 试剂与仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 统计分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 细胞形态学变化 |
| 3.2 DiI-acLDL摄取及FITC-UEA-I结合双染鉴定 |
| 3.3 流式细胞术检测细胞表面标志变化 |
| 3.4 MTT比色法测定内皮祖细胞的增殖能力 |
| 3.5 流式细胞术测定内皮祖细胞上Sca-1的表达 |
| 3.6 Western blot法测定CSE干预对Sca-1蛋白表达的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 小鼠源性内皮祖细胞的分离培养及鉴定 |
| 4.2 CSE对小鼠源性内皮祖细胞增殖能力的影响 |
| 4.3 Sca-1在小鼠源性内皮祖细胞上的表达及CSE对其表达的影响 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）G-CSF动员骨髓干细胞向缺血再灌注损伤肾脏归巢并促进肾脏修复的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 对象和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（9）肝卵圆细胞移植治疗肝纤维化与肝功能不全的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 肝卵圆细胞的分离与体外扩增 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要的试剂及药品 |
| 1.2 主要试剂的配制 |
| 1.3 主要的仪器及设备 |
| 1.4 动物的选择及喂养 |
| 1.5 肝脏标本的采集 |
| 1.6 卵圆细胞的分离培养 |
| 1.7 卵圆细胞的纯化 |
| 1.8 卵圆细胞的鉴定 |
| 1.8.1 组织切片 |
| 1.8.1.1 常规石蜡切片的制作 |
| 1.8.1.2 苏木精—伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色 |
| 1.8.1.3 免疫组化染色 |
| 1.8.2 纯化卵圆细胞的进一步鉴定 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 卵圆细胞经脾脏移植治疗小鼠肝纤维化的实验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要的试剂及药品 |
| 1.2 主要试剂的配制 |
| 1.3 主要的仪器及设备 |
| 1.4 动物的选择及喂养 |
| 1.5 肝纤维化模型的建立 |
| 1.6 麻醉及移植方法的建立 |
| 1.7 卵圆细胞治疗实验性肝纤维化的研究 |
| 1.7.1 动物的分组及处理 |
| 1.7.2 标本的采集 |
| 1.7.3 疗效的评价 |
| 1.7.3.1 分别进行以下指标的检测 |
| 1.7.3.2 肝功能指标 |
| 1.7.3.3 肝脏羟脯氨酸(Hyp)含量测定 |
| 1.7.3.4 肝脏胶原纤维含量 |
| 1.7.3.5 肝纤维化病理学分级 |
| 1.7.3.6 移植后卵圆细胞在肝脏内的定居 |
| 1.7.4 数据处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 小鼠的一般情况变化 |
| 2.2 肝纤维化的建模情况 |
| 2.3 卵圆细胞的分布情况 |
| 2.4 小鼠肝功能指标的变化 |
| 2.5 肝脏羟脯氨酸和胶原纤维含量的变化 |
| 2.6 病理组织学的分级变化情况 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 卵圆细胞与骨髓间质干细胞经脾移植治疗实验性小鼠肝纤维化的疗效比较 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要的试剂及药品 |
| 1.2 主要试剂的配制 |
| 1.3 主要的仪器及设备 |
| 1.4 动物的选择及喂养 |
| 1.5 肝纤维化模型的建立 |
| 1.6 骨髓间充质干细胞的分离与培养 |
| 1.6.1 骨髓细胞的采集 |
| 1.6.2 密度梯度离心法分离MSC及培养 |
| 1.7 MSC的鉴定 |
| 1.7.1 小鼠MSC表面标记的测定 |
| 1.7.2 体外诱导成骨细胞鉴定 |
| 1.8 麻醉及移植方法的建立 |
| 1.9 HOC与MSC移植治疗实验性肝纤维化的疗效比较 |
| 1.9.1 动物的分组及处理 |
| 1.9.2 标本的采集及疗效的评价 |
| 1.9.2.1 标本的采集 |
| 1.9.2.2 疗效的评价 |
| 1.9.2.2.1 分别进行以下指标的检测 |
| 1.9.2.2.2 肝功能指标 |
| 1.9.2.2.3 肝脏羟脯氨酸(Hyp)含量测定 |
| 1.9.2.2.4 肝脏胶原纤维含量 |
| 1.9.2.2.5 肝纤维化病理学分级 |
| 1.9.3 数据处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 MSC的鉴定结果 |
| 2.1.1 MSCs的形态学观察 |
| 2.1.2 MSCs的鉴定 |
| 2.2 小鼠的一般情况变化 |
| 2.3 小鼠肝功能指标的变化 |
| 2.4 肝脏羟脯氨酸和胶原纤维含量的变化 |
| 2.5 病理组织学的分级变化情况 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述一 干细胞研究进展 |
| 综述二 肝卵圆干细胞研究进展 |
| 攻读学位期间公开发表的学术论文及科研课题 |
| 致谢 |
（10）胚胎干细胞参与形成的融合细胞对损伤肝细胞作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 细胞融合与融合细胞 |
| 引言 |
| 1 融合在各物种中的作用及机制 |
| 1.1 酵母的配对融合 |
| 1.2 线虫体内合胞体的形成 |
| 1.3 成肌细胞的融合 |
| 1.4 哺乳动物巨噬细胞的融合 |
| 1.5 哺乳动物体内修复和组织重建过程中的细胞融合 |
| 2 细胞骨架肌动蛋白和细胞融合 |
| 3 细胞间融合和其它非融合细胞生化过程 |
| 第二章 细胞融合与组织损伤修复 |
| 引言 |
| 1 体内细胞融合参与的组织损伤修复 |
| 2 细胞融合、组织修复与癌症 |
| 3 体内外干细胞参与的融合 |
| 3.1 成体干细胞多能性与细胞融合 |
| 3.2 融合产生的条件 |
| 3.3 未出现融合的原因分析 |
| 第三章 融合细胞与细胞核重序 |
| 引言 |
| 1 融合后重序细胞的表观遗传修饰 |
| 2 与ESC、ECC、EGC融合后产生的体细胞重序 |
| 3 ESC参与的融合事件与体细胞核的重序 |
| 4 融合过程中诱导重序的因素 |
| 5 诱导产生的多能性干细胞 |
| 第四章 融合细胞与癌症发生 |
| 引言 |
| 1 “干细胞融合”模型与肿瘤形成 |
| 1.1 干细胞融合模型与癌症形成 |
| 1.2 BMDSC参与发生的融合与癌症的发生 |
| 1.3 干细胞融合模型的监测和应用 |
| 2 骨髓来源细胞与肿瘤细胞的融合 |
| 3 细胞融合与非整倍体的形成 |
| 4 融合细胞共表达亲本双方的特性 |
| 6 病毒与细胞融合 |
| 7 细胞融合与抗癌 |
| 第二部分 试验部分 |
| 第五章 损伤细胞模型的建立 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 细胞株 |
| 2.2 试剂及配制 |
| 2.3 试验仪器 |
| 3 试验方法 |
| 3.1 L-02细胞培养 |
| 3.2 H_2O_2诱导肝细胞氧化性损伤模型的建立 |
| 3.3 SGOT、SGPT、LDH和MDA含量测定 |
| 3.4 MTT法 |
| 3.5 总蛋白提取及定量 |
| 3.6 蛋白质定量 |
| 3.7 DNA ladder制备 |
| 3.8 统计分析 |
| 4 试验结果 |
| 4.1 MTT |
| 4.2 MDA |
| 4.3 LDH |
| 4.4 SGOT和SGPT |
| 4.5 DNA损伤检测 |
| 5 讨论 |
| 第六章 胚胎干细胞与损伤细胞的共培养 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 细胞株 |
| 2.2 试剂及配制 |
| 2.3 试验仪器 |
| 2.4 试验方法 |
| 2.5 统计分析 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 共培养体系中融合的发生率 |
| 3.2 融合状态的确定 |
| 3.3 共培养体系中胚胎干细胞的行为特征 |
| 3.4 损伤的修复 |
| 4 讨论 |
| 4.1 共培养体系中较高的融合发生率 |
| 4.2 非整倍体细胞的存在方式 |
| 4.3 共培养过程中的ES细胞 |
| 4.4 损伤的修复 |
| 第七章 融合细胞的获得及鉴定 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 细胞株 |
| 2.2 试剂及配制 |
| 2.3 试验仪器 |
| 2.4 试验方法 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 转基因细胞的鉴定 |
| 3.2 融合细胞的鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 融合产生的重序现象 |
| 4.2 融合剂与融合效率 |
| 4.3 融合细胞 |
| 第八章 共培养体系中损伤细胞的变化 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 试剂及配制 |
| 2.3 试验仪器 |
| 2.4 实验方法 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 L-02细胞的凋亡分析一：形态学分析 |
| 3.2 L-02细胞的凋亡分析二：流式细胞仪分选 |
| 3.3 共培养的损伤细胞的p53凋亡通路中主要蛋白的表达状况 |
| 3.4 共培养的损伤细胞中Bax mRNA的表达状况 |
| 4 讨论 |
| 4.1 损伤细胞凋亡的抑制 |
| 4.2 共培养体系 |
| 第九章 共培养体系中融合细胞的变化 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 试剂及配制 |
| 2.3 试验仪器 |
| 2.4 实验方法 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 Transwell小室中融合细胞的形态 |
| 3.2 共培养过程中融合细胞的基因表达模式 |
| 3.3 分化的融合细胞的细胞学及功能特性 |
| 3.4 损伤的修复 |
| 4 讨论 |
| 全文结论及创新 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 致谢 |
四、胚胎小鼠肝脏Sca-1~+细胞横向分化的研究（论文参考文献）
- [1]前列腺上皮组织特征维持及分子调控机制的研究[D]. 王雪. 上海交通大学, 2019(06)
- [2]HSV-tk小鼠肝损伤修复及其肝癌发生机理研究[D]. 巩芷娟. 上海交通大学, 2018(05)
- [3]原发性胆汁性肝硬化模型鼠发病过程中造血系统、细胞因子、肠道菌群的作用探究[D]. 姚远. 中国科学技术大学, 2015(09)
- [4]鉴定诱导造血干细胞自我更新和扩增的Niche细胞和基因[D]. 孙洁文. 上海师范大学, 2015(07)
- [5]去甲基化对香烟提取物所致小鼠肺气肿模型及内皮祖细胞功能和干细胞抗原-1表达的作用[D]. 何智辉. 中南大学, 2013(03)
- [6]胚胎期造血细胞分化潜能分析与内皮祖细胞动员剂研究[D]. 陈海旭. 中国人民解放军军事医学科学院, 2012(11)
- [7]香烟提取物对小鼠内皮祖细胞增殖能力及干细胞抗原-1表达的影响[D]. 刘达. 中南大学, 2012(02)
- [8]G-CSF动员骨髓干细胞向缺血再灌注损伤肾脏归巢并促进肾脏修复的研究[D]. 谢晓强. 天津医科大学, 2011(01)
- [9]肝卵圆细胞移植治疗肝纤维化与肝功能不全的实验研究[D]. 刘波. 中南大学, 2010(11)
- [10]胚胎干细胞参与形成的融合细胞对损伤肝细胞作用的研究[D]. 许丹. 南京农业大学, 2009(06)