一、深低温对造血细胞活力的影响（论文文献综述）
高欣[1]（2021）在《RAGE/sRAGE通过调控转移前微环境促进非小细胞肺癌骨转移的机制研究》文中研究指明研究背景与目的肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,全球每年新增患者超过220万例,死亡近180万例。其中,非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）占比高达85%。骨是NSCLC最常见的转移部位之一,30-40%的NSCLC患者会发生骨转移。骨转移常引起严重的后果。一方面,骨转移被视为加速患者死亡进程的“分水岭”,NSCLC患者骨转移发生后的中位生存期仅有6-8个月,相比于其他常见的NSCLC转移部位（神经系统、肝脏、肾上腺等）,骨转移是生存期更短的转移类型。另一方面,骨转移极易引起骨相关并发症,包括骨痛、病理性骨折、甚至产生脊髓压迫引起瘫痪,严重降低了患者的生活质量。目前,临床上针对NSCLC骨转移癌常用治疗方法的疗效并不理想。因此,从分子水平探索NSCLC骨转移的发生机制,寻找调控NSCLC骨转移的关键基因作为治疗靶点,具有极为重要的意义。NSCLC发生骨转移是一个复杂且被精细调控的过程。“种子与土壤”学说指出,恶性肿瘤的骨转移并不是一个随机的事件,而是骨组织（土壤）为肿瘤细胞（种子）提供了适宜的生长环境,从而诱导肿瘤细胞在多种分子和信号通路调节下的发生的主动选择的结果。事实上,肿瘤细胞尚未发生骨转移之前,就已经分泌细胞外囊泡、分泌因子等多种物质经血液循环作用于骨微环境中,招募骨髓来源细胞及免疫抑制细胞,与骨基质细胞共同重塑骨微环境,促进骨微环境向有利于肿瘤细胞定植和生长的方向转变,形成转移前微环境。作为骨转移发生过程中的早期事件,转移前微环境的形成在NSCLC骨转移中起到重要作用,阻断转移前微环境的形成有助于从源头上减少NSCLC骨转移的发生。因此,本课题拟通过表达谱芯片的方式寻找并筛选出调控NSCLC骨转移的关键基因,明确其在骨转移过程中所发挥的作用及其调控机制,尤其关注该基因在转移前微环境形成中所扮演的角色。研究方法1.首先,我们分别收集了NSCLC原发灶和骨转移灶病人组织样本各10例进行表达谱芯片检测寻找差异表达的基因。将差异表达基因按照在NSCLC中表达量由高到低进行排序,并通过对排名前20的基因进行文献调研筛选出NSCLC骨转移相关基因RAGE。接下来,我们在细胞、组织和病人三个层面验证RAGE与NSCLC骨转移的相关性:选取具有高骨转移倾向的NSCLC细胞株A549-L6和普通NSCLC细胞系A549,通过Western Blot和q RT-PCR实验比较二者之间RAGE表达水平的差异;通过免疫组化染色检测NSCLC原发灶和骨转移灶中RAGE表达水平的差异;利用公共数据库中基因检测数据和病人临床信息,分析RAGE表达量与NSCLC患者骨转移之间的联系。2.接下来,我们从“种子”和“土壤”两方面对RAGE及其可溶性形式s RAGE在NSCLC骨转移中所发挥的作用进行了探究。我们构建了敲减RAGE的A549和H1299稳转细胞株,并通过MTS和Transwell实验探索RAGE有无促进NSCLC细胞（种子）增殖和侵袭的作用;通过成骨前体细胞招募及分化实验明确s RAGE在改造骨微环境（土壤）中的作用;我们收集了s RAGE处理后成骨性细胞的条件培养基,并通过粘附、克隆形成和MTS实验探究经s RAGE改造后的成骨性细胞（土壤）对NSCLC细胞（种子）粘附、定植和增殖的促进作用是否得到增强;通过构建转移前微环境动物模型及左心室注射肿瘤转移模型在体内探究s RAGE是否能够通过调控转移前微环境的形成而促进NSCLC骨转移。3.最后,在机制研究方面,我们通过分泌蛋白芯片筛选出经s RAGE处理后成骨性细胞差异表达最明显的蛋白,并利用KEGG富集分析相关的信号通路;通过q RT-PCR、Western Blot和免疫荧光实验对差异表达蛋白以及信号通路进行验证;通过成骨细胞分化、MTS、克隆形成实验以及相应的功能回复实验进一步验证s RAGE通过调控成骨性细胞而促进NSCLC细胞在骨微环境中定植和增殖。研究结果1.我们首先通过表达谱芯片检测及文献调研筛选出RAGE是NSCLC骨转移相关基因。Western Blot和q RT-PCR实验发现RAGE在具有高骨转移倾向的NSCLC细胞株A549-L6中表达量远高于普通NSCLC细胞系A549;免疫组化实验表明RAGE在NSCLC骨转移灶中表达量明显高于原发灶;生存分析发现RAGE高表达的NSCLC患者无骨转移生存期、首次进展生存期和进展后生存期均明显短于低表达的患者。因此,RAGE与NSCLC骨转移具有相关性。2.MTS和Transwell实验发现敲减RAGE后NSCLC细胞增殖和侵袭能力略微减弱;成骨前体细胞招募和分化实验表明s RAGE可以增强对成骨前体细胞的招募,并且促进前体细胞向成骨细胞分化,从而改造骨微环境;粘附、克隆形成和MTS实验表明经s RAGE刺激后的成骨性细胞更有利于NSCLC细胞的粘附、定植和增殖;动物实验表明,经s RAGE预处理营造转移前微环境的小鼠更容易发生NSCLC骨转移。3.通过分泌蛋白芯片检测及生物信息学分析发现,经s RAGE处理后的成骨性细胞分泌蛋白含量升高最显着的是PDGF-C,且差异蛋白主要富集于TGF-β信号通路。q RT-PCR和Western Blot实验证实了经s RAGE处理后的成骨性细胞PDGF-C表达量显着增加;Western Blot和免疫荧光实验表明s RAGE激活了成骨性细胞的TGF-β/Smad信号通路;成骨细胞分化、MTS、克隆形成实验以及相应的功能回复实验进一步表明了s RAGE通过TGF-β信号通路促进成骨细胞分化并分泌PDGF-C继而促进NSCLC细胞在骨微环境中定植和增殖。研究结论综上所述,本研究首先通过表达谱芯片检测及细胞、组织和病人三个层面验证,筛选出RAGE是调控NSCLC骨转移的关键基因。高表达RAGE的NSCLC细胞通过分泌s RAGE改造转移前骨微环境,尤其是s RAGE能够在骨微环境中招募成骨前体细胞并促进前体细胞向成骨细胞分化,同时s RAGE通过激活TGF-β/Smad信号通路促进成骨性细胞分泌生长因子PDGF-C,继而有利于NSCLC细胞在成骨性微环境中定植和增殖,最终促进NSCLC发生骨转移。
史国红[2]（2021）在《低强度超声联合姜黄素抑制胶质瘤细胞增殖及其机制研究》文中指出目的:胶质瘤是最常见的成人中枢神经系统原发性恶性肿瘤,这类患者病残率和病死率均非常高,中位总生存期仅10-14个月。脑胶质瘤病人在手术切除后以及放疗后往往需化疗,因此化疗成为根除脑胶质瘤细胞的可靠方法。既往有研究表明低强度超声（LIUS）能够促进胶质瘤细胞对化疗药物的敏感性。本研究的目的在于探讨LIUS联合姜黄素治疗在人脑胶质瘤细胞中的抗肿瘤活动及其机制。研究方法:本研究以人脑胶质瘤细胞U87和U251为研究对象。超声强度分组:Control、50.4（U50.4）、83.4（U83.4）、142（U142）、290（U290）和474（U474）m W/cm2,辐照时间为60 s;姜黄素浓度分组如下:0（Control,DMSO）、10（C10）、20（C20）、40（C40）和60（C60）μmol/l,姜黄素的孵育时间分别为24 h,48 h和72 h;CCK-8实验结果显示超声强度142 m W/cm2在两个胶质瘤细胞中都是有效的并且对细胞的损伤最小,然后将超声强度142 m W/cm2与姜黄素不同浓度联合,分组如下:Control、U142+C10、U142+C20、U142+C40、U142+C60;基于统计分析结果以及IC50值,选取最佳的参数组合,即超声强度142 m W/cm2和姜黄素浓度20μmol/l,然后将分组设置为对照组（control）、低强度超声组（LIUS）、姜黄素组（curcumin）、低强度超声联合姜黄素组（curcumin+LIUS）。通过CCK-8和Ed U实验检测LIUS和/或姜黄素处理后对胶质瘤细胞增殖能力的影响;应用流式细胞学实验和western blot检测细胞的凋亡能力;通过吖啶橙（AO）染色、丹酰尸胺（MDC）染色以及western blot检测LIUS和/或姜黄素处理后胶质瘤细胞的自噬水平。加入自噬抑制剂3-MA和凋亡抑制剂Z-VAD-FMK后通过CCK-8实验和western blot实验检测细胞增殖能力、自噬及凋亡相关蛋白表达变化。此外,使用荧光显微镜和荧光酶标仪通过探针DCFH-DA检测LIUS和/或姜黄素处理后细胞内活性氧（ROS）的水平。最后,采用western blot实验检测LIUS和/或姜黄素处理对ROS/MAPK及AKT/m TOR通路蛋白表达的变化,然后加入活性氧清除剂NAC和AKT激活剂IGF-1预处理,观察其是否能够引起LIUS联合姜黄素介导的各通路相关蛋白表达水平变化以及胶质瘤细胞增殖能力的改变。结果:1、采用CCK-8实验检测不同超声强度和姜黄素不同浓度处理后胶质瘤U87和U251细胞增殖能力的变化。结果表明,当超声强度>83.4 m W/cm2时和对照组相比细胞活力存在显着性差异,并且随着超声强度的增加胶质瘤细胞活力下降,因此,超声强度142 m W/cm2被用于如下实验中;CCK-8实验结果显示姜黄素抑制胶质瘤细胞活力以一种剂量和时间依赖方式,并且在相同孵育时间下,当姜黄素浓度>10μmol/l和对照组之间胶质瘤细胞活力存在显着性差异。在相同的姜黄素浓度下（>10μmol/l）,U87和U251细胞中姜黄素孵育时间24 h和48 h之间细胞活力存在显着性差异,而孵育时间为48 h和72 h在姜黄素浓度为60μmol/l时存在显着性差异。因此,姜黄素孵育时间为48 h时对胶质瘤细胞增殖能力的影响最为理想;通过CCK-8和Ed U实验检测LIUS联合姜黄素对U87和U251细胞增殖能力的影响,其结果显示,胶质瘤细胞在使用LIUS和不用LIUS治疗IC50值存在显着性差异。并且超声强度142 m W/cm2和姜黄素浓度20μmol/l为最优参数组合。与单独姜黄素组相比,在U87和U251细胞中LIUS联合姜黄素治疗组受抑制的细胞活力分别是姜黄素组的2.26倍和2.53倍,即联合LIUS和姜黄素以一种协同方式抑制胶质瘤细胞的增殖能力。2、流式细胞学实验结果显示,与对照组、LIUS组以及姜黄素组相比,LIUS联合姜黄素治疗显着增加了凋亡的胶质瘤细胞数目;western blot结果显示,与对照组、LIUS组以及姜黄素组相比,LIUS联合姜黄素治疗能够显着增加促凋亡蛋白Bax和Cleaved caspase-3表达水平,而抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少,差异有统计学意义（P<0.05）。3、LIUS和/或姜黄素处理后对胶质瘤细胞自噬水平的检测,吖啶橙（AO）染色结果显示LIUS联合姜黄素显着增加了U87和U251细胞中橙红色酸性囊泡的数量,并且使用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）部分阻断了LIUS联合姜黄素所诱导的酸性囊泡细胞器数量的增加;使用丹酰尸胺（MDC）染色结果表明LIUS联合姜黄素处理后MDC染色自噬空泡（AVs）相对荧光强度增加和数量增加,使用3-MA削弱了LIUS联合姜黄素所诱导的AVs荧光强度和数量的增加;western blot结果显示,与对照组、LIUS组以及姜黄素组相比,LIUS联合姜黄素增加了U87和U251细胞中LC3B-II和Beclin-1的表达,而P62的表达水平是下调的。4、采用CCK-8实验和western blot实验检测自噬抑制剂3-MA和凋亡抑制剂Z-VAD-FMK对LIUS联合姜黄素介导的细胞抑制作用的影响。结果表明,双重使用3-MA和Z-VAD-FMK显着恢复了LIUS联合姜黄素引起的胶质瘤细胞活力的抑制（P<0.05）。Z-VAD-FMK预处理显着减少了LIUS联合姜黄素引起的Cleaved caspase-3表达增加,对比LIUS联合姜黄素处理,使用LIUS、姜黄素以及3-MA共培养处理后自噬相关蛋白LC3B-II表达减少（P<0.05）。5、DCFH-DA探针检测结果显示,和对照组、LIUS组以及姜黄素组相比,LIUS联合姜黄素能够显着促进细胞内ROS的累积。相反,使用ROS清除剂NAC显着削弱了这两个细胞系curcumin+LIUS所诱导的ROS产生;CCK-8实验结果显示,使用活性氧清除剂NAC预处理能够恢复LIUS联合姜黄素所诱导的细胞活力的抑制。6、对胶质瘤细胞进行ROS/MAPK以及AKT/m TOR通路的检测,western blot实验结果显示,与对照组、LIUS组以及姜黄素组相比,LIUS联合姜黄素显着性地提高了p-JNK、p-ERK以及p-p38的表达,总JNK、总ERK和总p38表达不变。然而使用NAC处理限制了LIUS-姜黄素所诱导的p-JNK、p-ERK、p-p38以及LC3B-II的表达增加;还有在U87和U251细胞中,对比对照组、LIUS组以及姜黄素组,LIUS联合姜黄素显着抑制了p-AKT和p-m TOR的表达,总AKT和总m TOR表达不变。相反,使用AKT的激活剂IGF-1预处理后逆转了LIUS-姜黄素所介导的p-AKT、p-m TOR的抑制,以及限制了LIUS-姜黄素所引起的LC3B-II表达增加;CCK-8实验结果显示,用NAC预处理以及用IGF-1预处理后,胶质瘤细胞活力均得到显着提高。结论:综上所述,LIUS联合姜黄素通过激活ROS/MAPK以及抑制AKT/m TOR通路来促进胶质瘤细胞自噬性细胞死亡。由于姜黄素很容易从姜科植物姜黄的根茎中获得,长期治疗效果温和,并且无创性的低强度超声可以局部定位到特定的部位,这种联和疗法可能成为一种很有前途的抗癌治疗策略。
朱志浩[3]（2020）在《间充质干细胞深低温保藏技术体系的建立与初步分析》文中研究表明脂肪干细胞是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞,具有来源广泛、储备量大等特点。在一定的诱导条件下,脂肪干细胞可以分化为成骨、软骨、脂肪等多种细胞。此外,脂肪干细胞还具有取材容易,适合大规模培养,对集体损伤小等优点,故逐渐成为近年来新的研究热点之一。脂肪干细胞是组织工程,尤其是骨或软骨组织损伤修复过程中重要的种子细胞,常使用深低温保存的方法来长期保持干细胞的生物学活性,以达到随需随取的目的。有研究表明,二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide,DMSO）、海藻糖（Trehalose）和左旋肉碱（L-Carnitine）都对细胞有较好的冻存保护效果。为了建立和优化脂肪干细胞的深低温保藏技术,本实验分别以二甲基亚砜、海藻糖和左旋肉碱作为冻存剂,并对复苏后的细胞进行了活性检测分析和细胞周期检测分析,并得到以下结果:1.细胞活性检测结果表明:对照组细胞在冻存后的复苏效果优于实验组,且不同冻存剂之间的冻存效果也存在一定差异。对照组（5%DMSO+10%FBS）表现出最好的冻存效果,在进行液氮冻存1、3和7天后,其细胞在复苏24小时后的活性分别为0.413、0.267和0.218,复苏48小时后的活性分别为0.532、0.366和0.256,均高于2号（5%DMSO）、3号（5%T+10%FBS）和5号（5%L+10%FBS）实验组细胞分别在冻存复苏后的活性。2.细胞周期检测结果表明:在进行冻存复苏之后,处于G1期的细胞所占比例最大,处于G2期的细胞所占比例最小。在对处于S期的细胞进行进一步分析后发现,在对细胞进行短期冻存后（1-3d）,2号实验组中处于S期细胞所占比例最大,分别为27.38%和26.34%,显着的高于对照组11.15%和17.24%。当冻存时间延长至7d后,对照组中处于S期的细胞所占比对最大,为3.35%,5号实验组与对照组效果相似,但略低于对照组,为3%。3.在培养液中加入诱导液后,会把间充质干细胞能够诱导成为成骨细胞,使用油红O染液染色,诱导成为成骨细胞能够被染成红色,红色越深或者越多,表示被诱导的细胞越多。诱导最多的是冻存剂为5%DMSO+10%FBS下冻存1天,其次是冻存剂为5%DMSO+10%FBS下冻存5天,诱导最少的是5%L+10%FBS冻存1天。4.转录组测序及生物信息学分析结果表明,在经过冻存处理之后,脂肪干细胞的基因表达谱发生变化,说明冻存处理确实会对细胞的基因表达产生影响。本实验通过检测不同冻存剂条件下细胞的复苏后的生物学特性,比较了不同冻存剂对细胞活性和细胞周期的影响,并通过转录组数据分析了5%DMSO+10%FBS冻存剂对脂肪干细胞表达谱的影响,为充分利用干细胞进行生物人工组织构建、细胞移植以及其他方面的研究奠定了一定的基础。
杨琬芳[4]（2020）在《DSF/Ara-C清除高表达ALDH的急性髓系白血病干细胞样细胞的研究》文中进行了进一步梳理目的急性髓系白血病（AML）是一种具有高度异质性的造血系统的恶性肿瘤。近二十年来,随着治疗方法的不断改进,绝大多数AML患者在标准化诱导化疗后达到完全缓解,然而部分患者随后复发并死于该病,因此研究影响AML患者化疗后复发及生存的相关因素,有助于判断高风险患者并给予相应的治疗措施,降低复发风险,改善预后和生存。白血病患者复发原因是体内存在一群白血病干细胞（LSCs）,类似于正常造血干细胞,处于相对静息状态,具有自我更新、无限增殖和多向分化潜能。目前AML的标准化诱导治疗对白血病细胞具有高度杀伤能力,但是LSCs对此化疗则不敏感。因此,如何识别并清除LSCs是彻底治疗AML的关键。许多研究发现醛脱氢酶（ALDH）活性可用作不同组织中癌症干细胞的标志物;ALDH能够氧化凋亡醛成非致凋性羧酸,使癌细胞免受这些醛的致凋亡作用而得以保护;高表达ALDH的AML患者对标准化治疗耐药,并且具有高ALDH活性的AML细胞高度富集LSCs。本研究首先对初发的AML患者（高表达ALDH和低表达ALDH）临床特性和预后进行比较分析,探索ALDH是否能作为白血病干细胞负荷的标志物,然后利用高表达ALDH细胞模型和NOD/SCID小鼠白血病模型研究DSF和Ara-C联合使用提高化疗药物敏感性,同时更有效降低小鼠体内的白血病细胞负荷,并探讨可能的分子机制,为进一步提高AML缓解率和生存率提供新思路。方法1、病例收集2015年1月至2017年12月间山西医科大学第二医院血液科住院的AML初发患者69例,收集了患者的实验室相关资料（包括基本资料、治疗缓解和复发情况、预后生存情况、ALDH表达、基因突变和染色体核型等）,其中男29例,女40例所有标本均为临床检测剩余样本;10例健康人的骨髓样本（门诊可疑病人检测后排除白血病者）。2、绘制ROC曲线确定界值并分析ALDH表达预后关系依据ALDH的表达水平绘制ROC曲线并确定界值,将患者分为ALDHhigh（ALDH表达高于界值）和ALDHlow（ALDH表达低于值）两组,分析ALDH表达水平和细胞遗传学的关系,ALDH表达水平和患者预后的关系。3、构建ALDH慢病毒表达载体采用RT-PCR法逆转录获取ALDH的cDNA,使用特异引物扩增ALDH基因编码序列（CDS）,双酶切（Not I和EcoR I）PCR产物和慢病毒表达载体pCDH-MCS-T2A-copGFP-MSCV后,回收酶切产物后连接,转化进入DH5α后扩增,然后提取质粒,对目的基因序列进行一代测序鉴定,选取无碱基错配,插入、缺失的克隆再扩增大量提取质粒。4、建立稳定表达ALDH和MSCV的UT7和THP1细胞模型慢病毒表达载体ALDH和MSCV和包装质粒按一定比例共转染293T细胞（脂质体法）48h后收病毒悬液并感染UT7和THP1细胞,72h后观察并检测感染效率,感染效率低于90%的进行流式细胞分选,获得稳定表达ALDH和MSCV的UT7和THP1细胞模型。5、CCK-8检测DSF或/和Ara-C对UT7和THP1系列细胞活力的影响本研究分析DSF和Ara-C单独和同时作用UT7系列（UT7、UT7-ALDH和UT7-MSCV）细胞和THP1系列（THP1、THP1-ALDH和THP1-MSCV）细胞,未处理组作对照,使用CCK-8试剂盒分别在0h、24h、48h、72h对各组细胞活力进行检测并分析。6、Annexin V检测DSF或/和Ara-C对UT7和THP1系列细胞凋亡的影响分析DSF和Ara-C单独和同时作用UT7系列细胞和THP1系列细胞,未处理组作对照,48h使用AnnexinV-PE,7-AAD检测各组细胞凋亡情况检测并进行分析。7、Westen blot检测DSF或/和Ara-C对UT7-ALDH和THP1-ALDH细胞的P65影响P65是NF-κB通路的核心成员,DSF和Ara-C单独和同时作用UT7-ALDH和THP1-ALDH细胞,未处理组作对照,48h后裂解细胞,提取总蛋白,使用Simple Westen blot检测各处理组P65的表达情况并进行分析,来反映对NF-κB通路的影响。8、通过γ-H2AX（pS139）检测DSF或/和Ara-C对UT7-ALDH和THP1-ALDH细胞内DNA的影响分析DSF和Ara-C单独或/和联合作用UT7-ALDH和THP1-ALDH细胞,48h后,使用γ-H2AX（pS139）的免疫荧光抗体对细胞内形成的γ-H2AX（pS139）进行检测,分析细胞中γ-H2AX（pS139）灶形成的情况。9、DSF或/和Ara-C对NOD/SCID白血病小鼠体内白血病负荷的研究对NOD/SCID小鼠进行亚致死计量（1Gy）的辐射清髓,然后植入THP1-ALDH细胞,成功构建白血病小鼠模型。使用DSF或/和Ara-C连续作用5天后,停药持续观察到14天,分析小鼠体内的白血病负荷。结果1、绘制ROC曲线确定界值并分析病人ALDH的表达及ALDH与细胞遗传学、预后关系依据ROC曲线得出表达ALDH的界值为1.85%,健康人骨髓CD34+细胞中ALDH处于较低水平（0.5±0.17%）;AML中ALDH表达悬殊（0-79%）,其中一部分AML患者（35/69）ALDH表达较高（≥1.85%）,称为ALDHhigh患者,其余患者（34/69）ALDH表达≤1.85%则为ALDHlow患者。在ALDH表达和细胞遗传学相关性分析中发现:细胞遗传学高风险组患者ALDH表达较高（15.36±4.46%）,细胞遗传学低风险组患者ALDH表达则较低（1.57±0.74%）。根据ALDH表达将患者分为:ALDHhigh患者和ALDHlow患者,ALDHhigh患者的总生存期（OS）显着低于ALDHlow患者（P<0.01）。由于细胞遗传学中度风险组患者ALDH表达差异较大（0.1-44.4%.）,按ALDH表达将其分成两组并分析OS,同样发现细胞遗传学中度风险组ALDHhigh患者的总生存期呈明显低于ALDHlow患者（P<0.01）。2、构建ALDH慢病毒表达载体将ALDH成功连接至慢病毒表达载体pCDH-MCS-T2A-copGFP-MSCV中,测序鉴定目的基因ALDH序列,无缺失、插入和错配碱基,经Blast比对显示序列准确,成功构建ALDH慢病毒表达载体。3、慢病毒转导UT7和THP1细胞,建立稳定表达目的基因的细胞模型慢病毒表达载体成功构建后,脂质体法共转染293T细胞,制备ALDH慢病毒悬液和MSCV载体对照慢病毒悬液,分别感染UT7和THP1细胞,培养细胞72h后,采用流式细胞术检测细胞感染的阳性率,各组细胞感染效率（GFP）均大于90%,结果显示成功构建了稳定表达目的基因的UT7和THP1细胞模型。4、DSF或/和Ara-C对UT7和THP1系列细胞活力的影响测定DSF和Ara-C对UT7和THP1两种细胞的IC50值。用相应浓度的Ara-C作用于UT7和THP1系列细胞,48h后THP1-ALDH和UT7-ALDH细胞活力抑制不明显,显示其对Ara-C耐药;DSF抑制THP1和UT7系列细胞的增殖能力;DSF联合Ara-c使用48h,THP1-ALDH、UT7-ALDH细胞活力被明显抑制,显示可能逆转了Ara-C耐药;而脐血干细胞的活力不受影响（P>0.05）。5、DSF或/和Ara-C对UT7和THP1系列细胞凋亡的影响Ara-c或/和DSF联合处理UT7和THP1系列48h,流式细胞仪分析凋亡细胞的百分比,显示单独用Ara-c或DSF处理可诱导UT7和THP1系列细胞凋亡（P<0.05）,而DSF和Ara-c共同处理可显着增强凋亡作用（P<0.01）,但是在CD34+CD38-的脐带血干细胞中未发现相应的凋亡（P>0.05）。6、DSF或/和Ara-C抑制UT7-ALDH和THP1-ALDH细胞p65表达并增加细胞内γ-H2AX单独用DSF和Ara-c处理THP1-ALDH和UT7-ALDH细胞48h可使NF-κB通路的核心成员p65蛋白的表达水平降低（P<0.05）;同时使得细胞内形成γ-H2AX灶;在DSF和Ara-c联合作用下,更加明显降低p65蛋白的表达水平（P<0.001）;同时显着增加了γ-H2AX灶的形成（P<0.001）;在脐带血干细胞中未发现类似结果（P>0.05）。7、DSF或/和Ara-C作用对NOD/SCID白血病小鼠体内白血病负荷的研究通过植入THP1-ALDH细胞成功构建NOD/SCID小鼠白血病模型,使用DSF或/和Ara-C连续作用5天后,停药持续观察到14天,处死小鼠,检测小鼠外周血、骨髓、脾脏的白血病负荷都不同程度的减少（P<0.05）;与单独用药相比,联合使用DSF和Ara-C降低小鼠体内的白血病负荷更明显（P<0.05）。结论1、健康人骨髓CD34+细胞中ALDH处于较低水平（0.5±0.17%）,AML中一部分患者（50.7%）ALDH表达较高（≥1.85%）;细胞遗传学高风险组患者ALDH表达较高（15.36±4.46%）,细胞遗传学低风险组患者ALDH的表达较低（1.57±0.74%）;ALDHhigh患者的总生存期（OS）显着低于ALDHlow患者;在细胞遗传学中等风险组中ALDHhigh患者的总生存期明显低于ALDHlow患者。2、在细胞水平证实了:高表达ALDH的UT7和THP1细胞对化疗药物Ara-C相对耐药;DSF单独使用能抑制白血病干细胞样细胞的活力、诱导凋亡;DSF和Ara-C联合使用,抑制效果更加明显。3、NOD/SCID小鼠模型实验证实:DSF联合Ara-C比单独使用DSF更加明显降低小鼠白血病干细胞样细胞负荷。
赵建[5]（2020）在《粒细胞集落刺激因子和低氧诱导因子对骨代谢及骨修复影响的相关性研究》文中指出粒细胞集落刺激因子是动员骨髓移植造血干细胞和祖细胞的重要药物。它还可用于治疗因化疗和骨髓移植等疾病引起的中性粒细胞减少症。人G-CSF的重组形式以其通用名称Filgrastim而为人所知。另外,G-CSF水平升高也与一些疾病有关,如在骨髓增生性疾病或细菌感染的患者中,血清G-CSF水平明显升高。然而,G-CSF水平升高对骨骼健康有不利的影响。先前的研究表明,长期给予G-CSF治疗可显着降低骨矿物质密度并诱发椎体的压缩性骨折。小鼠G-CSF的过度表达可导致小梁骨和皮质骨厚度减少。因此,有必要了解G-CSF影响骨细胞特性的机制。有趣的是,相关研究显示成骨细胞系或原代成骨细胞不表达G-CSF的受体（G-CSFR）。这表明G-CSF的骨质减少作用是由非成骨细胞类型介导的。另外,G-CSF受体在许多其他细胞类型上表达,包括造血细胞,内皮细胞,神经元和肌肉细胞。骨髓移植试验研究明确表明,G-CSF对成骨细胞的抑制作用是通过造血细胞介导的。在造血细胞中,在淋巴细胞缺陷小鼠中可观察到类似的作用,因而G-CSF对成骨细胞的抑制作用不是由淋巴细胞引起的。已有研究证实G-CSF抑制成骨细胞的作用是由中性粒细胞介导的,因为中性粒细胞的消耗会部分消除G-CSF对成骨细胞的抑制作用。G-CSF对成骨细胞抑制作用是通过抑制成骨细胞分化、促进成骨细胞凋亡或成熟成骨细胞转化为静止的骨细胞。G-CSF治疗还可增强小鼠和人类破骨细胞的形成和活性。另外,来自造血谱系髓样细胞的破骨细胞也表达G-CSF,因此破骨细胞是G-CSF作用的直接靶标。在体外条件下,破骨细胞的形成和活性随着G-CSF的增加而增加。尽管G-CSF对成骨细胞和破骨细胞的作用效果取得很大进展,但G-CSF如何影响骨细胞仍不清楚。本实验证实G-CSF长期治疗可降低小鼠骨组织中成骨细胞数量和新形成的骨细胞。成骨细胞分化的基因标记显着减少,骨细胞活性的基因标记亦减少。我们的研究还发现,成骨细胞数量减少是由于成骨细胞凋亡增加引起,而这是由中性粒细胞分泌的一氧化氮增加所介导的。骨折发生后的骨折不愈合或延期愈合是骨科中常见的并发症,这不但给病人的肉体上和精神上带来巨大痛苦,也给社会带来沉重的经济负担。骨折发生时或后期治疗过程中出现的血管损伤导致的血液供应不足是引起骨折不愈合或延期愈合的常见原因。目前越来越多的研究证实血管在骨折愈合过程中起至关重要的作用,骨折部位的血管损伤和血流障碍是一个引起骨不连或骨折延期愈合的重要原因。在动物骨折模型的研究中通常是通过剔除骨折部位附近的软组织（包括局部血管）或制造肢体的局部缺血来达到骨不愈合或延迟性骨愈合的效果。同样在临床上,骨不连或延迟性骨愈合骨痂组织中也能观察到由于缺少血管导致的血供缺乏区。因而,发现新的药物,通过其刺激血管生长改善血液供应来防止骨折后不愈合或延期愈合是骨科学和相关研究领域的重要命题。临床上骨质疏松性骨折,因骨量的丢失以及骨组织微环境的改变,骨折愈合往往会出现延迟。尤其是绝经后妇女的骨质疏松性骨折,因雌激素水平的下降、骨组织骨量的明显减少,对骨折愈合也会产生明显的影响。目前已有大量关于卵巢切除后骨质疏松的基础研究报道,并且对于骨质疏松性骨折的研究多集中在形态学和生物化学的改变,但对骨质疏松后骨折部位血运供应情况的研究并不多见。本实验模拟绝经后骨质疏松性骨折,建立了小鼠卵巢切除后的骨折模型,证实卵巢切除小鼠骨折早期愈合出现延迟,同时发现早期骨组织新生血管量出现明显减少。低氧诱导因子（hypoxia-inducible factor,HIF）是迄今发现的最重要的组织细胞氧浓度依赖的感应调节因子,在骨修复过程中HIF处于被激活的状态。HIF是一个异源二聚体,包括α、β二个亚基。正常生理状态下,HIF-1α蛋白分子中脯氨酸残基被脯氨酰羟化酶（PHDs）羟基化,羟基化HIF-1α可迅速被细胞浆内的蛋白酶降解。PHDs的活性既依赖于细胞内氧浓度,也需Fe2+、2-oxyglutarate等参与。在低氧条件下或Fe2+、2-oxyglutarate匮乏时,PHDs活性受到阻抑甚至失去活性,从而导致HIF-1α在细胞浆内累积。积聚的HIF-1αα亚基转移至细胞核内,在细胞核内HIF-1α与HIF-1β结合形成二聚体,进而激活HIF的下游直接靶基因,目前发现近百个受HIF-1调控的基因,涉及细胞生物学行为的多个方面,这些基因产物（如红细胞生成素—EPO、糖代谢转运因子—Glut、和血管内皮生长因子—VEGF等）的表达,在血管重塑、葡萄糖和能量代谢、红细胞生成、细胞增殖、凋亡等方面发挥重要作用。认为,包括加强呼吸等全身性或细胞性的多种低氧反应,均处于HIFs调节之下;HIFs是诱导低氧基因和修复细胞氧内环境稳定的核心因子。在意识到血供在骨折愈合中起到的重要作用后,许多研究都集中到想通过干预血管重塑来改善血液供应。当前越来越多的研究对使用血管内皮生长因子促进血管生成发生了浓厚的兴趣。最近研究证实了在兔子临界缺损骨折中局部运用VEGF提高了骨折的愈合。但是,因价格问题和需要蛋白重组甚至基因疗法的参与,给在临床上直接应用VEGF带来困难。抑制PHDs的小分子药物可以用来阻断HIF-1α亚基的降解,进而激活了 HIF的通路。普遍意义上这些小分子应该具有干扰PHDs所需要的铁螯合剂或2-oxyglutarate的类似物的能力。DF0（去铁胺）是一种Fe2+络合剂,临床上常用于金属离子中毒的治疗。在HIF-1α代谢过程中,DFO可通过与细胞内Fe2+的络合作用而抑制PHDs和FIH的活性,从而造成细胞内HIF-1α累积。前期实验研究在考查了多种可抑制PHDs活性进而调节HIF-1α形成的化合物的基础上,发现:在体外常氧培养环境内,当应用含DFO（I0μM或50μM或200μM）条件培养液进行干预时,可明显促进骨髓基质干细胞（MSCs）形成HIF-1α及表达VEGF mRNA;刺激人脐静脉内皮细胞（HUVEC）形成血管样小管状结构;提高胚胎跖骨内皮“枝芽“的形成数量。在体内,当将DFO（200μM）直接注射至实验性骨折模型局部时,X-线和μCT图像显示,DFO可显着提升骨痂组织内血管与新骨的形成,骨修复加速。本实验在卵巢切除小鼠骨折模型中,局部应用DFO,促进了新生血管的长入以及骨痂的生成,最终促进骨折的愈合。第一部分G-CSF通过上调中性粒细胞一氧化氮的产生抑制小鼠成骨细胞和骨细胞生长的研究目的粒细胞集落刺激因子（G-CSF）水平增高对骨骼健康有不良影响,先前有研究广泛证实了 G-CSF对成骨细胞和破骨细胞的影响,但其具体的作用机制以及如何影响骨细胞仍不太清楚,本文旨在进一步研究G-CSF对成骨细胞和骨细胞的影响及作用机制。方法1.8-10周龄雌性C57BL/6小鼠,分为对照组、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）组、G-CSF+Nω-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）组,每组各10只小鼠。各组小鼠分别皮下注射溶剂、G-CSF和G-CSF+L-NAME。治疗后10天后处死动物。2.收集各组小鼠的外周血液在肝素化血液采集管中以进行全血细胞计数检测。3.收集各组小鼠的股骨进行组织切片以及免疫组化检测4.冲洗出各组小鼠股骨骨髓,并且在通过Trizol方法获得RNA,进行实时定量PCR检测。结果1.G-CSF治疗显着降低成骨细胞和新生骨细胞的数量。2.G-CSF引起的成骨细胞谱系细胞数量减少是由于细胞凋亡增加所导致的。3.G-CSF诱导的成骨细胞凋亡,是由嗜中性粒细胞的一氧化氮分泌增加所引发。结论G-CSF对于成骨细胞和骨细胞的抑制作用是由于促进中性粒细胞分泌一氧化氮所引发。第二部分小鼠骨质疏松性骨折模型早期骨折愈合延迟的初步实验研究目的探讨骨质疏松小鼠骨折愈合延迟的机理。方法60只C57BL/6小鼠随机分为OVX组（N=30）、SHAM组（N=30）。小鼠双侧卵巢切除后4周建立右侧股骨骨折模型。骨折术后第2周行X线、Micro-CT、组织学切片、免疫组化和血管灌注检测。结果Micro-CT以及组织学证实OVX组小鼠骨折愈合延迟;免疫组化表明OVX组新生骨痂组织中VEGF的表达降低;血管灌注表明2周OVX组新生血管量较CON组明显减少。结论0VX组小鼠骨痂组织中VEGF表达的减少可能是导致骨痂中新生血管减少的重要原因,进而由于新生血管的减少可能导致OVX组小鼠骨折早期愈合延迟。第三部分局部应用去铁胺激活低氧诱导因子通路促进卵巢切除小鼠骨折愈合目的在卵巢切除小鼠骨折模型中,局部注射去铁胺（DFO）,评估是否能够促进卵巢切除小鼠的骨折愈合。方法首先,将40只7周龄雌性C57BL/6小鼠随机分为卵巢切除（OVX）组（n=20）和假手术（SHAM）组（n=20）。卵巢切除后4周取材,收集小鼠的子宫称重,一侧股骨行micro-CT分析。然后将90只7周龄雌性C57BL/6小鼠分为三组:OVX+Saline,OVX+DFO,和 SHAM+Saline 组（n=30）。小鼠双侧卵巢切除后 4 周建立右侧股骨骨折模型。手术后第二天用500μl胰岛素专用注射针筒在股骨骨折处注射药物DF0200μM或生理盐水20μ1,每隔一天注射一次,一共5次。在骨折愈合过程的第2、4和8周取材,分别进行X线、Micro-CT、组织学、免疫组织化学、血管灌注检测和生物力学分析。结果实验第一部分证实,卵巢切除4周后,小鼠子宫明显萎缩,骨量出现明显丢失,骨质疏松模型建模成功。在第二部分中,由于卵巢切除小鼠雌激素水平下降以及骨量的丢失,骨折愈合过程出现明显变化。骨折术后2周,OVX+Saline组小鼠骨痂体积以及新生血管的数量较SHAM+Saline出现明显下降,骨痂组织中HIF-1α 和VEGF的表达也出现明显下降;骨折后4周,OVX+Saline组小鼠骨痂的总体积以及骨体积较SHAM+Saline都有明显减少;骨折后8周,OVX+Saline组小鼠的生物力学性能较SHAM+Saline组也出现明显下降。骨折端局部注射DFO以后,骨折愈合出现明显改善。骨折后两周,OVX+DFO组小鼠骨痂体积和新生血管数量较OVX+Saline组有明显上升,骨痂组织中HIF-1α 和VEGF的表达也有一定的提高;骨折后4周,OVX+DFO组小鼠骨痂总体积以及骨体积较OVX+Saline组也有明显增加;骨折后8周OVX+DFO组小鼠的生物力学性能较OVX+Saline组也出现明显上升。结论局部应用DFO可以促进卵巢切除小鼠的骨折愈合。
黄天璐[6]（2020）在《细胞周期蛋白依赖激酶7抑制剂的抗胆管癌作用机制和联合用药研究》文中提出背景和目的胆管癌是一种预后极差的肿瘤,主要原因是现有的临床治疗方案疗效有限。目前胆管癌常用的治疗方案是根治性手术切除、肝移植和化疗,由于缺乏早期临床症状,许多患者在确诊时已经处于进展期,而胆管癌对化疗并不敏感,导致这些失去根治性手术或肝移植机会的病人的中位生存期不足48个月。因此,亟需寻找有效的新的抗胆管癌靶点及药物并制定有效的治疗方案。2016年的一项研究,通过对现有胆管癌的基因表达综合数据库进行整合分析,发现胆管癌与正常组织相比存在48个差异表达的转录因子,并且细胞周期相关基因在胆管癌中富集程度最高。因此,为了寻找新的抗胆管癌的有效靶点,我们在三株胆管癌细胞中,对一个靶向细胞周期基因的小分子抑制剂库进行了抗肿瘤活性药物筛选,结果发现胆管癌细胞对细胞周期蛋白依赖激酶7（CDK7）抑制剂普遍敏感。CDK7是CDK家族的成员之一,控制转录起始和延伸,并参与细胞周期的调控。近年来有研究显示,CDK7参与介导调控了一些重要的基因簇的转录,这些基因簇常与超级增强子相关。此外,CDK7在肿瘤组织中的表达常常升高,因此CDK7在肿瘤中可能是一个重要的潜在治疗靶点。本研究的目的是评估CDK7在胆管癌细胞中的作用,探究CDK7抑制剂的抗胆管癌作用机制,并探究与其他抑制剂的协同抗胆管癌方案,为临床治疗胆管癌提供新的思路与策略。方法利用TCGA数据及GEO中的数据分析CDK7的m RNA在胆管癌中的表达,并利用组织芯片进行免疫组化,验证CDK7在胆管癌组织中的蛋白表达水平及CDK7与MCL1表达的相关性。使用药物处理或小干扰RNA（si RNA）沉默目的基因的表达后,使用CCK-8检测细胞活性,使用Compu Syn软件计算药物之间的联合指数（CI）。利用流式细胞术检测细胞凋亡、Caspase3/7试剂盒检测细胞内caspase3/7活性、Brd U ELISA增殖试剂盒检测细胞增殖。通过Real-time q PCR检测目的基因的m RNA水平、Western blot检测目的基因的蛋白表达。通过构建裸鼠皮下移植瘤并进行体内给药实验,探究CDK7抑制剂THZ1对胆管癌移植瘤生长的影响,并观察对裸鼠是否存在明显的毒副反应。THZ1处理胆管癌细胞后,进行RNA测序,对测序结果进行分析,寻找下游靶点,探究分子机制。结果对TCGA数据及GEO中的数据集的分析结果以及免疫组化结果显示,CDK7在胆管癌组织中的表达明显高于癌旁组织及正常组织。使用小分子抑制剂抑制CDK7活性或使用si RNA沉默CDK7表达可以抑制胆管癌细胞的活性,抑制胆管癌细胞增殖并促进凋亡发生。THZ1可以抑制胆管癌皮下移植瘤的生长,且对裸鼠体重及活力没有明显的抑制作用。THZ1可以下调CDK7介导的RNP2的磷酸化,抑制转录进程。对RNA测序结果进行GO分析显示,THZ1对DNA转录相关的基因影响较大。在被THZ1显着下调的基因中包含许多致癌转录因子和存活蛋白如FOSL1、RUNX1和MCL1。MCL1是胆管癌重要的抗凋亡蛋白,免疫组化显示CDK7的表达与MCL1具有明显相关性。利用si RNA干扰MCL1的表达或使用MCL1抑制剂可增强BCL2/BCL-XL抑制剂ABT-263的抗胆管癌作用,联合使用CDK7抑制剂或si RNA与ABT-263可发挥协同抗胆管癌作用,显着增加细胞凋亡。结论CDK7抑制剂THZ1可以抑制胆管癌细胞存活,促进胆管癌细胞凋亡,并显着抑制基因转录。同时,THZ1可通过抑制抗凋亡蛋白MCL1的表达,与ABT-263发挥协同抗胆管癌作用。因此,CDK7可能是治疗胆管癌的有效靶点,同时抑制CDK7与BCL2/BCL-XL可能成为胆管癌治疗新策略。
李梓菲[7]（2020）在《人脂肪间充质干细胞深低温保存的研究》文中进行了进一步梳理研究背景人脂肪间充质干细胞（hADSCs）的深低温保存对于开展hADSCs细胞库的建立及临床应用至关重要。然而目前仍缺乏针对hADSCs深低温保存的研究。研究目的明确深低温保存前hADSCs分离纯化方法对其生物学特性的影响;明确hADSCs的低温生物学参数;明确hADSCs冷冻流程主要环节对其生物学特性的影响:探索纳米氧化石墨烯对hADSCs深低温保存效果的影响。研究方法第一部分:深低温保存前hADSCs分离纯化方法的研究（一）消化液体积与容器容积之比对酶学法获取基质血管成分（SVF）/hADSCs产量及生物学特性的影响人皮下脂肪抽吸物与酶消化液按0.2、0.4、0.6及0.8消化液体积与容器容积之比进行SVF提取并分析细胞产量及活细胞率、免疫表型、增殖能力及成脂、成骨及成软骨分化能力。（二）氯化铵（NH4C1）裂解法分离纯化hADSCs对其生物学特性的影响人皮下脂肪组织抽吸物提取的SVF,应用NH4C1红细胞裂解液进行处理,非裂解法作为对照。分析SVF细胞产量及活细胞率;分析hADSCs活细胞率、细胞凋亡水平、免疫表型、增殖能力、成脂及成骨分化能力。（三）深低温保存NH4C1裂解法分离纯化hADSCs的生物学特性用如上所述裂解法处理SVF并培养hADSCs,液氮深低温保存2周后复苏,非裂解法为对照。比较深低温保存前后的hADSCs的活细胞率、细胞凋亡水平、免疫表型、细胞增殖能力。第二部分:hADSCs低温生物学参数探索:跨膜水传输与胞内冰形成的研究利用低温显微镜平台采集hADSCs不同降温速率下的细胞图像。通过数学模型拟合水传输参数:细胞膜对水的渗透系数（Lpg）和水传输的活化能（ELp）;以及胞内冰形成参数:动力学参数（ΩOSCN）和热力学参数（kOSCN）,并推算无低温保护剂条件下最佳降温速率。第三部分:hADSCs冷冻流程的研究（一）降温速率对hADSCs生物学特性的影响hADSCs 按 0.5℃/min、1℃/min、1C℃/min、25℃/min、50℃/min、80℃/min和100℃/min的降温速率冷冻并液氮深低温保存3个月,细胞复苏后分析其活细胞率、细胞凋亡水平、免疫表型、细胞增殖能力、成脂、成骨及成软骨分化能力及活性氧（ROS）水平。（二）细胞浓度对深低温保存hADSCs的生物学特性的影响hADSCs 按 0.5 × 106/mL、1×106/mL>2×106/mL、5×106/mL 和 10×106/mL细胞浓度于液氮深低温保存2周。复苏后分析其活细胞率、免疫表型、细胞增殖能力、成脂、成骨及成软骨分化能力。第四部分:纳米氧化石墨烯（GO）在hADSCs深低温保存中的保护作用的研究体外实验部分:对照组（CPA-C）使用常规90%胎牛血清（FBS）+10%DMSO作为低温保护剂,GO组（CPA-GO）在常规低温保护剂基础上增加5 μg/mL GO。hADSCs加入以上两组低温保护剂后深低温保存2周。分析深低温保存前后hADSCs的活细胞率、免疫表型、细胞增殖能力、成脂、成骨及成软骨分化能力、细胞凋亡水平,评估GO对hADSCs的毒性及GO残留情况。体内实验部分:深低温保存后hADSCs行活细胞率、免疫表型、细胞增殖能力、成脂、成骨及成软骨分化能力等生物学特性检测。采用GO组（CPA-GO）、常规低温保护剂对照组（CPA-C）及单纯PBS空白对照组进行hADSCs辅助脂肪移植;各组hADSCs与脂肪组织混合物移植于裸鼠颈部,3个月后取材。评估移植物重量,脂肪细胞成活情况及来源,移植物内血管数量及来源;组织内成脂及凋亡相关基因的表达水平;评估移植物内巨噬细胞浸润情况及炎症因子表达水平。研究结果第一部分:深低温保存前hADSCs分离纯化方法的研究（一）消化液体积与容器容积之比对酶学法获取SVF/hADSCs产量及生物学特性的影响0.4组细胞产量最高,为2.65±0.98X 105个细胞;0.2组活细胞率最高,为76.20±4.91%,0.4组活细胞率次之,为72.96±4.64%。各消化液体积与容器容积之比组hADSCs其余生物学特性无显着差异。（二）氯化铵（NH4Cl）裂解法分离纯化hADSCs对其生物学特性的影响裂解组SVF活细胞数、活细胞率显着低于非裂解组;NH4Cl裂解诱导hADSCs凋亡并降低hADSCs增殖能力;余生物学特性组间无统计学差异。（三）深低温保存NH4Cl裂解法分离纯化hADSCs的生物学特性深低温保存与裂解具有协同促hASCs凋亡的作用;深低温保存前后裂解组细胞增殖能力较非裂解组差。第二部分:hADSCs低温生物学参数探索:跨膜水传输与胞内冰形成的研究联合拟合得到相应的水传输参数为:Lpg=3.79 X 10-14 m/s/Pa（0.23 μm/min/atm）,ELp=154.94 kJ/mol（37.01 kcal/mol）。根据 Generic Optimal Cooling Rate Equation（GOCRE）最佳降温速度推测公式推测的最佳降温速度为4.30℃/min。平均动力学参数ΩOSCN为7.79 X 108 m-2 s-1平均热力学参数kOSCN 为 2.93×109K5。第三部分:hADSCs冷冻流程的研究（一）降温速率对hADSCs生物学特性的影响随着降温速率从50℃/min降低到0.5℃/min,深低温保存后活细胞率有逐渐增高的趋势,0.5℃/min组活细胞率为93.17±2.29%;细胞ROS水平随降温速率的变化趋势近似倒U型,峰值对应的降温速率为25℃/min;80℃/min组保持较强的成软骨能力。（二）细胞浓度对深低温保存hADSCs的生物学特性的影响活细胞率随细胞浓度的增加而增加,至5×106/mL组活细胞率为91.28±2.57%,10×106/mL组活细胞率为93.87±1.80%。各细胞浓度组间生物学特性无显着差异。第四部分:纳米GO在hADSCs深低温保存中的保护作用的研究体外实验部分:0.01-100 μ g/mL GO与hADSCs共培养未见细胞毒性,透射电镜未见明显胞内GO残留。低温保护剂内添加5 μg/mL GO有助于提高活细胞率及复苏率,减少细胞凋亡水平。体内实验部分:与对照组相比,CPA-GO组脂肪移植物内成活脂肪细胞数及血管数更多;CPA-GO组移植物内鼠源VEGF水平有增高的趋势,炎症因子MCP-1有降低的趋势。研究结论第一部分:深低温保存前hADSCs分离纯化方法的研究0.4可能是酶学消化法分离hADSCs的最佳消化液体积与容器容积之比;hADSCs提取过程中应避免NH4Cl红细胞裂解处理。第二部分:hADSCs低温生物学参数探索:跨膜水传输与胞内冰形成的研究hADSCs细胞膜对水的通透性较低,且在相对较高的温度范围内易出现胞内冰,降温速率应足够慢以减少胞内冰的形成。第三部分:hADSCs冷冻流程的研究以0.5℃/min降温速率冷冻hADSCs可以保持较高的活细胞率及较佳的生物学特性;5×106/mL至10×106/mL可作为大批量深低温保存hADSCs的适宜细胞浓度。第四部分:纳米GO在hADSCs深低温保存中的保护作用的研究纳米GO在hADSCs的深低温保存中发挥保护作用。
王秋果[8]（2019）在《原人参三醇抑制SCD1介导的脂质代谢在多发性骨髓瘤中的作用及机制研究》文中指出第一部分SCD1及脂滴在多发性骨髓瘤中的表达及意义目的:既往研究发现在多种肿瘤中通过抑制硬脂酰辅酶A去饱和酶1（SCD1）表达破坏脂质稳态可以杀伤肿瘤细胞,但目前SCD1在多发性骨髓瘤（MM）发生发展中的作用尚不清楚。本部分研究旨在了解脂肪酸组成调节关键酶SCD1在MM中的表达,及其在MM脂质代谢和细胞存活中的作用。方法:收集自2016年10月至2018年5月在华中科技大学同济医学院附属协和医院的16例多发性骨髓瘤患者骨髓标本和5例健康人外周血,密度梯度离心法分离单个核细胞,实时PCR检测脂质合成基因SCD1表达水平,统计分析SCD1表达与MM临床特征的相关性;生物信息学分析比较126名初治骨髓瘤患者的CD138+MM细胞和18名骨髓瘤患者骨髓CD138-CD19+B细胞的SCD1表达;选取两个骨髓瘤细胞系RPMI8226和ARH77,免疫印迹法检测SCD1蛋白水平,BODIPY 493/503荧光染色检测细胞内脂滴（lipid droplets,LDs）的含量。si RNA-SCD1转染MM细胞敲降SCD1表达,检测SCD1对脂滴含量及MM细胞活性的影响,并分别补充外源性油酸（OA）或棕榈酸（PA）,观察脂滴含量及MM细胞活性的变化。结果:在MM患者样本中,SCD1的表达明显高于健康供者,而其表达与患者、年龄或性别无相关性。生物信息学分析显示,初治骨髓瘤患者的CD138+MM细胞的SCD1表达高于患者骨髓中的CD19+B细胞。与正常B细胞相比,MM细胞系RPMI8226和ARH77中SCD1的表达显着升高,且MM细胞中的LDs含量高于正常B细胞。与对照组相比,si RNA-SCD1组细胞凋亡增加,并伴随LDs含量的明显降低。我们发现补充外源性油酸后OA+si RNA-SCD1组凋亡细胞比例较si RNA-SCD1组降低,而且细胞内LDs含量增加。结论:本部分研究表明,多发性骨髓瘤细胞中存在SCD1的高表达和脂质存储水平的增加,且SCD1的表达与MM临床分期相关,SCD1的表达影响MM细胞内脂滴含量和MM细胞存活能力,提示SCD1可能是干扰脂质代谢促进MM细胞凋亡的重要靶点。第二部分原人参三醇通过下调SCD1表达诱导内质网应激促进多发性骨髓瘤细胞凋亡目的:原人参三醇（PPT）是一种人参提取物,具有调节代谢紊乱和抑制脂质合成作用,在多种肿瘤中发挥抗肿瘤作用,而对MM细胞增殖、凋亡的作用尚不清楚。本部分研究探讨了原人参三醇对MM细胞生物学功能的影响和作用机制,及其在MM中对SCD1介导的脂质代谢的调控作用。方法:选取RPMI8226和ARH77两种多发性骨髓瘤细胞株,不同浓度原人参三醇作用于细胞,CCK8检测细胞活力和增殖,计算药物IC50,流式细胞术检测细胞凋亡、细胞周期,western blotting检测凋亡蛋白、细胞周期相关蛋白表达。设置PPT干预组和DMSO组,q RT-PCR检测SCD1表达量,检测内质网应激相关基因XBP-1、GRP78、ATF4m RNA表达;western blotting检测SCD1和内质网应激凋亡通路相关蛋白p-PERK,PERK,CHOP的表达;补充油酸或棕榈酸,流式检测细胞凋亡,q RT-PCR和蛋白印迹检测上述蛋白的表达。免疫荧光检测PPT组和对照组细胞内LDs水平,并检测补充外源性油酸或棕榈酸后各组细胞细胞内LDs水平改变。结果:在RPMI8226和ARH77细胞系中PPT剂量依赖性抑制细胞活力和增殖。流式细胞术分析结果显示随着浓度的增加,PPT的促凋亡作用增强,细胞周期检测发现PPT诱导MM细胞周期在G0/G1期停滞。q RT-PCR和western blotting实验结果表明PPT显着下调MM细胞中SCD1的表达,补充棕榈酸的PA+PPT处理组细胞中SCD1的表达显着增加,而OA+PPT组细胞SCD1表达无显着改变。PPT降低了MM细胞中LDs水平,而油酸或棕榈酸的补充使细胞中LDs水平升高。细胞活力和细胞凋亡检测显示油酸的补充不仅补救了PPT处理的MM细胞的活力,而且部分逆转了PPT诱导的MM细胞凋亡。PPT诱导ER应激相关蛋白P-PERK和CHOP高表达,补充油酸逆转了PPT诱导的内质网应激。PPT和ER应激抑制剂TUDCA联合处理组细胞凋亡比例较PPT单独处理组减少,进一步证实PPT可诱导MM细胞ER应激相关细胞凋亡。结论:本实验研究结果表明原人参三醇具有抑制多发性骨髓瘤细胞增殖,诱导细胞凋亡的作用。SCD1是饱和脂肪酸转化为不饱和脂肪酸的关键调节因子,PPT抑制SCD1的表达,下调细胞内LDs含量,干扰细胞脂质稳态,并进一步诱导MM细胞脂毒性相关内质网应激致细胞凋亡。第三部分体内实验验证原人参三醇抗多发性骨髓瘤的作用及机制目的:体外实验已证明原人参三醇通过干扰SCD1介导的脂肪酸合成抑制多发性骨髓瘤细胞增殖及活性的作用,体内实验进一步验证原人参三醇对多发性骨髓瘤的杀伤作用及机制。方法:在NOD/SCID小鼠中皮下注射RPMI8226细胞构建MM小鼠模型,设置PPT治疗组及PBS对照组,观察小鼠的生存状况,瘤体大小及体重变化;取小鼠瘤体,组织石蜡包埋切片标本,免疫组化染色检测Ki67（一种增殖能力的标志物）、凋亡蛋白裂解caspase3、SCD1的表达,免疫荧光检测SCD1、CHOP的表达。结果:与PBS注射对照组相比,PPT治疗组小鼠肿瘤生长显示出中度受抑制,且小鼠的体重明显低于对照组。取小鼠瘤体测量并计算肿瘤体积结果显示PPT治疗组的肿瘤体积明显较小。免疫荧光检测瘤体中SCD1、CHOP水平,我们观察到SCD1和ER应激之间存在显着的反向关系。用IHC染色来检测小鼠肿瘤组织中SCD1的表达结果显示与对照组相比,PPT处理的小鼠肿瘤样本SCD1的表达降低。此外,PPT治疗的肿瘤组织中Ki-67的表达水平降低,且凋亡蛋白裂解caspase3的表达水平升高。结论:小鼠体内实验验证PPT抑制MM瘤体生长,抑制脂质去饱和酶SCD1表达,诱导ER应激促进凋亡。
王宇强[9]（2019）在《透明质酸水凝胶缓释雪旺细胞外泌体修复坐骨神经长节段缺损的实验研究》文中研究说明目的:（1）体外分离新生SD大鼠雪旺细胞并培养,超速离心法提取雪旺细胞分泌的外泌体并进行特异性蛋白鉴定。透射电镜观察雪旺细胞外泌体的粒径和分布。（2）研究雪旺细胞外泌体对神经元及雪旺细胞的生物学作用。观察和研究透明质酸凝胶缓释外泌体的生物学特征参数。（3）探讨透明质酸水凝胶包裹缓释雪旺细胞外泌体填充PCL神经导管修复大鼠坐骨神经长节段缺损的形态学和功能学效果。方法:（1）采用0.1%Ⅳ型胶原酶消化法提取原代大鼠雪旺细胞,并采用DMEM/F12完全培养基培养和纯化。采用S100和Sox10进行纯度鉴定。采用CCK-8试剂盒对雪旺细胞的增殖状态进行检测。采用超高速离心法提取雪旺细胞分泌的外泌体,利用BCA试剂盒检测外泌体中蛋白的含量。Western blot法对雪旺细胞分泌外泌体表面标志物CD63、TSG101、CD9、Rab5和Na+/K+ATP酶进行鉴定。（2）构建1%浓度的透明质酸水凝胶,并将雪旺细胞外泌体进行包裹。体外放置于PBS中采用BCA试剂盒检测外泌体的缓释曲线。应用雪旺细胞外泌体干预雪旺细胞和神经元,CCK-8试剂盒检测外泌体对雪旺细胞的增殖作用,以及对两种细胞生物活性蛋白分泌的作用。ELISA法检测培养第1、3、5天后,外泌体干预的雪旺细胞表达神经生长因子（NGF）、脑源性神经生长因子（BDNF）、髓鞘零蛋白（P0）、细胞极性蛋白Par-3的水平。同时ELISA法检测外泌体干预后第1、3、5天时神经元中生长相关蛋白43（Growth-associatedprotein-43,GAP-43）、神经丝蛋白-200（Neurofilament-200,NF-200）、βIII–Tubulin的表达水平。（3）静电纺丝制备PCL神经导管,并采用扫描电镜观察导管的大体形态及显微结构,测量纤维丝的直径。采用小量程的力学仪器检测PCL神经导管的的杨氏模量、最大应力、最大载荷、最大断裂张力等力学参数。采用透明质酸水凝胶包裹雪旺细胞外泌体填充PCL神经导管,制备15mm长节段大鼠坐骨神经缺损,并进行端端吻合。采用单纯透明质酸填充PCL导管作为对照组,自体神经移植组也进行对照。在术后4、8、12周时检测大鼠坐骨神经指数、再生神经电生理功能。荧光金逆行示踪检测大鼠神经元胞体的存活情况及神经再生的情况。透射电镜观察三组再生神经的有髓轴突的直径、有髓轴突的数量、再生轴突的面积。NF-200和S100对各组再生神经的免疫荧光染色,观察期神经结构再生情况。HE染色观察三组大鼠腓肠肌肌纤维直径的差异。结果:（1）雪旺细胞在光镜下可以看到呈梭型,体积不大,存在双极,细胞核在中间,比较明显,有折光性。细胞多呈纵行排列的形态。雪旺细胞在接种2小时后,贴壁的比率约为23.5%,6小时时的贴壁比率增加到47.9%,而在12小时的时候有88.9%的细胞贴壁,在16小时以后细胞贴壁的比率均高于99%。在培养3天时,雪旺细胞数量较最初增长了3.9倍,而培养7天时增长了11.4倍。S-100和Sox-10双标荧光染色对雪旺细胞鉴定的纯度为97%。外泌体粒径主要分布在100-160 nm之间,本研究测得的外泌体的平均直径在125 nm。Western blot检测显示外泌体特异性蛋白CD63、TSG101、CD9在本研究所提取的雪旺细胞外泌体中均有表达,而非外泌体表达蛋白Rab5和Na+/K+ATP酶则未见表达。（2）外泌体在透明质酸凝胶中前3天释放比率较大,第一天释放比率为34%,第三天达到41%,随着时间的延长,释放逐渐缓慢。在第4、5、6、8、16、32天时的累积释放比率为43%、47%、51%、53%、75%、90%,而在第64天时候检测得出累积释放率为99%,几乎完全释放。对照组轴突数量为35.4±4.3,而外泌体刺激组为126.3±14.4（P<0.05）。在轴突生长长度方面,外泌体组的平均长度长达（1563.0±132.5）μm,显着高于对照组的（864.3±77.4）μm（P<0.05）。外泌体干预组雪旺细胞在培养后的第3、5、7天时细胞增殖水平均显着高于对照组（P<0.05）。外泌体刺激后的雪旺细胞分泌NGF、BDNF、髓鞘零蛋白（P0）、细胞极性蛋白Par-3的水平在培养后第3天和第5天较第1天时均显着升高,而第5天的表达量也均显着高于第3天的水平（P<0.05）。外泌体刺激后的DRG神经元细胞分泌的标志性蛋白进行检测,结果发现GAP-43、NF-200、βIII–Tubulin的水平在培养后第3天和第5天较第1天时均显着升高,而第5天的表达量也均显着高于第3天的水平（P<0.05）。（3）PCL神经导管的内孔直径为1500μm左右,而管壁的厚度约为500μm,表面纤维丝均匀分布,纤维丝平均直径为4.9μm。PCL神经导管孔隙率为（89.7±2.6）%、最大应力为（7.5±0.6）MPa、杨氏模量为（22.4±2.1）MPa、最大断裂张力为（596.4±33.8）%、最大载荷为（5.6±0.8）N,符合神经再生要求。术后第4、8、12周时PCL/HA-EXO组大鼠的再生神经有髓轴突的直径、有髓轴突的数量、再生轴突的面积显着高于PCL/HA组,而G-ratio值则显着低于PCL/HA组（P<0.05）。而三个时间点中,PCL/HA-EXO的有髓轴突的数量、再生轴突的面积和G-ratio值均与自体神经移植组差异无统计学意义（P>0.05）。术后12周时可见PCL/HA-EXO组大鼠轴突沿着导管顺行生长,有明显的方向性。并且神经轴突及雪旺细胞的表达显着高于PCL/HA组,与自体神经移植组差异不明显。各组大鼠术后随着时间的延长,复合肌动作电位幅度、神经传导速度及潜伏期均有所改善,但PCL/HA-EXO组和自体神经组较PCL/HA组改善更为明显,术后4、8、12周三个时间点均显着高于PCL/HA组（P<0.05）。在术后第8周时,PCL/HA-EXO组和自体神经移植组的神经传导速度及潜伏期均无显着性差异,而复合肌动作电位仍存在一些差异（P<0.05）。而术后12周时,三个指标则在PCL/HA-EXO组和自体神经移植组中无统计学差异（P>0.05）。PCL/HA-EXO组和自体神经移植组的SFI指数在术后三个时间点均显着高于PCL/HA组（P<0.05）,并且在术后第8,12周时PCL/HA-EXO组和自体神经移植组的SFI指数相似,无统计学差异（P>0.05）。术后12周PCL/HA-EXO组和自体神经移植组的腓肠肌纤维直径分别为（68.4±6.2）μm和（72.3±7.6）μm,显着高于PCL/HA组（P<0.05）,而PCL/HA-EXO组和自体神经移植组则无统计学差异（P>0.05）。结论:（1）本研究成功分离提取了新生SD大鼠雪旺细胞,纯度高,满足后续实验要求。采用超速离心法加超滤法能够成功提取雪旺细胞分泌的外泌体,经鉴定是雪旺细胞分泌的外泌体,纯度较高。（2）透明质酸水凝胶能够有效的包裹和缓释雪旺细胞分泌的外泌体,其缓释曲线与体内雪旺细胞增殖迁移及神经轴突再生的时间相似,能够更好的在体内应用。雪旺细胞分泌的外泌体能够有效的促进雪旺细胞增殖,促进雪旺细胞和神经元特异性蛋白分泌,能够较好的促进神经再生。（3）PCL/HA-EXO神经导管能够有效的促进大鼠长节段神经缺损的运动功能康复及组织学及电生理学明显改善。
王晓煜[10]（2019）在《ZF4单克隆细胞长期适应低温环境的转录组分析》文中进行了进一步梳理近年来水温作为环境科学重要研究领域,科学家关注温度对生物的环境效应越来越普遍。鱼类是典型的变温动物,其生存、生长及行为都与温度有着较为密切的关系。低温不仅影响鱼类的生命活动,例如鱼类的体型,运动,呼吸;而且也打乱了新陈代谢过程,影响神经调节。因此,研究鱼类的抗寒性能称为一大热点。本研究紧紧围绕抗寒机制这一主题,利用斑马鱼ZF4单克隆细胞系作为实验材料,研究单克隆细胞系能够避免不同细胞之间的差异性更好的反映细胞的性状及对寒冷的响应,充分揭示了个体适应寒冷环境的能力,前人对单细胞系研究较少,本实验作为一个新的亮点探索单细胞系对低温的适应性。本实验阐述了低温对细胞传代的影响,利用转录组学,初步明确斑马鱼单克隆耐低温相关的通路,阐明斑马鱼单克隆细胞的耐寒机理,具体如下:正常温度（T-28）,细胞状态良好,细胞大小均一,细胞棱角清晰,核质明显,几乎没有漂浮的死细胞;低温（T-18）,细胞略大于对照组正常温度细胞,细胞棱角不清晰,核质较暗,有死细胞存在;低温（T-13）,13℃细胞比18℃细胞大,细胞的状态明显不如18℃细胞,细胞棱角更模糊,细胞大小不一,核质不清晰,死细胞存在明显。从传代角度分析,正常细胞传代过程中,细胞完全贴壁需12小时,传代3-4天为一代。初次细胞从28℃转入18℃,细胞初次传代12小时后,细胞贴壁仅为三分之一,3-4天几乎完全贴壁,细胞稳定性变差。在细胞驯化过程中发现,细胞驯化是长期逐步适应的过程,驯化后的细胞传代过程变稳定。实验探究发现了,在18℃传代到5代以上,细胞7天传代一次,细胞24小时后几乎全部贴壁,细胞的生长状态在驯化中,逐渐稳定;细胞在18℃稳定后再传入13℃的温度下,细胞两个月（60天）左右传代一次,7天左右贴壁一半,细胞的状态不稳定,发现13℃-3代细胞继续低温培养,细胞生长更加缓慢,甚至继续传代会死亡。很明显发现,不同温度下,细胞的传代速率有显着的差别,温度越低,细胞的传代速率越低,从而导致细胞的生长速率越慢。之后我们将18℃驯化组细胞和28℃未驯化组细胞放置13℃低温处理3 d后,观察低温对驯化细胞和未驯化细胞的影响。我们发现18℃驯化细胞的形态与1813℃3 d处理组没有明显差别,并且细胞能正常生长,稳定传代,说明驯化后的细胞对低温已经产生了适应性。随后我们比较了18℃低温驯化组和28℃未驯化组的细胞形态发现,在13℃处理3 d后,驯化组细胞连接较为紧密,整体状态未发生太大变化;而28℃未驯化组细胞聚集程度非常明显,细胞状态较差,死细胞数目增多。我们对细胞的存活率,ROS含量及细胞的凋亡程度进行检测发现,18℃驯化组细胞存活率高于28℃未驯化组（p<0.05）,ROS含量显着低于28℃未驯化组（p<0.01）,凋亡程度显着低于未驯化组（p<0.01）,说明低温驯化能提高细胞的耐寒能力,在面临更低温度时,能减少ROS含量减轻细胞受损程度。差异表达基因筛选统计,G1群组中,总DEGs为3,754,上调基因1,599,下调基因2,155;G2群组中,总DEGs为3,647,上调基因2,198,下调基因1,449。GO富集分析13℃组中,生物学过程（BP）主要集中在“organic acid metabolic process”,“oxoacid metabolic process”,“carboxylic acid metabolic process”,“small molecule biosynthetic process”,“organophosphate biosynthetic process”,“small molecule catabolic process”,“cofactor metabolic process”。18℃组中,生物学过程（BP）主要集中在“DNA metabolic process”,“DNA repair”,“cellular response to DNA demage stimulus”,“cell cycle process”,“DNA replication”,“mitotic cell cycle process”,“double-strand break repair”,“DNA recombination”,“nuclear division”,“DNA-dependent DNA replication”。KEGG聚类分析发现,18℃这一组,主要集中在“Pyrimidine metabolism”,“Homologous recombination”,“DNA replication”,“Mismatch repair”,“Fanconi anemia pathway”,“Drug metabolism-other enzymes”,“P53 signaling pathway”。13℃这一组中,主要集中在“MAPk signaling pathway”,“Endocytosis”,“Adherens junction”,“AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complication”。DNA复制,细胞周期,吞噬作用,错配修复,凋亡和细胞衰老这六个通路的上调基因和下调基因的分布,18℃在细胞周期,细胞衰老,DNA复制和错配修复上调基因数量相对比13℃多,而13℃在吞噬作用和凋亡上调基因数量相对比18℃多,说明18℃细胞能适应低温的环境是因为自身的复制修复机制积极配合,13℃细胞这些机制比较弱,更多触发的是凋亡,死亡程序,也解释了细胞在13℃适应性差。综合上述总之,本研究成功建立了低温驯化细胞系,为今后抗寒机制的研究提供了实验材料,同时也为低温适应机制的进化历程追踪提供了研究基础。细胞通过长期适应低温环境,细胞逐步产生了对一定温度范围内低温适应,解释了细胞在18℃更容易生长,稳定传代。同时转录组数据结果分析修复机制与凋亡系统的相互配合,维持生长和死亡的平衡,有利于细胞在低温的存活。
二、深低温对造血细胞活力的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、深低温对造血细胞活力的影响（论文提纲范文）
（1）RAGE/sRAGE通过调控转移前微环境促进非小细胞肺癌骨转移的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 一、背景介绍 |
| 二、课题实施方案 |
| 参考文献 |
| 第一部分 非小细胞肺癌骨转移相关基因筛选 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 实验材料 |
| 第三节 实验方法 |
| 第四节 实验结果 |
| 第五节 讨论 |
| 第六节 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 RAGE/sRAGE在非小细胞肺癌骨转移及骨微环境改造中的作用 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 实验材料 |
| 第三节 实验方法 |
| 第四节 实验结果 |
| 第五节 讨论 |
| 第六节 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 sRAGE调控转移前微环境促进非小细胞肺癌骨转移的机制研究 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 实验材料 |
| 第三节 实验方法 |
| 第四节 实验结果 |
| 第五节 讨论 |
| 第六节 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 RAGE及其配体在骨代谢和骨疾病中的作用 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况 |
| 致谢 |
（2）低强度超声联合姜黄素抑制胶质瘤细胞增殖及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂、药品 |
| 2.1.2 主要实验仪器及耗材 |
| 2.1.3 研究对象 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 低强度超声、姜黄素治疗以及分组 |
| 2.2.3 western blot法检测各蛋白表达 |
| 2.2.4 CCK-8 实验检测细胞的增殖能力 |
| 2.2.5 EdU实验检测细胞的增殖能力 |
| 2.2.6 流式细胞学分析 |
| 2.2.7 吖啶橙(AO)染色 |
| 2.2.8 丹酰尸胺(MDC)染色 |
| 2.2.9 细胞内ROS的测量 |
| 2.2.10 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 LIUS和姜黄素抑制胶质瘤细胞活力 |
| 3.1.1 LIUS治疗抑制胶质瘤细胞活力 |
| 3.1.2 姜黄素治疗抑制胶质瘤细胞活力 |
| 3.1.3 LIUS联合姜黄素治疗协同抑制胶质瘤细胞活力 |
| 3.2 LIUS联合姜黄素治疗协同诱导胶质瘤细胞凋亡 |
| 3.2.1 流式细胞实验检测胶质瘤细胞凋亡 |
| 3.2.2 western blot实验检测胶质瘤细胞凋亡 |
| 3.3 LIUS联合姜黄素治疗协同诱导胶质瘤细胞自噬 |
| 3.3.1 吖啶橙(AO)染色检测自噬 |
| 3.3.2 丹酰尸胺(MDC)法检测自噬 |
| 3.3.3 自噬相关蛋白表达 |
| 3.4 自噬抑制剂和凋亡抑制剂减弱LIUS联合姜黄素诱导的抑制作用 |
| 3.5 LIUS联合姜黄素治疗协同诱导(ROS)产生 |
| 3.6 LIUS联合姜黄素调控ROS/MAPK通路以及AKT/mTOR信号通路 |
| 3.6.1 LIUS联合姜黄素激活ROS/MAPK通路 |
| 3.6.2 LIUS联合姜黄素抑制AKT/mTOR信号通路 |
| 3.6.3 NAC以及IGF-1处理逆转了LIUS联合姜黄素对细胞活力的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 自噬在肿瘤中的作用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（3）间充质干细胞深低温保藏技术体系的建立与初步分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英符号缩略词表 |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 干细胞及其应用 |
| 1.1.1 干细胞的概念 |
| 1.1.2 干细胞应用前景广阔 |
| 1.1.3 间充质干细胞的发展 |
| 1.2 ASC细胞的特性及研究进展 |
| 1.2.1 脂肪干细胞特性 |
| 1.2.2 脂肪干细胞研究进展 |
| 1.3 冻存剂的研究进展 |
| 1.3.1 二甲基亚砜 |
| 1.3.2 海藻糖 |
| 1.3.3 左旋肉碱 |
| 1.4 深低温对细胞的作用机制 |
| 1.4.1 深低温的形成 |
| 1.4.2 间充质干细胞在低温下的变化 |
| 1.5 立题意义和技术路线 |
| 1.6 技术路线图 |
| 第二章 干细胞冻存剂的选择与实验分析 |
| 2.1 实验材料与方法 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验基本方法 |
| 2.2.1 MSC分离培养 |
| 2.2.2 消化传代 |
| 2.2.3 支原体检测 |
| 2.2.4 细胞冻存 |
| 2.2.5 干细胞复苏 |
| 2.2.6 干细胞活性及增殖曲线测定 |
| 2.2.7 细胞周期测定 |
| 2.2.8 成骨诱导分化 |
| 2.2.9 统计分析方法 |
| 2.3 实验及分析流程 |
| 2.3.1 RNA提取 |
| 2.3.2 消化基因组 |
| 2.3.3 RNA-Seqs的文库构建 |
| 2.3.4 信息分析流程 |
| 第三章 实验结果与分析 |
| 3.1 结果 |
| 3.1.1 深低温冻存对干细胞生物活性的影响 |
| 3.1.1.1 冻存复苏后培养24h,检测细胞活性 |
| 3.1.1.2 冻存复苏后培养48小时,检测细胞活性 |
| 3.1.2 细胞周期分析 |
| 3.1.2.1 冻存细胞的周期数据分析 |
| 3.1.2.2 冻存细胞流式图分析 |
| 3.1.3 冻存剂对成骨细胞诱导的影响 |
| 3.1.4 间充质干细胞冻存前后表达谱分析 |
| 3.2 结论 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 冻存剂对干细胞的生物活性影响 |
| 4.2 低温冻存干细胞对细胞诱导的影响 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表 |
（4）DSF/Ara-C清除高表达ALDH的急性髓系白血病干细胞样细胞的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 第一部分 醛脱氢酶活性与急性髓系白血病患者预后关系研究 |
| 1 前言 |
| 2 研究对象和方法 |
| 2.1 研究对象与分组 |
| 2.2 主要仪器和试剂 |
| 2.3 实验方法和步骤 |
| 3 结果 |
| 3.1 AML患者和正常人的ALDH活性的比较 |
| 3.2 初发患者和复发患者的ALDH活性的比较 |
| 3.3 AML患者的ALDH活性和细胞遗传学及预后关系 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 DSF或/和Ara-c对高表达ALDH的AML干细胞样细胞的作用研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料和仪器 |
| 2.2 主要实验方法 |
| 2.3 DSF或/和Ara-c对UT7 和THP1系列细胞增殖能力影响 |
| 2.4 DSF或/和Ara-c对UT7 和THP1系列细胞凋亡的影响实验 |
| 2.5 DSF或/和Ara-c对UT7-ALDH、THP1-ALDH细胞DNA的影响实验 |
| 2.6 Western Blot |
| 3 结果 |
| 3.1 慢病毒表达载体的构建及测序鉴定 |
| 3.2 慢病毒包装 |
| 3.3 DSF或/和Ara-C对UT7-ALDH和THP1-ALDH细胞增殖的分析 |
| 3.4 DSF或/和Ara-C使用对白血病干细胞样细胞的凋亡作用 |
| 3.5 DSF或/和Ara-C抑制UT7-ALDH和THP1-ALDH细胞p65表达并增加细胞内γ-H_2AX |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 DSF或/和Ara-c对白血病小鼠模型作用研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 主要试验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 成功建立小鼠THP1-ALDH细胞移植后白血病模型 |
| 3.2 Ara-C或/和DSF对白血病小鼠治疗情况 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 白血病干细胞 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（5）粒细胞集落刺激因子和低氧诱导因子对骨代谢及骨修复影响的相关性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 G-CSF通过上调中性粒细胞一氧化氮的产生抑制小鼠成骨细胞和骨细胞生长的研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 小鼠骨质疏松性骨折模型早期骨折愈合延迟的初步实验研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 局部应用去铁胺激活低氧诱导因子通路促进卵巢切除小鼠骨折愈合 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第一部分 附图表 |
| 第二部分 附图表 |
| 第三部分 附图表 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表及准备发表的学术论文 |
| 外文论文一 |
| 外文论文二 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（6）细胞周期蛋白依赖激酶7抑制剂的抗胆管癌作用机制和联合用药研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 参考文献 |
| 第二章 CDK7抑制剂的抗胆管癌作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 THZ1抗胆管癌作用的分子机制 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 CDK7 抑制和ABT-263 协同抗胆管癌作用的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 攻读博士学位期间发表的文章 |
| 致谢 |
| 附录 |
（7）人脂肪间充质干细胞深低温保存的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分：深低温保存前hADSCs分离纯化方法的研究 |
| (一) 消化液体积与容器容积之比对酶学法获取SVF/hADSCs产量、活细胞率及生物学特性的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 2.统计分析 |
| 3.研究结果 |
| 4.讨论 |
| 小结 |
| (二) 氯化铵(NH_4Cl)裂解法分离纯化hADSCs对其生物学特性的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 2.统计分析 |
| 3.研究结果 |
| 4.讨论 |
| 小结 |
| (三) 深低温保存NH_4Cl裂解法分离纯化hADSCs的生物学特性 |
| 1.材料与方法 |
| 2.统计分析 |
| 3.研究结果 |
| 4.讨论 |
| 小结 |
| 第一部分小结 |
| 第二部分 hADSCs低温生物学参数探索:跨膜水传输与胞内冰形成的研究 |
| 1.材料与方法 |
| 2.研究结果与讨论 |
| 3.讨论 |
| 第二部分小结 |
| 第三部分 hADSCs冷冻流程的研究 |
| (一) 降温速率对hADSCs干细胞生物学特性的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 2.统计分析 |
| 3.研究结果 |
| 4.讨论 |
| 小结 |
| (二) 细胞浓度对深低温保存hADSCs的生物学特性的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 2.统计分析 |
| 3.研究结果 |
| 4.讨论 |
| 小结 |
| 第三部分小结 |
| 第四部分 纳米氧化石墨烯在脂肪干细胞深低温保存中的保护作用的研究 |
| (一) 体外实验 |
| 1.材料与方法 |
| 2.统计分析 |
| 3.研究结果 |
| (二) 体内实验 |
| 1.材料与方法 |
| 2.统计学分析 |
| 3.研究结果 |
| 4.讨论 |
| 第四部分小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 人脂肪充质干细胞的制备及低温保存研究进展 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词对照表 |
| 致谢 |
| 发表文章及学术交流 |
（8）原人参三醇抑制SCD1介导的脂质代谢在多发性骨髓瘤中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 SCD1 及脂滴在多发性骨髓瘤中的表达及其意义 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 一、主要试剂及仪器 |
| 二、实验方法 |
| 三、数据统计和分析 |
| 结果 |
| 一、SCD1 及脂滴在MM中的表达情况 |
| 二、MM细胞存活及脂质存储依赖于SCD1 的表达; |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 原人参三醇通过下调SCD1表达诱导内质网应激促进多发性骨髓瘤细胞凋亡 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 一、主要试剂及仪器 |
| 二、实验方法 |
| 三、数据统计和分析 |
| 结果 |
| 一、原人参三醇抑制MM细胞增殖,促进其凋亡,可被SCD1 产物油酸逆转 |
| 二、原人参三醇抑制MM细胞SCD1 的表达,下调细胞内脂滴含量 |
| 三、原人参三醇诱导MM细胞内质网应激凋亡 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 体内实验验证原人参三醇杀伤多发性骨髓瘤细胞的作用及机制 |
| 材料和方法 |
| 一、主要试剂及仪器 |
| 二、实验方法 |
| 三、数据统计和分析 |
| 结果 |
| 一、体内实验验证原人参三醇抗多发性骨髓瘤作用 |
| 二、体内实验证实原人参三醇抑制SCD1 表达诱导ER应激发挥抗MM作用 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 小结与展望 |
| 综述 代谢重塑在多发性骨髓瘤中的作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 附件攻读学位期间发表论文及参与课题情况 |
| 致谢 |
（9）透明质酸水凝胶缓释雪旺细胞外泌体修复坐骨神经长节段缺损的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、外泌体的分离与鉴定 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 主要材料与试剂 |
| 1.1.2 主要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂配置方法 |
| 1.1.4 实验方法 |
| 1.1.5 统计学分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 雪旺细胞的形态 |
| 1.2.2 雪旺细胞在体外的贴壁和增殖活性 |
| 1.2.3 雪旺细胞体外培养纯度鉴定 |
| 1.2.4 雪旺细胞分泌的外泌体的形态和粒径鉴定 |
| 1.2.5 雪旺细胞分泌的外泌体表面标志物的鉴定 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、外泌体的体外生物学功能及体外缓释研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 主要材料与试剂 |
| 2.1.2 主要仪器和设备 |
| 2.1.3 主要试剂配置方法 |
| 2.1.4 实验方法 |
| 2.1.5 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 透明质酸水凝胶包裹雪旺细胞外泌体及体外缓释曲线 |
| 2.2.2 雪旺细胞外泌体促进DRG组织轴突生长 |
| 2.2.3 雪旺细胞外泌体对雪旺细胞增殖的影响 |
| 2.2.4 雪旺细胞外泌体对雪旺细胞生物活性物质表达的影响 |
| 2.2.5 雪旺细胞外泌体对DRG神经元的生物活性物质表达影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、雪旺细胞外泌体促进大鼠长节段坐骨神经缺损修复 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 主要材料和试剂 |
| 3.1.2 主要仪器和设备 |
| 3.1.3 实验动物及分组 |
| 3.1.4 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 扫描电镜观察电纺PCL导管大体及微细结构 |
| 3.2.2 静电纺丝PCL神经导管的力学参数和孔隙率 |
| 3.2.3 雪旺细胞外泌体促进神经轴突再生 |
| 3.2.4 NF-200和S100 对各组再生神经的免疫荧光染色 |
| 3.2.5 三组大鼠坐骨神经电生理参数比较 |
| 3.2.6 三组大鼠坐骨神经指数比较 |
| 3.2.7 三组大鼠荧光金逆行示踪 |
| 3.2.8 三组大鼠腓肠肌HE染色分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 附录 |
| 综述 外周神经损伤修复的材料与治疗进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）ZF4单克隆细胞长期适应低温环境的转录组分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 冷应激机制 |
| 1.1.1 冷应激的研究 |
| 1.2 长期低温适应研究 |
| 1.2.1 植物方面 |
| 1.2.2 动物方面 |
| 1.3 低温与代谢 |
| 1.3.1 低温与凋亡 |
| 1.3.2 低温与DNA复制 |
| 1.3.3 低温与损伤修复 |
| 1.3.4 低温与其他代谢 |
| 1.4 高通量测序技术 |
| 1.5 本研究的内容及目标 |
| 1.5.1 目的与意义 |
| 1.5.2 实验技术 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验所用细胞系 |
| 2.2 实验主要仪器 |
| 2.3 实验试剂 |
| 2.4 实验方法与步骤 |
| 2.4.1 细胞培养 |
| 2.4.2 存活率检测 |
| 2.4.3 流式细胞仪检测ROS |
| 2.4.4 流式细胞仪检测凋亡 |
| 2.4.5 转录组数据分析 |
| 2.4.6 real-time RT-PCR对转录组数据进行验证 |
| 第三章 |
| 3.1 细胞驯化 |
| 3.1.1 细胞驯化代数统计 |
| 3.1.2 细胞驯化过程形态学观察 |
| 3.1.3 不同温度下驯化细胞比较 |
| 3.2 细胞形态学分析和存活率统计 |
| 3.3 ROS检测 |
| 3.4 凋亡检测 |
| 3.5 斑马鱼ZF4单克隆细胞转录组数据 |
| 3.5.1 对斑马鱼ZF4单克隆细胞过滤数据统计 |
| 3.5.2 不同温度下相关性 |
| 3.5.3 差异表达基因筛选 |
| 3.5.4 差异表达基因功能注释 |
| 3.6 差异基因KEGG功能分类 |
| 3.7 上调差异基因KOG分析 |
| 3.8 上调基因GO分析 |
| 3.9 上调基因KEGG分析 |
| 3.10 相关通路分析及验证 |
| 3.10.1 DNA replication pathway |
| 3.10.2 Mismatch repair pathway |
| 3.10.3 Cellular senescence |
| 3.10.4 Endocytosis |
| 3.10.5 Cell Cycle |
| 3.10.6 Apoptosis |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论及展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
四、深低温对造血细胞活力的影响（论文参考文献）
- [1]RAGE/sRAGE通过调控转移前微环境促进非小细胞肺癌骨转移的机制研究[D]. 高欣. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [2]低强度超声联合姜黄素抑制胶质瘤细胞增殖及其机制研究[D]. 史国红. 中国医科大学, 2021
- [3]间充质干细胞深低温保藏技术体系的建立与初步分析[D]. 朱志浩. 石河子大学, 2020(05)
- [4]DSF/Ara-C清除高表达ALDH的急性髓系白血病干细胞样细胞的研究[D]. 杨琬芳. 山西医科大学, 2020
- [5]粒细胞集落刺激因子和低氧诱导因子对骨代谢及骨修复影响的相关性研究[D]. 赵建. 山东大学, 2020(11)
- [6]细胞周期蛋白依赖激酶7抑制剂的抗胆管癌作用机制和联合用药研究[D]. 黄天璐. 南京大学, 2020(04)
- [7]人脂肪间充质干细胞深低温保存的研究[D]. 李梓菲. 北京协和医学院, 2020(05)
- [8]原人参三醇抑制SCD1介导的脂质代谢在多发性骨髓瘤中的作用及机制研究[D]. 王秋果. 华中科技大学, 2019(03)
- [9]透明质酸水凝胶缓释雪旺细胞外泌体修复坐骨神经长节段缺损的实验研究[D]. 王宇强. 天津医科大学, 2019(02)
- [10]ZF4单克隆细胞长期适应低温环境的转录组分析[D]. 王晓煜. 上海海洋大学, 2019(03)